（生物化学与分子生物学专业论文）hlab、hlacw基因多态性及分子进化的研究.pdf

中山大学硕士学位论文：h l a - b 、h l - c w 基田多卷性及分子进化的研究 h l a - b ，c w 基因多态性及分子进化的研究 专业：生物化学与分子生物学 硕士研究生：林文治 导师：徐安龙教授 吴玉萍教授 摘要 人类主要组织相容性抗原系统( m h c ，m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ) 即白细 胞抗原系统( h l a ，h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n ) 是人类基因组中多态性最高的区 域，其编码的糖蛋白分子在人类免疫反应中起着至关重要的作用。通过对m h c 基 因分子结构以及分子进化的研究可以获得许多该基因功能上的信息，对进一步了解 其生物学功能有主要的指导作用。 首先，本文采用“长片段p c r 扩增、克隆、测序后拼接”的策略，获得了1 7 条中国汉族个体h l a c w 全长4 5 k b 和1 5 条b 全长4 2 k 的单倍型序列，建立了全 基因盼高密度遗传多态性图谱。对该区域的群体遗传学分析发现，整个基因区域的 离多态性具有跨物种分布的特点，表明受到了平衡选择作用。系统发育分析以及连 锁不平衡分析都表明h l a b 在进化过程中发生了频繁的位点内重组。在c e r e b 等 人提出的r g d 理论( r e c o m b i n a t i o na n ds u b s e q u e n tg e n e t i cd r i f t ) 的基础上更换理论 定义对象，以及结合h o l l i d a y 重组模型，我们很好地解释了小片段重组如何解决了 平衡选择和负选择在h l a b 的进化过程中带来的冲突。三个位点的d o t p l o t 对比分 析发现在第二和第三内含子为重组热点，进一步支持了我们的观点。 对h l a 三个经典位点的多态性分析比较发现，h l a c w 作为一个相对独立的个 体在启动子的调控元件和i n t r o n4 上与h l a a 、h l a b 截然不同。首先h l a c w 的启 动子整体多态程度与h l a - a 、h l a b 差异不大，但s n p 位点集中在调控元件上，并且 存在完全不同的分布模式。其次，i n t r o n4 作为h l a a 、h l a - b 中最保守的区域之一， 中l l j 大学硕士学位论文：h l a - b 、h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 却在h l a c w 中显示高度的多态性。参考其他研究对c w * 0 7 与其他c w 等位基因 型的表达差异以及j a n e 等人对c w 转录后m r n a 稳定性的研究结果，对三个位点 在该区域的序列比较分析，我们认为i n t r o n4 通过影响m r n a 的稳定性，协同调控元 件在h l a 一类基因的表达中起到重要的作用。同时我们选取了c w 不同家系的等位 基因进行系统发育分析，结合各等位基因在人群中的分布频率，验证了v a l l e j o 所提 出的启动子决定等位基因型进化命运的观点。而i n t r o n4 具体通过什么途径影响基 因m r n a 的稳定性，需要我们更深入地研究。 关键词：h l a ，多态性，调控元件，内含子，单倍型，分子进化 n 中山大学硕士学位论文：h l a - b 、h l a - c w 基瞬多态性及分子进化的研究 p o l y m o r p h i s ma n d m o l e c u l a re v o l u t i o na n a l y s i so nh l a b a n dh l a c w m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：w e n z h il i n s u p e r v i s o r ：p r o f a n l o n gx u p r o f y u p i n gw u a b 汀r a c t t h eh u m a nm a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) ，a l s oc a l l e dt h eh u m a n l e u k o c y t ea n t i g e n 田l a ) i nh o m os p e c i e s ，i st h em o s tp o l y m o r p h i er e g i o ni nt h e w h o l eh u m a ng e n o m e t h eg l y c o p m t e i n se n c o d e db yt h eh l ac l a s sia n di ig e n e s p l a yae s s e n t i a lr o l e i nt h ei m m u n er e s p o n s e t h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea n de v o l u t i o i n a n a l y s i sp r o v i d eu sal a r g ea m o u n to f f u n c t i o n a li n f r o m m i o n ，w h i c hf u r t h e ri m p l y i n g t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f t h e s el o c i a f t e rc l o n e da n ds e q u e n c eh l a - ba n d c w , w ec a r r i e do u ta s s e m b l eb yt h eu s e o fs e q m a n , a n df i n a l l yo b m i n e d1 7h a p l o t y p e so fh l a ca n d1 5o fbf r o m2 0 c h i n e s eh a ni n d i v i d u a l st 0p o r t r a i tah i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a p p h y l o g e n i c a n a l y s i ss h o w st h ee x i s t e n c eo ft m n s s p e c i e sp o l y m o r p h i s mw h i c hi sas i g n a t u r eo f b a l a n c i n gs e l e c t i o n b o t hp h y l o g e n i ca n dl i n k a g ed i s e q u i b r i u ma n a l y s i ss h o w e dt h e e x i s t e n c eo fi n t r a g e n e t i cr e c o m b i n a t i o nw i t hh i g hf r e q u e n c yi nh l a - b b a s e do n t h er g d ( r e c o m b i n a t i o na n ds u b s e q u e n tg e n e t i cd r i t t ) t h e o r yp r o p o s e db yc e r e be t a la n dh o l l i d a yr e c o m b i n a t i o nm o d e l ，w ep r o p o s e dae x p l a n a t i o nh o wt h es m a l l s c a l er e c o m b i n a t i o ns o l v et h ec o n f l i c tb m u i g h tb yb a l a n c i n gs e l e c t i o na n dp u r l f y s e l e c t i o n d o t - p l o ta n a l y s i sf o u n do u tt h a tt h ei n t r o n2a n di n t r o n3i sh o ts p o tf u r r e c o m b i n a t i o n ，w h i c hf u r t h e rs u p p o r t e do u rf o r m e rp r o p o s e p o l y m o l p h i s ma n a l y s i so f a l lt h r e el o c is h o w sh l a c wi sq u i t ed i f f e r e n tf r o m b o t hh l a aa n dh l a - bi nr e g u l a t o r ye l e m e n t sl o c a t e di np r o m o t e ra n di n t r o n4 f i r s ta l lt h r e el o c is h o we q u a l l yp o l y m o r p h i ci nt h ew h o l ep r o m o t e rr e g i o n b u t s n p sc l u s t e ri n r e g u l a t o r y e l e m e n t si nh l a c w a l s ot h e p a r e mo fs n p s i i i 中山大学硕士学位论文：h l a - b 、l i l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 d i s t r i b u t i o ni st o t a l l yo p p o s i t ef r o mh l a aa n dh l a - b s e c o n d l yi n t m n4 ，a so n eo f t h em o s tc o n s e r v a t i v er e g i o ni nh l a - aa n dh l a - b ，i st h em o s tp o l y m o r p h i cr e g i o n i nh l a c w c o n c e r n i n gt oo t h e rs t u d i e sa b o u te x p r e s s i o nd i f f e f e n c eb e t w e e na l l e l e s o fh l a c wa n dt h ef i n d i n gb yj a n ee ta l ，w ep r o p o s ei n t r o n4p l a yai m p o r t a n tr o l e i ne x p r e s s i o nt h r o u g hc o n t r o l l i n gt h es t a b i l i t yo fm r n a a l s o ，t h i sm a yp r o b a b l y c o o p e r a t ew i t hr e g u l a t o r ye l e m e n t si np m m o t e r w ef u r t h e rc a r r i e do u tp h y l o g e n i c a n a l y s i so fd i f f e r e n tl i n e a g e so fh l a - c w , c o u p l ew i t ht h ef r e q u e n c ys t a t i s t i c ，w e t e s t e dt h ea a i m d ep r o p o s e db yv a l l e j ot h a tp r o m o t e rd e c i d et h es u r v i v a lo fa l l e l e s b u tw h a te x a c tm e c h a n i s md o e si n t r o n4u s et oc o n t r o lt h es t a b i l i t yo f m r n ai ss t i l l ap u z z l ef o ru sa n dn e e d e df u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：h l a ，p o l y m o r p h i s m ，r e g u l a t o r ye l e m e n t ，i n t r o n ，h a p l o t y p e ，m o l e c u l a r e v o i u t i o n 中山大学硕士学位论文：h l a - b 、h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 引言 二十世纪四十年代已经发现，j 、鼠近交系之问进行正常组织移植的排斥由分布 在不同染色体上的多个基因所决定。并证实这种捧斥实际上是一种免疫反应，其中将 诱导强烈而迅速排斥反应的抗原称为主要组织相容性抗原，编码这种抗原的基因群 称为主要组织相容性复合体( m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) ( 张卓然，2 0 0 2 ) 。 目前已知的脊椎动物包括鸟类、鱼、哺乳动物等都有m h c 系统，但尚未在比软骨 鱼更古老的脊椎动物中克隆到m h c 基因( l e f e b v r ee t a l l 2 0 0 1 ) 。不同的动物的m h c 在组成、结构和功能及分布上彼此相似，但命名各不相同。其中，人类的m h c 又 称为人类白细胞抗原系统( h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n 。h l a ) 。h l a 分为经典的一类、 二类和非经典的三类区域。其中经典的一类区域有包含了h l a a 、h l a b 、h l a c w 三个经典的基因和一些非经典基因与假基因。h l a - a 、h l a b 和h l a - c w 都具有 重要的免疫功能，其中h l a a 、h l a b 更是全基因组中多态性最高的位点之一。 这些特点使其自从被发现以来一直是h l a 区域研究的热点。广泛应用于基因功能 与进化，器官移植研究、法医鉴定个体识别，疾病相关性研究以及用于民族的起源、 进化、迁移、融合等人类遗传学研究。 长期以来人们根据低水平的多态性和细胞膜表达量推测h l a c w 的免疫功能有限 ( v a l l e j oa n dp l e a s e 。1 9 9 5 ) ，对h l a c w 的研究一直滞后于其余两个经典一类基因 的研究。但最近不同的研究都表明情况并非完全如此( t u r n e r e t a l , 1 9 8 8 ；l e b e d e v a t v e ta l , 2 0 0 5 ) 。而对h l a 的研究大多局限在编码抗原结合槽的外显子，更是缺乏完整 的中国人群数据。因此，本文对h l a b 、h l a c w 全长基因进行克隆分析，建立汉 族个体的s n p s 图谱。对两个基因的自身特点进行分析。另一方面，结合本实验室 过去对h l a - a 研究所做的数据分析，探讨了最近对h l a 一类基因研究的一些新观 点。 中山大学硕士学位论文：h l a b 、h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 第1 章h l a 的研究进展 1 1h l a 基因、分子结构和系统命名规则 1 1 1h l a 的基因组图谱 1 9 3 6 年，p e t e rg o f e r 在分析小鼠的血型抗原与肿瘤移植排斥的关系时发现了小 鼠的组织相容性抗原，证实了机体对自身与非自身的识别是有遗传基础的。随后的 十余年的研究里，研究人员通过不断的杂交、近交与回交先后获得了纯系小鼠与同 类系( c o n g e n i es t r a i n ) 小鼠，并将小鼠组织相容性基因定位于第1 7 号染色体上， 称其为h - 2 基因复合体。1 9 5 8 年，j e a nd a u s s e t 通过同种异体白细胞凝集实验和家 系调查，第一个发现了人类的白细胞抗原( h l a a 2 抗原) ，首次证实了人类白细胞 膜上的抗原具有型的特异性，并预言白细胞抗原系统的匹6 d 对肾移植的成功非常重 要。其预言不仅被之后的实践所证实，而且成为组织配型的基本思想。h l a - a 2 抗 原的发现奠定了移植免疫学的理论基础，开仓q 了人类免疫遗传学研究的新纪元。 h l a 覆盖6 号染色体短臂全长约4 1 0 6 a t 的区域( 6 p 2 1 1 - p 2 1 3 ) ，占人体整个 基因组的1 3 0 0 0 ，从中心粒端至端粒端依次为经典的i i 类、非经典的l i i 类和经典 的i 类。其问包含了众多在免疫系统中发挥重要功能的基因，也是基因组中基因密 度最高的区域。由于其在免疫学等多方面的重要研究价值，早在1 9 9 3 年c a m p b e l l ( c a m p b e l la n dt r o w s d a l e 1 9 9 3 ) 等人就发表了第一张人类m h c 基因图谱。国际单 倍型( h a p m a p ) 计划和s a n g e r 实验中心各自的m h c 计划的开展，以及实验技术在 近几年的长足进步，首张基于精确测序的全长图谱在1 9 9 9 年完成绘制。共发现了 2 2 4 个基因位点，其中有1 2 8 ( 5 7 ) 个是可表达的，而这当中又有约4 0 的表达基 因编码免疫相关的蛋白。至今，关于h l a 的数据依然在不断在扩充发展。 截至2 0 0 6 年止，现已发现h l a 区域有2 3 9 个基因位点存在，该区域平均1 6 k b 即有一个基因。是迄今已知的人类最复杂、基因密度最高的区域口h em h c 2 中山大学硬士学位论文：h l a - b 、e l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 s e q u e n c i n gc o n s o r t i u m 。1 9 9 9 x 1 9 9 9 ) 。图1 - l 展示了人类6 号染色体h l a 区域的基因 分布图。从染色体端粒至4 着丝点方向，依次排列着h l a i 类、h l a 1 l i 类和h l a 1 1 类区域( 图1 1 ) 。h l a 1 类区域包含3 个经典基因( h l a 1 a ：h l a - a ，h l a - b ， h l a - c w ) ，3 个非经典的h l a i 基因( h l a i b ：h l a - e ，h l a f h l a - q ) 以及其它 众多非编码蛋白基因或假基因( h l a o h ，h l a j ，h l a k ，h l a l ，h l a p ) 。这些非 经典分子多态性不如经典分子那么高，其生物学功能目前还不甚清楚。h l a 1 1 1 类 区域介于h l a i 类和h l a i i 类区域之间，在这0 9 m 区域内含有6 2 个基因座位， 其中5 8 个为可表达基因。部分基因编码的产物虽不直接参与细胞免疫，但是也通过 某种途径影响或调节免疫应答过程。包括一些类似h l a i 类和h l a 1 l 类的基因， 一些编码补体成分的基因( c 2 ，c 4 ，b f ) ，编码细胞因子的基因( t n f ，l t a ，l t b ) 和 热激蛋白( h s p ) 。其余还有很多其它与免疫及炎症反应无明显关系的基因，很多参 与了转录调控，生物合成，电子转运以及蛋白间相互作用等细胞生长过程。h l a 1 l 类区域跨越0 7 m ，包括3 4 个基因座位，其中1 6 个为可表达基因。主要为编码经典 分子( h l a - d p , - d q ，- d r ) 与非经典h l a i i 类分子( h l a - d m ，- d o ) 。d r 亚区情况 特殊，其不同单倍型基因座位数不同( s h i i n a t 甜a l , 2 0 0 4 ) 。 3 中山大学硕士学位论文；h l 卜b 、 【l a _ c - 基因多态性及分子进化的研究 图l - lh l a 基冈组图谱只列出经典的与非经典的h l a 分子世蛙1 6 塑堕璺g 煎堂盘! 竖堡型) 。 f i g u r e1 - l g e n em a po f t h eh u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n ( h l a ) r e g i o n o n l yc l a s s i ca n dn o n - c l a s s i c h l a g e n ea 把s h o w e d 啦蛰匿丛墅墅坠旦蟹堕墅璺盘曼墨塑哑) 1 1 2h l a 的分子结构 h l a i 类和h l a i i 类抗原结构和功能类似，都是细胞膜糖蛋白。均由a 和b 链各一条非共价结合而成，包含的四个功能单位：抗原肽结合区( m e m b r a n e - d i s t a l d o m a i n s ) 、i g 样区( i g f o l ds t r u c t u r e ，m e m b r a n e - p r o x i m a ld o m a i n s ) 、跨膜区 ( t r a n s - m e m b r a n es e g m e n t ) 和胞质区( c y t o p l a s m i ct a i l ) 。i i 类抗原的a 和b 链编码 基因均位于h l a 区域。而i 类抗原则由一条h l a i 基因编码的重链a 链( 4 5 k d a ) 和一条位于1 5 号染色体基因编码的轻链b2 微球蛋白( 1 2 k d a ) 通过非共价键连接 组成。其中n 链有7 个结构域，各由其基因的不同外显子编码( 图i - 2 ) 。h l a - l a 链由8 个外显予编码，第一外显子编码疏水的前导序列，指导链插入内质网膜， 并在蛋白表达于细胞表面之前被切除。外显子2 和3 编码a 链的值l 和砣胞外结构 4 中山大学硕士学位论文：b l a - b h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 域。外显子4 编码中等保守的以结构域。外显子5 编码疏水的跨膜区和带碱性锚 定残基的胞浆尾上部。外显子6 8 可以通过可变剪切编码胞内的其余部分，起到磷 酸化位点作用。 h l a 1 类分子的0 l 链在远胞膜区构成了1 个抗原结合槽，2 条旺螺旋组成槽的侧 壁，1 个p 片层构成底部( b u s c ha n d m e l l i n e s ，1 9 9 6 ) 。i i 类分子的由a 和b 链均参与 构成抗原结合槽，末端相对i 类更为开放( 图1 3 ) 。因此l 类抗原结合的多肽长度 比l l 类稍短，一般为8 - 9 个氨基酸，而l i 类则为1 0 2 5 个氨基酸( j a r d e t z k yt e t 以 1 9 9 6 ) 。 胆微球蛋白分子与正确折叠的链的组装是h l a 1 类分子膜表达的必要条件。 它们的组装形成了h l a i 类抗原二体，然后它们与合适的抗原肽结合形成n 链、b 2 微球蛋白和抗原肽聚合体，这种完整的复合物分子最终被转运至细胞表面。 1 1 3h l a 的系统命名规则 h l a 等位基因新序列经提交后，由世界卫生组织h l a 系统命名委员会统一根 据现行的系统命名规则进行命名。每一个h l a 等位基因名字分为两部分，其问用 q ”隔开。星号之前表示基因座位，后面部分通常由4 、6 或者8 个数字组成。长 度取决于与其亲缘度最近的等位基因的名字。前两位数字描述型别，通常为血清学 分型，按照被发现的顺序命名。第三和第四位表明是不同亚型，即在编码蛋白区域 至少有一个非同义突变。而同义突变则用第五和第六位来表示。如果是在5 或 3 - u t r 或者内含子存在突变，则需要用到第七第八位数字来区分。 根据基因的自身情况，有时候会在名字的数字部分后加上单大写字母的后缀表 明其表达情况。n 表示不表达的等位基因( n u l l ) ；l ( h 州) 表示相对低的细胞表面表 达；s 表示分泌型( s e c r e t e d ) 的可溶蛋白；c 则表示胞内表达( c y t o p l a s m ) ；a ，表 示异常( a b e r r a n t ) 表达但仍不确定；q 则表示该基因型的突变在先前的报道中影响 了基因的表达，因此其是否表达是很可疑的( q u e s t i o n a b l e ) 。直至2 0 0 6 年1 2 月份为 止，尚未有报道的等位基因使用了c 和a 的后缀( m a r s hs ge ta , 2 0 0 2 ； h t t p ：w w w a n t h o n ) r n o l a n o r g , u k h i g l i s t s n o m e n l i s o 。 5 中山大学硕士学位论文：h l a b ，h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 图l 也h l a i 类分子和i i 类分子及其编码基冈结构比较。 f i g u r e1 - 2c o m p a r i s o no f m o l e c u l a ra n dg e n es t n m t u r eb e t w e e nh l a ia n di i 图l - 3h l a i 类分子和i i 类分子的空间结构比较 ( 8 j o r l o n a n ，1 9 8 7 ) 。( a ) h l a i 类分子重链结构； ( b ) h l a i 类分子轻链结构；( c ) h l a i i 类分子 结构。 f i g u r ei - 3c o m p a r i s o no fd i m e n s i o n a ls t r u c h a b e t w 吲lh l aia n d1 1 ( b l o r k m a n , 1 9 8 7 ) ( a ) s t r u c t u r e o f h e a v yc h a i no f h l a - i ；( b ) s t r u c t u r eo f u g h tc h a i n o f h l a i ：( c ) s t r u c t u r eo f h l a i i 6 中山大学硬士学位论文：i l a - b ，h l - c w 基因多卷性及分子进化的研究 1 2h l a i 基因的功能和多态性 1 2 1h l a - i 基因的功能 一般情况下，h l a i a 分子主要负责呈递内源性抗原于细胞表面供t 细胞识别。 这些抗原包括细胞自身成分、病毒相关抗原，肿瘤抗原、突变的癌基因产物和突变 的抑癌基因产物。这些抗原通过蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 的分解成小肽段后，由 t a p ( t r a n s p o r t e ra s s o c i a t e dw i t ha n t i g e np r o c e s s i n g ) 运_ 输至内质网。此前钙联合蛋白 ( c a l n e x i n ) 保护新合成的h l a i 类分子的稳定，直至与胆m 结合。部分折叠的h l a 一类复合体结合t a p 复合体，加载了抗原短肽后，短肽h l a 复合体沿着高尔基体 膜运输至细胞表面( 图l - 4 a ) 。被c d g + t 细胞之t c r 识别形成免疫应答的重要步 骤t 细胞活化的第一信号。同时，t 细胞表面的c d g 协同受体对h l a i 类抗原 分子的无多态性的帕结构域识别，只有当这两部分作用同时有效时，t 细胞才能对 感染细胞或肿瘤细胞进行正确的识别及杀伤( g o l d s b ye t 以2 0 0 2 ) 。h l a 1 分子还可 作为n k 细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l s ，n kc e l l s ) 的受体，以阻止n k 细胞介导的细胞 裂解，而不能正常表达h l a - 1 分子的感染细胞则会通过自然杀伤作用特异杀死 ( y o k o y a m a ，1 9 9 5 ) 在某些情况下，外源抗原通过内吞途径进入细胞但流失在胞浆内，连同被二次 运输出内质网的蛋白被蛋白酶体分解，进入h l a - i 类限制性的抗原呈递途径( 图 1 4 b 。 7 中山大学硕士学位论文：h l a - b ，h l a - c w 基冈多态性及分子进化的研究 图1 4h l a i 限制性抗原争递途径。( a ) 内源性抗原的h l a i 限制性呈递途径；( b ) 外源性 抗原的h l a i 限制性晕递途径( a n d e r s e nm h “a , 2 0 0 6 ) 。 f i g u r e1 - 4 h l ac l a s sia n t i g e np r e s e n t a t i o np a t h w a y s ( a ) h l a ir e s t r i c t e dp r e s e n t a t i o nm e c h a n i s m o f e n d o g e n o u sa n t i g e n s ；( b ) h l a - ir e s t r i c t e dp r e s e n t a t i o nm e c h a n i s mo f e x o g e n o u s 锄t i g c ( a n d e r s e n m he t a , 2 0 0 6 ) 1 2 2h l a 基因的多态性 整个6 号染色体的基因密度并不高( c h r o6 ：4 2 2 ；c h r o7 ：4 6 5 ；c h r o1 4 ： 4 3 6 ；c h i n2 0 ：4 2 4 ；c h r o2 2 ：5 1 ) ，但h l a 却是人类基因组中基因密度最高 的区域( m u n g a l la j e ta , 2 0 0 3 ) 。单核苷酸多态性水平上，h l a 区域5 - 1 7 ，远远高 于人类基因组水平( o 0 8 一0 2 ) 。狭义上的多态性( p o l y m o r p h i s m ) 是将指一基因 变体在 群 体中 频率超过 l 的情形 蜓蛙丛些墅坦目幽堑堡蝤些堂望鳖鲤刨匦些壤嗳驾型里里基自塑! ) 。h l a 的6 个经典 分子均拥有大量的复等位基因，其中以一类基因为甚。目前h l a - a 位点有等位基 因 5 0 6个；h l a b有8 5 1个；h l a - c有 2 7 6 个( 表 1 - 1 ) ( 蝤匹丛! ! 旦蹩g 蝤基建墅咝鱼堕壁垒墅些! ) 。随着研究的深入，其数目还在增长( 图 l - 5 ) 。h l a 基因多态性主要集中在h l a 1 分子编码口l 、砣结构域的第2 ，第3 外 显子及h l a 1 1 分子编码b 2 结构域的第2 外显子上。这些结构域构成不同的抗原结 8 中山大学硕士学位论文：b l ab 、i k d t - c w 基因多态性及分子进化的研究 合槽以识别多种抗原，这也暗示了其多态性和功能强烈相关。迸一步研究发现，多 肽结合位点( p e p t i d eb i n d i n g r e g i o n ，p b r ) 的多态性高于非抗原结合部位，肽结合区 的非同义突变率明显高于同义突变率。由于同义突变不改变氨基酸序列不受自然选 择影响而非同义突变改变了氨基酸序歹i j 而导致有害突变的发生，所以在大多数基因 中，往往是同义突变率高于非同义突变率( h u g h e sa n dy e a g e r , 1 9 9 8 ) 。另外，在一些 基因的调控区域也发现有很强的多态性。这可能与其基因表达特性有关。 1 2 3h l a 多态位点的检测方法 对h l a 的研究往往脱离不了对其复等位基因的检溅。6 0 年代建立的并不断完 善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析h l a 产物特异性；随着8 0 年代p c r 技术的出现，针对h l a 基因本身的分型方法开始成为主流。近年来随着分子生物 学和生物检测技术的迅猛发展，出现了许多新的h l a 分型方法。目前h l a 的d n a 水平分型方法有：限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o p h i s m ， p c r - r f l p ) ( m a e d ae la , 1 9 8 9 ) ：序列特异性寡核苷酸探针( s e q u e n c es p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s ，p c r - s s o p l 一种以核酸杂交为基础自q 分型技术，又可细分为 正相杂交和反相杂交( i v i n s o n ，1 9 9 1 ) ： 序列特异性引物( s e q u e n c es p e c i f i c # m e s ， p c r - s s p ) 3 7 称扩增阻滞突变系统( a m p l i f i c a t i o nr e f r a c t o r ym u t a t i o ns y s t e m ，a r m s ) 是针对临床急诊和器官移植而发展起来的一种h l a 基因快速分型技术，由于方便 快捷，迅速商业化并于国内临床广泛应用( b u n e ee la t , 1 9 9 9 ) 。同时发展了以电泳为 基础的分型方法：即不同构像d n a 经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为迁移率的 不同，通过比较电泳的异同来区分型剐。其包括：p c r 指纹图( f i n g e r p r i n t i n g ) 又称为 杂合双链分析( h e t e r o d u p l e x e sa n a l y s i s x m a r t i n e l l ie ta l ，1 9 9 6 ) ，参照链构象( r e f e r e n c e s t r a n dc o n f o r m a t i o n a la n a l y s i s ，r s c a ) ( a r g u e l l oa n dm a d r i g a l 。1 9 9 9 ) 和单链构象多态 性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，p c r - s s c p ) ( p a r ke ta t , 1 9 9 9 ) 9 0 年 代以后，由于d n a 自动测序技术的普及，发展了基于d n a 序列分析的分型技术 ( s e q u e n c e b a s e dt y p i n g ，s b t ) 由于该方法直接对h l a 基因进行序列测定，因而是 9 中山大学硕士学位论文：h l a - b ，h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 最直观而准确的，可达到最高的分辨率( 刘泽寰等，2 0 0 1 ) 。9 0 年代末，应用于基因 表达研究的基因芯片技术也开始运用于h l a a ，h l a b 的分型工作，使得大量的分 型工作得以高通量的进行( f a l u se t a l , 1 9 9 8 ) 。无疑d n a 芯片是最理想的分型技术， 但是该项技术还不够成熟，例如由于杂交条件对不同g c 含量的d n a 是完全不同 的，难以找到一种普遍性的杂交条件。 图l - 51 9 6 8 - 2 0 0 6 发现的h l a 抗原及等位基因数目增长情况世蛙岫鲴些型蚀q 鱼堡g 垂磐 蔓型) 。 f i g u r ei - 5i n c r e a s i n gn u m b e ro fh l aa n t i g e nd i s c o v e r e df r o m1 9 6 8 - 2 0 0 6 垂驾型氇竖璺垡堕些鲤 g 畦墅盟畦丛! e 笼) 中山大学硕士学位论文：i l a - b 、h l “基因多态性及分子进化的研究 表i - 1h l a 的等位基因咆蛙丛竖塑蝤篓些；= 鱼氅吐鱼擅查女自世l t a b l e l - 1t h en u m b e r o f h l aa l i e l e s i 墅晦蔓7 煎逝墼畦，_ 咖凄尘堕堕蹩塾蛳! i 1 3h l a 当前主要研究领域 1 3 1 h l a 基因的免疫功能 h l a - i 类基因限制的抗原呈递，主要将内源性的抗原呈递给c d 8 + t 细胞，如 自然杀伤细胞( n a t u r a lk i l l e rc e l l ，n k 细胞) 、细胞毒淋巴细胞( c y t o - t o x i ct l y r e p h o c y t e ，c t l ) 等( 图1 - 6 ) ( h o f m a n ne ta , 2 0 0 1 ) 。但是各个基因位点的产物功 能又是不尽相同的。例如h l a c w 的研究发现其作为n k 细胞免疫球蛋白样受体 ( k i r ) 的配体在免疫调节中发挥作用。并且与抑制型的k i r 结合能力强于激活型， 抑制n k 细胞对正常组织细胞的杀伤功能而识别“自我”。h l a - g 分子对母胎耐受 状态的形成和维持具有主要作用。它在滋养层特异性的高表达，阻止n k 细胞的溶 解作用。另一个非经典的e 也被发现可能在抗原呈递、母胎免疫、病毒感染和肿瘤 耐受中行使一定的功能。即便是同一位点，不同的基因型的免疫功能强度也有细微 的差别。这在临床医学上有大量的例子。 中山大学硕士学位论文；h l a b 、h l a - c w 基因多态性及分子进化的研究 图l - 6 细胞毒淋巴细胞的激活途径( h o f m a n ne t a t , 2 0 0 1 ) 。 f i g u r e1 - 6 a c t i v a t i o no f c y t o t o x i ctl y m p h o c y t e ( h o f m a n nc t 以2 0 0 1 ) 1 3 2h l a 的表达调控 h l a 一类分子遍在表达于所有有核细胞，而二类分子仅由抗原呈递细胞( a p c ) 表达。与功能差别相类似，h l a 一类分子的表达也存在着位点间和位点内族系间的 差别。一般认为，转录速率是h l a 分子表达调控的主要环节。通过其转录起始点上 游调节区u r r ( u p s t r e a mr e g u l a t o r yr e g i o n ) 的顺式作用组件和反式作用因子的相互 作用来实现。近年来对h l a 基因的转录调控研究主要集中于转录起始点至上游 z s 0 b p 区域内。 除了一般的t a t a - b o x 和c a t - b o x 外，一类基因的调节序列还存在有：e l l l l a ( e n h a n c e r - a ) 、i s r e ( i n t e r f e r o ns t i m u l a t e dr e s p o n de l e m e n t ) 、s i t eo 、e n h - b ( e n h a n c e r - b ) 。此外还能找到与二类w s 和x l 的同源序列( 图i - 7 ) 。e n h - a 结合 r e l 家族的转录因子，由两个n f - 出b i n d i n gs i t e s ( r , b la n dr b 2 ) 组成，在h l a 一类的 中山大学硕士学位论文：h l a - b 、i l a o 基田多态性及分子进化的研究 组成型和细胞因子诱导表达中发挥重要作用。l s r e 负责对i f n 产生应答。游调控 区还存在一系列保守的d n a 序列( l eb o u t e i l ) c r , i 9 9 4 ) 。这些基序都是与核蛋白相互 作用的部位，它们在各个基因上的空f 引非列位置也是十分保守盼。 n f - k bi r f - ir f xa t f i c r e b n f - y 戮嚣帅 占上土l 二艮 鬈e 绉磁溺 w s 斟协取t a t a 图1 7 h l a - l 特异的转录调控机制“d e n e t s e ne t a l1 9 9 5 ) f i g u r ei - 7t r a n s c r i p t i o n a lc o n t r o lo f h l a - i ( v a nd e ne l s e ne tn t 1 9 9 8 ) 1 3 3i - i l a 与临床医学 自1 9 5 9 年被发现至今，h l a 一直是医学界最活跃的研究领域之一。在过去3 0 年的研究中，有超过2 0 ，0 0 0 份相关文章发表。其中大部分是关于自身免疫疾病和 传染病的研究。随着研究的不断深入，h l a 还涉及许多临床其他方面的领域，