（蔬菜学专业论文）无选择标记基因的抗虫转基因植物研究.pdf

摘要 无选择标记基因的抗虫转基因植物研究 硕士研究生：王东双 指导教师：李成琼副研究员 宋洪元副教授 摘要 目前，几乎所有的植物遗传转化都要使用选择标记基因，诸如抗生素或除草剂抗性基因 等来筛选转化子，虽然仍无直接研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全，但近 年来人们对转基因产品安全性的担心却与日俱增。为了消除转基因食品的安全性顾虑无选 择标记转基因植物应运而生。结球甘蓝在我国蔬菜周年供应中占有重要地位。菜青虫、小菜 蛾等害虫是甘蓝生产的主要障碍之一，常造成甘蓝的大幅度减产或品质下降。但迄今为止， 通过常规育种方法选育抗虫的蔬菜新品种尚未取得重大进展，鉴于基因工程在农作物品种改 良方面取得的巨大成功，通过转基因途径向甘蓝等蔬菜导入抗虫基因成为大家关注的焦点。 大豆k u n i t z 蛋白酶抑制剂( s k t i ) 是一种主要存在于大豆种子中的蛋白酶抑制剂。通常认为 这种蛋白酶抑制剂的生理功能是作为储藏蛋白，调节内源蛋白酶的活性，以及保护种子不受 昆虫和病原菌的侵害等，是一种天然的抗虫物质。更为重要的是，现己证实蛋白酶抑制剂转 入食用作物中，对人畜没有副作用。因此，将该蛋白酶抑制剂作为抗虫目的基因并结合无选 择标记转基因技术获得的抗虫转基因甘蓝将有利于消费者的接受。 本研究采用目前在植物抗虫基因二i ：= 程中r 泛使用的大豆胰蛋白酶抑制剂( s k t i ) 基因为 抗虫目标基因，除草剂基因b a r 基因作为筛选标记基因，为了便于b a r 基因的剔除，在构建连 锁表达载体的同时，将b a r 基因表达盒置于两个同向l o x 位点间。将含c r e 基因的植物表达载 体p l u s c r e ，对得到的抗虫植株进行二次转化，将重组酶基因c r e 引入；或单独转化烟草、甘 蓝，在开花时通过有性杂交的手段将重组酶基因引入而实现b a r 基因剔除的目的。存在于植株 中的c r e 基因及相应的筛选标记可通过花期自交分离的方法去除，最终获得仅含抗虫目的基因 的转基因植株。主要研究结果包括以下几个方面： 1 甘蓝高频再生一转化体系的建立 甘蓝( 铁头金刚) 种子在无菌操作台内播种于i 2 m s 固体培养基中发芽，以发芽6 7 d ( 依具体发芽情况而定) 的下胚轴为外植体，m s 为基本培养基，附加不同浓度的n a a ( o i - 0 2 m g l ) 与b a ( 1 o 3 0 m g l ) 的激素组合，筛选芽分化的摄佳培养基。结果表明： 西南大学硕士学位论文 下胚轴芽诱导的最佳培养基为m s + 3 0m g lb a + 0 1m g ln a a ，所形成的甘蓝不定芽在m s 基本培养基或m s 附加不同浓度n a a 上均能生根，在m s + 0 1 m g l n a a 的培养基中，生根较 快，6 - 7 d 后即分化出不定根。 为了测定夕 植体对 那霉素( k a n a m y c i n ，k a n ，) 的敏感性。在筛选出的最佳诱导培养基 中附加不同浓度的k a n ( 0 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、3 0 m g f l ) ，对下胚轴外植体进行培养。结果5 m g l k a n 即可有效抑制甘蓝下胚轴芽分化，此浓度用作筛选标记基因( n p t j i ) 甘蓝抗性芽的筛选 浓度。 测定外植体对草丁膦( p h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) 的敏感性，在筛选出的最佳诱导培养基中 加入不同浓度的p p t ( 0 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0m 肌) ，对下胚轴外植体进行培养，结 果2 ，5 m g l p p t 即可有效抑制甘蓝下胚轴芽分化，此浓度用作筛选标记基因( b a r ) 甘蓝抗性 芽分化的筛选浓度。 2 s k t i 基因的克隆、序列分析及表达载体构建 提取大豆基因组总d n a , p c r 扩增目的片段。回收p c r 产物，克隆于p b l u e s c r i p t s k ( p s k ) 载体后测序。测序结果表明所得s k t i 克隆片段为6 6 0 b p ，编码2 1 7 个氨基酸。与s a n g l ks o n g 报道的s k t i - - a 序列进行比较，核苷酸同源性为9 9 8 ，氨基酸序列同源性为1 0 0 。获得的 s k t i 基因经一系列中间克隆、连接后得到表达载体p c a b a r s k t i ，表达载体经p c r 、酶切鉴 定验证正确无误后导入农杆菌e h a l 0 5 ，用于遗传转化。 3 重组删除系统在烟草中的功能验证 ( 1 ) 抗虫基因s k t i 转化烟草 采用农杆菌介导的时盎转化法将s k t i 抗虫基因、b a r 基因连锁表达载体p c a b a r s k t i 导 入烟草中，获得了抗虫转基因烟草，对转化植株目的基因( s k t i 基因) 和筛选标记基因( b a r 基因) 进行了p c r 检测，电泳结果显示，转基因植株均出现预期的目标条带：6 6 0 b p 左右的 s k t i 片段，6 0 0 b p 左右的b a r 基因片段；而非转化植株都呈阴性，证明外源基因已整合到烟 草植株的基因组中。 ( 2 ) 无选择标记基因( b a r ) 的抗虫转基因烟草获得及检测 通过二次转化法将重组酶基因( e r e ) 导入上述已获得的抗虫转基因烟草。将位于2 个同 向l o x 位点间的b a r 基因剔除，并对其进行p p t 抗性检测，将所得烟草叶片切成小块在p p t 1 0 m g l 培养基上发芽，发现只有少数叶片可继续再生出绿色的愈伤组织或抗性芽，大多数叶片 逐渐桔黄，不能产生愈伤组织或抗性芽，不再具备p p t 抗性。取抗除草剂检测中自化的烟草单 株，禽b a r 基因的质粒作为阳性对照，抗虫转基因烟草作为阴性对照，进行b a r 基因的p c r 扩增，结果只有一个单株出现b a r 基因扩增片段，其余单株均未出现相应的b a r 基因条带。证 明部分转基因烟草中b a r 基因已经成功剔除，得到了无选择标记基因的抗虫转基因烟草。 4 重组删除系统在片蓝中的应用 摘要 ( 1 ) 抗虫基因s k t i 转化甘蓝 采用农杆菌介导法将s k t i 基因导八甘蓝中，获得了抗虫转基因甘蓝，对转化植株目的基 因( s k t i 基因) 和筛选标记基因( b a r 基因) 进行了p c r 检测，说明外源基因已貉合到甘蓝 植株的基因组中。 ( 2 ) 抗虫转基因甘蓝( s k t l ) 靛抗除草剂检测 对上述3 ( i ) 抗虫转基因甘蓝进行离体p p t ( 2 0 m g l ) 抗性检测，观察叶片变化情况。 7 d 后，结果显示，非转基因植株叶片逐渐枯黄、白化，而转基因甘蓝的叶片则仍然保持原有 的绿色，对p p t 具有一定抗性，说明筛选标记基因b a r 基因己成功导入甘蓝基因组中。 ( 3 ) 抗虫转基因甘蓝( s k t i ) 的抗虫试验 进一步对转基因植株进行了离体抗虫检测，观察并记录幼虫生长、叶片受害情况，结果表 明，与非转化抗虫基因的甘蓝( 对照) 相比，转基因植株叶片受损程度明显低于对照，对菜 青虫具有一定抗性，部分菜青虫致死，部分菜青虫生长发育受阻、延迟羽化时间。 5 重组酶( c r c ) 转基因甘蓝的获得 采用农杆菌介导法将重组酶( c r e ) 基因表达载体p l u s - c m 导入甘蓝，甘蓝下胚轴和子叶 在分化培养基中预培养2 d 根癌农杆菌( 含表达载体p l u s c r e ) 侵染6 g m i n 后黑暗条件下 共培养2 d ，再进行抑菌培养6 d ，转入卡那霉素筛选培养基( m s + 3 m g lb a + 0 ，l m g l n a a + 5 m g lk a n + 2 5 0 m g lc b ) 中培养。经过连续几次筛选后，逐步淘汰“假转化体”，获得 转基因甘蓝。对转化甘蓝目的基因( c r e 基因) 进行了p c r 检测，证明外源基因已整合到甘 蓝植株的基因组中。 关键词：抗虫基因无选择标记基因甘蓝c r e l o x 定位重组系统 l s t u d i e so nm a r k e r f r e e t a n s g e n i cp l a n t o fi n s e c tr e s i s t a n c e c a n d i d a t e ：w a n gd o n g s h u a n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s e rl ic h e n g q i o n g a s s o c i a t ep r o f e s s e rs o n gh o n g y u a n ( c h o n g q i n gk e yl a b o r a t o r yo f o l e r i c u t t u r e ，c o l l e g eo f h o r t i r i c u l t u r ea n dl a n d s c a p e ， s o u t h w e s tu n i v e r s i t y c h o n g q i n g4 0 0 7 1 6 ) a b s t r a c t i np r e s e n t ，a l lt h et r a n s g e n i cp l a n t sa r ea l m o s tu s et h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e ss u c ha sa n t i b i o t i c a n dh e r b i c i d er e s i s t a n c et os e l e c tt r a n s p l a n t s r e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r ep e o p l ew o r r ya b o u tt h e s a f e t yo ft r a n s g e n i cp r o d u c t a l t h o u g ht h e r ei sn or e p o r ts h o w st h a ts e l e c t a b l em a r k e rg e n e sc a n a f f e c tt h eh u m a nh e a l t ha n dt h ee n v i r o n m e n ts e c u r i t y m a r k e r - f r e ei sar a p i d l yd e v e l o p e dm e t h o d w h i c hc a ne l i m i n a t et h es a f e t yc o n c e r no f t r a n s g e n i cf o o d s o y b e a nk u n i t zt r y p s i ni n h i b i t o r ( s k t i ) m a i n l ye x s i t e di ns o y b e a ns e e dw h a ti so n ek i n do fp r o t e i n a s ei n h i b i t o r ( p i ) i tw a sg e n e r a l l y p r o p o s e dt h a tt h et r y p s i ni n h i b i t o ma r es t o r a g ep r o t e i n s ，r e g u l a t o r so fe n d o g e n o u sp r o t e i n a s e s ，o r p r o t e c t o r so fp l a n t sa g a i n s ti n s e c t sa n dp a t h o g e n s s k t ii st h en a t u r a ls u b s t a n c eo fi n s e c t r e s i s t a n c e i tp l a y sai m p o r t a n tr o l ef o rb r a s s i c ao l e r a c e av a r c a p i t a t al i no u rs u p p l yo f v e g e t a b l e s a n n i v e r s a r y t h ei n s e c ts u c ha sc a b b a g ew o r m 、c a b b a g em o t hi so n eo ft h em a i no b s t a c l ef o r c a b b a g ep r o d u c t i o n ，o f t e nr e s u l t i n gi nas u b s t a n t i a lr e d u c t i o no rc a b b a g eq u a l i t yd e c l i n e s of a r , h o w e v e r , i th a v en o ty e tm a d es i g n i f i c a n tp r o g r e s st oo b t a i nn e wv e g e t a b l eb r e e dw i t hi n s e c t r e s i s t a n c et h r o u g hc o n v e n t i o n a lm e t h o d so fb r e e d i n g , i nt h el i g h to fg e n e t i ce n g i n e e r i n gi nc r o p v a r i e t i e sa c h i e v e dt r e m e n d o u ss u c c e s st h r o u g hg e n e f i c a l l yt oc a b b a g ea n do t h e rv e g e t a b l e st o g e t i n s e c tr e s i s t e n tg e n ei n t os h a r pf o c u s m o r ei m p o r t a n t l y , i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a tp r o t e i n a s e i n h i b i t o r si nf o o dc r o p st ot h ea n i m a l sw i t h o u ts i d ee f f e c t s t h u s ，i tw i l lb ec o n d u c i v et oc o n s u m e r a c c e p t a n c et h a tt o o kt h ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r sa s ai n s e c tr e s i s t e n tt a r g e tc o m b i n a t i o no fm a r k e r - f r e e t r a n s g e u i ct e c h n o l o g yt oo b t a i ni n s e c tr e s i s t e n tc a b b a g e t h i ss t u d yi n v o l v e dt h es o y b e a nk u n i t zt r y p s i ni n h i b i t o r ( s k t i ) g e n ea st a r g e t sw h i c h w i d e s p r e a du s e di nt h ep l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gi nt h ec u r r e n t t of a c i l i t a t et h eb a rg e n er e m o v e d ，a e x p r e s s i o nv e c t o rw h i c hc o n t m n e dt h es k t ig e n ea n db a rg e n ew a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h i sv e c t o r w i t hac h a r a c t e rt h a tt h eb a rg e n ee x p r e s s i o nb o xw a si n s e r t e di n t ot h es p a c eb e t w e e nt h et w ol o x s i t e s t h e nt h et h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp l u s - e r ew i t hr e c o m b i n a t i o ne n z y m eg e n e ( c r e ) w a s v 西南大学硕士学位论文 r e t r a n s f o r m e dt ot h ei n s e c tr e s i s t e n tt r a n s g e n i cp l a n t ，o rt h et w oe x p r e s s i o nv e c t o rt r a n s f o r m e dt o t o b a c c oa n dc a b b a g er e s p e c t i v e l y w h e nf l o w e d n g ，t h r o u g hs e x u a lh y h f d em e a n si n t r o d u c e dt h er e c o m b i n a t i o ne n z y m eg e n e sc r e t oe x c i s et h eb a rg e n e c r eg e n ee x i s l e di nt h ep l a n ta n dt h ec o r r e s p o n d i n gs e l e c l i o nm a r k e r sm a yb e s e p a r a t e da n dr e m o v e db ys e l f - c r o s s ，t h e no b t a i n e dt h et r a n s g e n i cp l a n to n l yc o n t a i nt h et a r g e tg e n e m a j o rr e s e a r c he f f o r t si n c l u d et h ef o l l o w i n g ： 1 e s t a b l i s h m e n to f r e g e n e r a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m si nc a b b a g e c a b b a g e ( t i e t o uk i n g k o n g ) s e e d sw e r eg e r m i n a t e di n1 2m u r a s h i g ea n ds k o o g ( m s ) s o l i d m e d i u m h y p o c o t y lo f6 - 7 d a y so l ds e e d l i n g sw e r ec h o s e n e x p l a n t sa n dc u l t u r e do nm sb a s a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n so fn a a ( 0 1 0 2 r a g l ) a n db a ( 1 0 - 5 0 r a g & ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s tf r e q u e n c yo fs h o o t r e g e n e r a t i o nw a so b t a i n e df r o mm s + 0 i m g ln a a + 3 0 m g lb a t h ep l a n t l e t sw e r et r a n s f e r r e d i n t om sb a s a lm e d i ao rm sm o d i f i e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f n a at oi n d u c er o o t s s h o o t s c o u l dr o o ti nm sm e d i u mw i t ho rw i t h o u tn a a ，h o w e v e r , y o u n gp l a n t sf o r m e dt o o t se a r l i e ri nm s s u p p l e m e n t e dw i t h0 1 m g ln a at h a no t h e rm e d i u m s ，a n df o r m e dr o o t si n6 7 d a y s i no r d e rt ot e s tt h es e n s i t i v i t yo fe x p l a n t so nk a n a m y c i n ( k a n ) ，h y p o c o t y ls e g m e n t sw e r e c u l t u r e do nt h eb u di n d u c t i o nm e d i u mc o n t a i n i n go - 3 0 m g lk a r l t h er e s u l t ss h o w e dt h a t5 m g l k a n w a sa na p p r o p r i a t es e l e c t i v ec o n c e n t r a t i o no ft h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ( n p t i i ) f o r t r a n s f o r m i n gt h i sv a r i e t yc a b b a g e i no r d e rt ot e s tt h es e n s i t i v i t yo fe x p l a n t so np h o s p h i n o t h r i e i n ( p p t ) ，h y p o c o t y lw e r ec u l t u r e do n t h eb u di n d u c t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g0 - 3 0 m g lp p t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t2 ，s m g lp p t w a sa n a p p r o p r i a t es e l e c t i v ec o n c e n t r a t i o no ft h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ( b a r lf o rt r a n s f o r m i n gt h i s v a r i e t yc a b b a g e 2 ，c l o n i n ga n ds e q u e n c i n ga n a l y s i so f s k t ig e n ea n dc o n s r t u c t i o no f t h ee x p r e s s i o nv e c t o r t o t a ld n aw a si s o l a t e df r o ms o y b e a n t h es k t ig e n ew a sa m p l i f i e db yp c r ，t h ep c rp r o d u c t s w e r ep u r i f i e da n di n s e r t e di n t ot h ev e c t o rp b l u e s c r i p t s k ( p s k ) t h es e q u e n c i n go ft h es i n g l e r e c o m b i n a t i o nb a c t e r i u mc o n t a i n e dt h ei n s e r ts k t ig e n ef r a g m e n t t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es k t i g e n ef r a g m e n th a s6 6 0 b p ，e n c o d i n g2 1 7a m i n oa c i d s ，t h en u c l e o t i d ea e i dh o m o l o g yw a s9 9 8 ，t h e a m i n oa c i dh o m o l o g yw a s1 0 0 c o m p a r i n gt ot h es e q u e n c eo fs k t i ar e p o r t e d b ys a n g i k s o n gi n l 9 9 3 t h es k t ig e n ew a sc l o n e dt og e tt h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c a b a r s k t ib yas e r i e so f m i d d l e c l o na n dl i g a t i o n t h ep c ra m p l i f i c a t i o na n de n z y m ed i g e s ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e e x p r e s s i o nv e c t o rc o n t a i n e dt h ee x p e c t e df r a g m e n t t h e nt r a n s f e r r e di ti n t oa g r o b a c t e r i u me h a l 0 5 b yf r e e z e t h a wm e t h o da n du e s di ng e n i et r a n s f o r m a t i o n v ( 1 ) s k t ii n s e c tr e s i s t e n tg e n et r a n s f o r m e dt o b a c c o t h et o b a c c oe x p l a n t sw e r ei n f e c t e dw i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i ne h a l 0 5 h a r b o r i n g ap l a s m i dv e c t o rp c a b a r s k t lw i t hs k t ig e n e ，t og e tt h es k t ii n s e c tr e s i s t e n tg e n et r a n s g e n i c t o b a c c o t h et a r g e tg e n es k t ia n dt h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e ( b a r ) w e r ea m p l i f i e db yp c r t h e e x p e c t e da m p l i f i e dp r o d u c ta p p e a r e d ：s k t is e g m e n t sa r o u n d6 6 0 b pa n db a rg e n es e g m e n 拓a r o u n d 6 0 0 b p ；a n dt h en m l t r a n s g e n i cp l a n tw a sn ob a n d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h eg e n e sw e r et r a n s f e r r e d i n t oc a b b a g es u c c e s s f u l l y ( 2 ) g o tt h em a r k e r - f l e ei n s e c tr e s i s t e n tt r a n s g e n i et o b a c c oa n di t st e s t i n g i no r d e rt or e m o v e dt h eb a rg e n ew h i c hb e t w e e nt h et w os i t e so fl o xt h a tt h er e c o m b i n a t i o n g e n e ( c r e ) w a si n t r o d u c e di n t oi n s e c tr e s i s t e n tt r a n s g e n i ct o b a c c ob yr e t r a n s f o r m a t i o n t h e nap p t r e s i s t a n c ew a st e s t e dt ot h et r s n f o r m a t i n np l a n t d e r i v e dt h er e t r a n s f o r m e dt o b a c c ol e a v e si n t os m a l l p i e c e sa n dp l a c e do nt h em e d i u mc o n t a i n e dp p t 1 0m g ，l 7d a y sl a t e r , f o u n dt h e r ew e r ef e wl e a v e s f r o ms o m er e t r a n s f o r m e dt o b a c c om a yc o n t i n u et or e g e n e r a t e ；t h em a j o r i t yo ft h el e a v e sg r a d u a l l y t u r n e dy e l l o w , a n df i n a l l yt u r n e dw h t e c o u l dn o tr e g e n e r a t e t h er e s u l t ss h o w e da l lt h e s e p l a n t sl o s t t h ep p tr e s i s t a n c ea b i l i t y t h ep l a n t st h a tl o s tt h ep p tr e s i s t a n c ea b i l i t yw e r ec h o s e nf o rf u r t h e r a n a l y s i s ap c r o f b a rg e n ew a sa m p l i f i e dw i t hap o s i t i v ec o n t r o lo f p l a s m i do f b a ra n dac o n t r a s t o fn o n - r e t r a n s f o r m e di n s e c tr e s i s t e n tt o b a c c o a sar e s u l t , o n ep l a n tc o n t a i n e dt h eb a rg e n es t i l l ，a n d n o n eo f t b eo t h e r s ，w h i c hw a sc o n f o r m e dw i t ht h er e s u l to f t h ep p tr e s i s t e n tt e s t a l lt h e s es h o w e dt h a t b a rg e n eh a db e e ns u c c e s s f u l l yr e m o v e df r o mm o s ti n s e c tr e s i s t e n tt r a n s g e n i ct o b a c c o s 4 a p p l i c a t i o no f t h er e c o m b i n a t i o ne x c i s i o ns y s t e mi nc a b b a g e ( 1 ) s k t ii n s e c tr e s i s t e n tg e n et r a n s f o r m e dc a b b a g e t h ec a b b a g ee x p l a n t sw e r ei n f e c t e dw i t hd g r o b a c t e r i u mt w n e f a c i e n ss t r a i ne h a l 0 5h a r b o r i n g ap l a s m i dv e c t o rp c a b a r s k t lw i t hs k t ig e n e ，f i n a l l yt h es k t ii n s e c tr e s i s t e n tg e n et r a n s g e n i c c a b b a g ew a sg o t t e s t e dt h et a r g e tg e n es k t ia n dt h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e ( b a r ) b yp c r ，a l l a n a l y s i ss h o w e dt h a tm o s to f t h et r a n s g e n i cp l a n t sh a v et h ee x p e c t e db a n d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h e g e n e sw e r et r a n s f e r r e di n t oc a b b a g es u c c e s s f u l l y ( 2 ) d e t e c t i o no f i n s e c tr e s i s i t a n c e ( s k t i ) t r a n s g e i cc a b b a g e t o o ka v i t r o l e a f t e s t i n g o f s k t i t r a n s g e n i cc a b b a g e f o r h e r b i c i d e ( p p t 2 0 m g l ) r e s i s t a n c e t o o b s e r v et h ec h a n g eo fl e a v e s s e v e nd a y sl a t e r , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn o n - t r a n s g e n i cp l a n tl e a v e s g r a d u a l l yt u r ny e l l o w , a n dt h e nt u r nw h i t e ；w h i l et h et r a n s g e n i cp l a n tr e m a i n e do r i g i n a lg r e e nl e a v e s t op p tw i t hs o m er e s i s t a n c e w h i c hs h o w e dt h es e l e c t a b l em a r k e rg e n e ( b a t ) w a si n t e g r a t e di n t ot h e c a b b a g eg e n o m e s ( 3 ) v i t r o l e a f t e s t i n g o f s k t i t r a n s g e n i cc a b b a g e f o re v a l u a t i n gr e s i s t a n c e t oc a b b a g e w o r m 西南大学硕士学位论文 一rr l i i | _ i 宣i | 置i _ i 暑置i 宣i i i _ i f u r t h e ra w a y , t h e r ew a sav i t r ol e a ft e s t i n go fs k t i - t r a n a g o n i e c a b b a g ef o re v a l u a t i n g r e s i s t a n c et oc a b b a g ew o r m ，t h e no b s e r v e da n dr e c o r d e dt h el a r v a eg r o w t h ，t h el e a v e sv i c t i m i z a t i o n t h er e s u k ss h o w e dt h a tc o m p a r e dt ot h en o n - r e s i s t e n tg e n ep l a n t s ( c o n t r a s t ) ，t h et r a n s g e n i cc a b b a g e l e a v e sd a m a g ew e r em a r k e d l yl o w e r ，a n ds h o w e ds o m er e s i s t a n c et oc a b b a g ew o i t i s ：s o m ec a b b a g e w o r m sd e a d ，o t h e r sg r o w e ds l o w l l yo rd e l a y e de c l o s i o nt i m e 5 t r a n s f o r m a t i o no f c a b b a g ew i t hc mg e n ea n dd e t e c t i o no f t r a n s f o r m e dp l a n t s h y p o c o t y le x p l a n t so f7d a y so l da s e p t i cc a b b a g es e e d l i n g sw e r ep r e - c u l t u r e do nb u di n d u c t i o n m e d i u m ( m s + b a3 m g l + n a a0 1 m g n 一1f o r 2d a y s t h ee x p l a n t sw e r et h e ni n f e c t e d6 8m i n w i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a e i e n ss t r a i ne h a l 0 5h a r b o r i n gap l a s m i dv e c t o rp l u s c r ec o n t a i n i n gc r e g e n e a f t e r2d a y sc o - c u l t o r e ，t h ee x p l a n t sw e r et r a n s f e r r e do n t oa g r o h e c t e d u m s u p p r e s s i v em e d i u m c u l t i v a t e df o r6d a y s ，t h e nt r a n s f e r r e do n t os e l e c t e dc u l t u r e ( m s + b a3 m g l + n a ao 1 m g l + k a n 5 m 舭一c b 2 5 0 m g l ) t h r o u g h3 4t i m e so fk a n a m y c i n - r e s i s t a n ts e l e c t e dc u l t u r e ，p h a s i n go u t n o n - t r a n s