（麻醉学专业论文）pdtc对lps诱导大鼠急性肺损伤的保护作用.pdf

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蔺埘虫害 兰州大学硕七学位论文 p d t c 对l p s 诱导急性肺损伤大鼠肺组织的保护作用 摘要 目的探讨二硫代氨基吡咯烷( p y r r o l i d i n ed i t h i o c a r b a m a t e ，p d t c ) 对内毒素 ( s ) 诱导急性肺损伤大鼠肺组织的保护机制。 方法7 2 只雄性w i s t a 大鼠随机分为三组：对照组( c 组) ，l p s 组( l 组) ， p d t c + l p s 组( p 组) 。其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为1 、3 、6 、 1 2 h 亚组，每组六只。l 组和p 组采用腹腔注射l p s 8 m g k g ( 5 m g m 1 ) 制作内毒 素性肺损伤模型，c 组腹腔注射同体积的生理盐水。p 组在腹腔注射内毒素前 3 0 m i n ，尾静脉注射p d t c l 2 0 m g k g ( 6 0 m g m 1 ) ，l 组和c 组给予同体积的生理 盐水。按分组规定的时间点，1 0 水合氯醛3 5 0 m g k g 腹腔注射麻醉，开胸心脏 放血处死，采集标本。 观察大鼠肺组织病理变化，肺组织湿干重( w d ) l g 变化，同时r t - p c r 法检 测大鼠肺组织i c a m 1 m r n a 表达，放免法检测大鼠血清t n f - a 、i l - 6 含量的 变化。 结果 l 、与c 组相比，l 组病理切片示肺泡结构基本消失，肺间质及肺泡毛细血 管明显扩张、片状出血，支气管壁、肺泡间隔及毛细血管周围有大量炎症细胞浸 润重；与l 组相比，p 组肺组织结构破坏轻微，可看到代偿增大的肺泡，无明显 的水肿、淤血，仅有少量的炎症细胞浸润。 2 、与c 组相比，l 组肺组织湿干重比( w d ) 明显增大。肺组织i c a m 1 m r n a 表达在各时间点都明显增强( p 0 0 5 ) ，血清t n f q 、i l - 6 含量在1 h ，3 h ，6 h 增高( p o 0 5 ) ；与l 组相比，p 组肺组织湿干重比( w d ) 减小( p 0 0 5 ) ， i c a m 1 m r n a 表达显减少( p o 0 5 ) ，血清t n f q 、i l - 6 含量在1 h ，3 h ，6 h 降 两卅虫害 兰州大学硕士学位论文 低( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) 。 结论应用p d t c 能明显抑制i c a m 1 m r n a 表达，降低炎症因子t n f q 、 i l - 6 的含量。提示p d t c 可能对内毒素所致的大鼠急性肺损伤有保护作用。 关键词p d t c ：核因子kb ；i c a m 1 ；内毒素；肺损伤；t n f - q ：1 1 6 “卜 两研虫害 兰州大学硕士学位论文 t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fp d t co na c u t el u n g i n ju r y i n d u c e db yl p si nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v et oe x p l o r et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fp d t c o na c u t el u n gi n j u r yi n d u c e d b yl p s m e t h o d s7 2w i s t ar a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ( c ) ， l p sg r o u p ( l ) ，p d t c + l p sg r o u p ( p ) la n dpw e r ed i v i d e di n t ol h ，3 h ，6 h ，1 2 h s u b g r o u p s ( n = 6e a c h ) i na c c o r d a n c ew i t ht h et i m eb e t w e e ni n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no f e n d o t o x i nt ot a k et h el u n gt i s s u e t op r o d u c e dt h ee n d o t o x i n - i n d u c e dl u n gi n j u r y m o d e l ，g r o u pl a n dg r o u ppw e r ei n t r a p e r i t o n e a li n j e c t e do fl p s8 m g k g ( s m g m 1 ) ， g r o u pci n j e c t e do ft h es a m ev o l u m eo fn o r m a ls a l i n e ；g r o u ppg r o u pw a si n j e c t e d p d t c1 2 0 m g k g ( 6 0 m g m 1 ) f r o mt h et a i lv e i n ，t h e ni n t r a p e r i t o n e a li n j e c t e do fl p s 3 0 m i nl a t e r , g r o u pl g r o u pa n dg r o u pcw e r e # y e n t h es a m ev o l u m eo fn o r m a ls a l i n e o b s e r v a t i o no fp a t h o l o g i c a lc h a n g e si nl u n gt i s s u e ，l u n gw e t d r yw e i g h t ( w d ) r a t i oc h a n g e s ，a n du s et h em e t h o do fr t - p c rt od e t e c tl u n g si c a m - l m r n a e x p r e s s i o na n dd e t e c t i n gt h ec h a n g e so ft n f - qa n di l - 6i ns e r u m r e s u l t si npa n dl ，p a t h o l o g yb i o p s ys h o w e dt h es t r u c t u r eo fl u n gt i s s u ew a s s e r i o u sd a m a g e d ，t h ew e td r yw e i g h tr a t i o ( w d ) o fl u n gt i s s u ew a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d ，t h ee x p r e s s i o no fi c a m l m r n aw a se n h a n c e d ，a n dt h ec o n t e n to fs e r u m t n f - a ，i l 一6w a si n c r e a s e d a p p l i c a t i o no fp d t c ，c o m p a r e dw i t hu s i n go fl p s ，t h e d a m a g eo fl u n gt i s s u e ss t r u c t u r ew a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ，l u n gw e t d r yw e i g h t r a t i o ( w d ) w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ( p 0 0 5 ) ，t h ee x p r e s s i o no fi c a m - l m r n a w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ( p o 0 5 ) ，锄dt h ec o n t e n to fs e r u m 耵师一aa n di l - 6w a s n l 蔺埘虫害 兰州大学硕士学位论文 d e c r e a s e d ( p 0 0 5o rp o 0 1 ) c o n c l u s i o np d t cc o u l di n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fi c a m 1 m r n aa n dr e d u c e t h ec o n t e n to fi n f l a m m a t o r y c y t o k i n e st n f q ，i l - 6 s h o w e dp d t ch a dt h e p r o t e c t i v er o l ei nl p s - i n d u c e da c u t el u n gi n j u r yo fr a t s k e yw o r d sp d t c ；n f - r b ；i c a m 一1 ；l p s ；a l i ；a r d s ；n f - q ；i l - 6 i v 蔺埘虫害 兰州人学硕士学位论文 目录 摘要l a b s t r a c t 。i i l 目录i 前言1 背景回顾 4 1 j i 。l ：。】j f a i t l ：l s 4 2a l i 发病机制6 2 1 中性粒细胞( p m m 介导的损伤6 2 2 内皮细胞和上皮细胞损伤。7 2 3 细胞因子介导的损伤7 2 4 凝血功能异常8 2 5 氧化物质介导的损伤8 2 6 机械通气诱导的肺损伤。9 2 7 肺泡纤维化与肺损伤的消融9 3动物模型1 0 4 结语1 1 材料与方法1 2 l 研究对象1 2 1 1 动物与分组1 2 1 2 模型制备1 2 2 指标测定1 2 3 主要试剂与仪器1 3 3 1 主要试剂1 3 3 2 实验仪器1 3 4 实验方法与步骤。1 3 4 1 苏木素伊红( h e ) 染色1 3 4 2r t - p c r 检测i c a m 1 m r n a 含量1 4 4 3 放免法检测血清t n f - a 、i l - 6 含量1 6 5 统计学处理1 6 结果1 7 讨论：1 3 l g ；论3 ( ) 参考文献。3 1 攻读硕士学位期间完成的论文3 4 j 【谢3 5 # | 萄埘幺害兰州大学硕士学位论文 1 二l 刖舌 急性肺损伤( a u ) 是由于各种原因引起的肺组织结构发生特征性的病理改变 而出现的临床综合征。多见于机体遭受严重感染、创伤、休克、毒物中毒等情况。 其病理特点为肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，表现为广泛肺水肿和 微小肺不张。病理生理改变主要是肺内分流增加和肺顺应性下降。临床上表现为 低氧血症、呼吸频速和x 线胸片出现双肺弥漫性浸润。a u 有着从轻到重的连 续过程，重症a u 即急性呼吸窘迫综合征( a r d s ) 。其在分子水平上表现为众多 促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达，伴有多种炎症介质的产生。在致病因素 作用下炎症细胞和多种细胞因子相互作用形成十分复杂的网络，经过启动、放大 和损伤三个“级联 ( c a s c a d e ) 过程，使其不断放大，炎症介质和细胞因子失控 性释放，形成失控性炎症反应【1 1 。近年来的研究中发现，在中不仅有炎症介 质的过度产生和释放，而且伴随大量内源性抗炎介质的产生和释放。内源性抗炎 介质不足或过量也是导致细胞因子网络紊乱、致炎与抗炎因素失衡的重要原因。 上述炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸多肺外器官。 n f - gb 是参与炎症反应的一个重要转录因子，广泛存在于真核细胞中参与 许多基因表达的调控。正常情况时n f - kb 为p 6 5 和p 5 0 两个亚单位组成的异源二 聚体，n f - kb 通常与kb 抑制蛋f a ( 1kbq ) 结合成无活性的形式存在少胞浆中， 抑制n f kb 的核易位，使之保留于胞浆。当其受氧自由基、内毒素、细胞因子 等的刺激后被激活，ikbq 被磷酸化而降解，导致n f - kb 从细胞浆移位进入细 胞核内，与d n a 链上的特异性位点结合，从而启动基因转录，调控相应的靶基 因表达。活化的n f gb 可促使细胞因子( 如耵眼q 、i l 6 ) ，黏附分子( 如 i c a m 1 ) ，细胞表面受体，酶类和急性期蛋白等的表达增加。这些被诱导产生 的基因产物可进一步参与炎症和免疫反应，在机体生理和病理条件下发挥重要的 功能。不适当或过度增强n f - kb 的活性可引起许多与炎症相关的疾病：包括 s i r s 、败血症体克、a r d s 、局部缺血和再灌注损伤等。n a k a m o r i 掣2 j 发现与健 1 1 9 晰幺害 兰州大学硕士学位论文 康志愿者比较，s 1 r s 患者多形核白细胞核内n f kb 活性显著增高，多形核白细 胞的氧化活性也显著增高。有研究证实n f - kb 的活性增高与脓毒血症相关，核 内n f - gb 的水平与临床表现的严重程度和死亡率有很大的相关性。脓毒症患者 中性粒细胞的凋亡率明显下降，而抑制n f kb 的核转移可以使中性粒细胞的凋 亡恢复到基础水平，在脓毒症模型中，抑制n f kb 的活性可以减轻急性炎症过 程和器官哀竭；而n f - gb 过度激活后释放出大量活性氧、蛋白酶、炎性介质， 形成微血栓，从而参与s i r s m o d s 的发生。 i c a m 1 是一类大分子糖蛋白，属于免疫球蛋白基因超家族，可以表达于多 种类型的细胞，它通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质问的粘附作用，参 与一系列生理及病理过程。目前研究认为，大量的多形核白细胞( p m n ) 黏附 于肺血管内皮细胞、在肺内扣押并释放生物活性介质是a u 发生的主要机制之 一。有效的减少或清除肺内的p m n 而控制炎症反应，可以减轻a u 。肺损伤时， ： 肺组织中i c a m 1 的表达增强，一方面通过与其配体即表达于p m n 表面的 c d l l c d l 8 相结合，有助于p m n 与血管内皮细胞相黏附，促使p m n 移行于血 管外；另一方面p m n 与靶细胞黏附结合后，形成p m n 与靶细胞之间较紧密且 相对稳定的微环境，此微环境有利于p m n 释放的毒性介质在局部保持较高浓度， 从而对靶细胞发挥有效的毒性作用，进而导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释 放。t n f - q 主能诱导肺内上皮细胞活化、白细胞迁移和毛细血管渗漏，积聚的 水肿液进一步阻碍肺泡内细胞的灌流和氧气的交换，引起肺损伤。t n f a 的含 量改变可反映其他炎症因子的改变情况。i l - 6 是一种迟发性细胞因子，可以诱 导活化的b 细胞增殖和分化，激活t 细胞，在诱导和维持炎症反应中起重要作 用。在急性炎性反应中i l - 6 的水平与病情严重程度密切相关。 本实验选用腹腔注射内毒素建立大鼠急性肺损伤模型，利用r t - p c r 检测 大鼠肺组织i c a m 1 m r n a 的含量，利用放免法检测血清中t n f q 、i l - 6 水平， 研究表明大鼠注射内毒素后，肺组织湿干重( w d ) 明显增大，肺组织 i c a m 1 m r n a 表达在各时间点都明显增强( p 0 0 5 ) ，血清t n f a 、i l - 6 含量 2 l 萄晰虫害 兰州大学硕士学位论文 在1 h ，3 h ，6 h 增高( p o 0 5 ) 。而提前注射p d t c 进行预处理的大鼠肺组织结构 的破坏有明显减轻，肺组织湿干重比( w d ) 减小( p 0 0 5 ) ，i c a m 1 m r n a 表达 显减少( p 0 0 5 ) ，血清t n f q 、i l - 6 含量在1 h ，3 h ，6 h 降低( p 2 0 次m i n ) 或通气过度( p a c 0 2 1 2 x1 0 札或 o 1 0 。流行病学 研究表明，脓毒血症和多发性创伤是a r d s 为最常见病因，a r d s 发病有4 0 - - 6 0 由脓毒血症、2 0 3 5 由多发性创伤、1 0 2 0 由医院获得性肺炎( h a p ) 和误吸性肺炎、9 由大量输血、7 由急性胰腺炎所致。单个易感因素存在时的 发病率为5 8 ，多个因素存在时的发病率为2 4 6 。单纯菌血症时，有5 2 0 并发a u ，而菌血症导致全身炎症反应或器官衰竭时，有2 5 - 4 0 的患者会发 展成为a r d s ，多发性创伤时有5 - - 8 发生a r d s 。在基础疾病相似的情况下， 高龄患者发生a r d s 的危险性更大。 1 9 9 2 年欧美a r d s 联席会议制定a u 的诊断标准：急性起病。 p a 0 2 f i 0 2 3 0 0 m m h g 。x 线胸片示有双肺浸润影。肺动脉楔e , r 1 8 m m h g 或无左房高压证据。a r d s 的诊断标准除第项为p a 0 2 f i 0 2 、 2 0 0 m m h g ( 不管呼 气末压水平) 外，余三项与a u 相同。中华医学会呼吸病学分会1 9 9 9 年诊断标准 a l i a r d s 的诊断标准：有发病的高危因素。急性起病，呼吸频数和( 或) 呼吸 窘迫。低氧血症：a u 时p a 0 2 f i 0 2 弋 3 0 0 m m h g ；a r d s 时p a 0 2 f i 0 2 一 2 0 0 m m h g 。 胸部x 线检查两肺浸润阴影。肺毛细血管楔压 弋1 8 m m h g 或临床上能除外 心源性肺水肿。凡符合以上5 项可诊断为a u 或a r d s 。 创伤及败血症是a u 发生最常见的原始病因。病因( 包括肺内朋市外，感染 非感染) 都能直接或间接地引起a u 及a r d s 。危险因素分两部分：( 1 ) 直接肺损伤 指有害因素直接损伤肺实质细胞( 主要为内皮细胞和上皮细胞) ：如胃内容物或有 毒气体的吸入、弥漫性肺感染、淹溺等；( 2 ) 间接损伤更常见，如脓毒综合征、胸 部创伤、大量输液等通过激活急性炎症反应，引起全身炎症反应综合征。但以上 划分不是绝对的，即使直接损伤也常并发继发性炎症损害，并且是导致 a l i a r d s 中多种病理过程的主要原因。近年来的研究结果表明，内毒素血症是 5 蔺- 埘虫害 兰州大学硕士学位论文 启动a u 的主要因素。内毒素的来源主要有三方面：( 1 ) 明确感染灶的细菌。革 兰氏阴性( g r a m n e g a t i v e ，g ) 细菌，尤其是大肠杆菌已成为引起内毒素血症 ( e n d o t o x e m i a ) 的主要致病菌。据统计，成人内毒素血症患者中最常见的感染 来源是泌尿一生殖道，约占成人患者总例数的4 8 ，其次是胃肠道。( 2 ) 应用抗 生素治疗菌后，菌体被杀灭、裂解，所释放的内毒素入血造成内毒素血症。( 3 ) 肠道内细菌及内毒素的易位。当多种因素使肠道粘膜屏障功能受损及肝脏枯否细 胞清除功能被阻断时，可导致肠道内细菌及内毒素易位。 2a l i 发病机制 2 1中性粒细胞( p m m 介导的损伤 a l i 早期，p m n 在肺内和或循环血液中各种炎性刺激在t n f q ，i “、 i c a m 1 等作用下，通过黏附分子和受体间的作用黏附于内皮细胞表面而滞留在 肺内1 4 1 。此后，p m n 脱颗粒释放活性氧族、蛋白水解酶和细胞毒素，使肺血管 内皮和肺泡上皮受损，血管内容物进入肺间质或肺泡，同时肺表面活性物质( p s ) 质、量显著降低，导致肺通气和换气功能障碍，引起a l i a r d s l 5 , 6 】。研究发现， a u 时，机体中不仅各种趋化因子的表达增强，促使更多的p m n 活和迁移入肺， 而且p m n 正常的凋亡途径也出现了障碍。有研究指出，外周血和支气管肺泡灌 洗液中t n f - ( i t 、l l lb 和i l - 6 的浓度在发生a u 时都有所升高，它们导致肺组 织中p m n 的凋亡发生延迟，使存活的p m n 比例增加，这些持续处于激活状态 的p m n 通过释放氧自由基和毒性内容物造成了肺损害。另外，有研究还指出， 起主要吞噬p m n 作用的巨噬细胞在a u 时凋亡率会上升，吞噬能力下降，导致 了即使已经凋亡的p m n 也不能被及时的清除，因此可能发生继发性坏死、细胞 内容物外泄，加重a u 的严重程度。由于p m n 所释放的各种酶、活性氧和炎性 介质是导致a u 发生的重要因素。因此，炎症时机体肺泡内渗出p m n 的多少及 其如何演变将对a l i 的发生和发展起关键作用。 6 1 1 9 州幺害 兰州大学硕士学位论文 2 2内皮细胞和上皮细胞损伤 a i i a r d s 显著的组织学特征是肺血管内皮和肺泡上皮损伤，肺血管通透性 增加。肺血管内皮细胞是肺血管内皮肺泡上皮屏障的重要组成部分，因此肺血 管内皮细胞受损时，可导致肺血管内皮肺泡上皮屏障丧失正常的功能，血管通 透性增加。正常情况下，血管内皮细胞的凋亡与生成处于一个动态平衡的状态， 但如果短时间内血管内皮细胞大量凋亡将导致平衡失调，内皮细胞屏障功能障 碍，使得血管通透性增加。肺损伤大量产生的t n f q 可能通过诱导肺血管内皮 细胞凋亡，造成内皮细胞屏障功能障碍，血管通透性增加。在急性肺血管损伤的 修复期，内皮细胞的凋亡还限制了血管的生成。过量的血管内皮凋亡可能是肺损 伤的发生机制之一。肺泡壁上皮细胞和血管内皮细胞的凋亡直接导致通透性增 高，引起肺损伤，巨噬细胞增生，大量中性粒细胞浸润并凋亡，一方面巨噬细胞 激活后细胞因子释放增多，另一方面巨噬细胞于创伤后吞噬能力下降，大量凋亡 的中性粒细胞可能因得不到及时的吞噬清除而最终破裂放出毒性内容物，造成肺 表面活性物质分泌和肺泡液转运功能受损，使得蛋白水肿液聚集在肺泡腔内，同 时肺泡间隙血清蛋白和蛋白水解酶也进一步加重其损伤，导致肺不张和低氧血症 【7 1 。研究发现，山早期肺泡上皮的损伤程度与预后相关，可用作预后判断的指 标。 2 3 细胞因子介导的损伤 多种炎性细胞因子与a i i a r d s 的发病有关，t n f q 、i l ld 具有触发进 一步炎症反应的作用，被称为“早期反应细胞因子【引。研究发现，直接或间接肺 损伤因素均能导致动物体内该类细胞因子水平立即升高。这两种细胞因子主要由 单核巨噬细胞分泌并产生相似的生物学效应。脂多糖能诱导巨噬细胞释放这两种 细胞因子，而1 3 肾上腺素激动剂通过上调细胞内c a m p 水平抑制t n f q 的释 放。这些细胞因子可协同作用于内皮细胞，上调i c a m 1 、p 选择素、e 选择素 等细胞间粘附因子表达，并通过增加组织因子和纤溶酶原激活抑制因子，降低表 7 两卅虫害 兰州大学硕士学位论文 面血栓调节因子及促进趋化因子如i l - 8 、单核细胞趋化多肽1 ( m c p 1 ) 的释放 来促进凝血【9 1 们。这些趋化因子主要吸引中性粒细胞，促使其从骨髓释放并增加 细胞毒效应。气管内滴注t n f - q 、i l 广11 3 能促使中性粒细胞募集到肺血管和肺 泡中，证实了上述观点。此外，这些前炎症因子通过趋化肺纤维母细胞和上皮细 胞，并通过促丝裂原效应参与损伤后修复过程。 2 4 凝血功能异常 a u 高危或确诊患者血浆和b a l 中各种促凝因子显著增加，内源性抗凝因 子明显减少，血浆蛋白c 水平明显下降，且与预后相关，而b a l 和肺泡水肿液 中纤溶酶原激活剂抑制物1 水平则显著增加，导致纤溶受损【1 1 l 。促凝、抗凝和 纤溶系统的失衡引起血液高凝和弥漫性纤维沉积，导致微血栓形成，这可能是 a r d s 或败血症患者频发多发性器官功能衰竭( m o f ) 的重要原因，同时它们也是 高效的促炎刺激，可加重炎症反应【1 2 1 。因此，适当纠正失衡的凝血系统将有助 于减轻炎症反应【1 3 】。 2 5 氧化物质介导的损伤 呼吸爆发是p m n 杀灭病原体的重要方式，也是a u 及a r d s 的重要原因。 、a r d s 病人血浆中，有明显的高水平氧自由基造成的脂质和蛋白质损伤的 证据【1 4 l 。同时，血浆中对抗活性氧自由基的能力降低，a u 和a r d s 病人支气 管肺泡灌洗液( b a l f ) 中，谷胱甘肽大部分氧化，q1 抗胰蛋白酶( q1 a r ) 也被氧化灭活、蛋白成分破坏、黄嘌呤、次黄嘌呤浓度在血浆和b a l f 中升高， 为产生更多的氧自由基提供了充足的底物【1 5 】。活性氧代谢产物对组织细胞的破 坏主要有以下几个途径：脂质过氧化反应，损伤生物膜脂质；与蛋白质交联， 肽键断裂、蛋白构型改变、酶活性改变，损伤膜蛋白；直接损伤核酸，导致细 胞死亡；破坏问质胶原肽键、降解透明质酸，损伤细胞间质；破坏体内氧化 抗氧化的平衡，消耗氧自由基清除剂，使机体抗氧化能力下降【1 6 l 。研究发现， 长期嗜酒者b a l 中谷光甘肽浓度只有正常的1 7 ，而氧化型谷光甘肽却有所增 8 蔺- 卅幺害 兰州人学硕士学位论文 加，故长期嗜酒者发生严重感染、败血症或误吸时a u 发生率将有所增加。 2 6 机械通气诱导的肺损伤 目前众多研究认为机械通气不仅导致肺组织结构性损伤且引起肺组织_ 生物 学损伤 ，即机械通气导致肺炎症反应上调，中性粒细胞浸润，支气管肺泡腔灌 洗液中炎症介质增加，其发生机制是由多种途径和信号传导通路共同作用所致。 机械力通过激活或触发肺细胞膜上牵张敏感的阳离子通道、通过细胞骨架结构改 变，细胞膜上相关分子的直接构象变化等将机械信号传入细胞内，然后激活细胞 内信号传导通路，通过调节转录因子，蛋白激酶的活化和蛋白的磷酸化水平等多 种机制，进一步诱发肺内炎性因子的大量产生，局部炎症反应扩散，体循环炎症 介质的释放导致全身性炎症反应，机体免疫力的丧失和持久的炎症损伤，促使病 人通过一系列机制发展为多系统炎症反应综合征( s i r s ) 和多器官功能衰竭 ( m s o f ) 。 2 7 肺泡纤维化与肺损伤的消融 a u 早期，在b a l 和肺水肿液中发现成纤维细胞在i l - 1 作用下发生有丝分 裂，这提示促炎机制可能参与纤维增生1 1 7 j 。同时，肺泡上皮和巨噬细胞也通过 胞饮或吞噬清除肺泡液中的不可溶物质，随着a u 的进展，该清除力下降，导 致不可溶物质沉积在肺泡表面形成透明膜而发生纤维化，故保持这种清除力有利 于炎症消散。此外，i i 型肺泡上皮细胞在角膜生长因子、肝细胞生长因子和成纤 维细胞生长因子1 0 作用下增殖、分化，对损伤肺泡上皮进行修复，与p m n 凋 亡一起参与山的消融i l 引。当然，凋亡也是损伤细胞死亡的重要机制，其调控 介质有f a s 和f a s 配体。a u 患者肺泡上皮、气道黏膜上皮f a s 表达上调，而b a l 液或水肿液中f a s 配体水平升耐1 8 j ，这提示肺损伤后f a s 和f a s 配体系统激活， 诱发上皮细胞凋亡。目前，尚不清楚凋亡在纤维性肺炎消散过程中起多大作用。 9 鹄州幺害 兰州大学硕士学位论文 3 动物模型 由于动物a l i 模型与人的a u 在临床上有一定差异，故在用动物研究a u 发病机制时，模型选择十分重要。目前使用的动物模型有肺泡灌洗法、油酸( o a ) 静脉注射法、内毒素法及复合模型。对于这些模型的制作及其各自拥有的病理特 点，国内外学者已有了详尽的论述【1 9 】。目前认为采用l p s 注射法建立动物 模型其病理生理改变与人a u 更为接近【删，是目前关于a u 最常用的动物模型， 可以通过腹腔注射、静脉注射等手段制成a u 动物模型。因此，本实验采用l p s 腹腔注射制作a u 动物模型。同时模型的建立与l p s 的剂量有关。目前认为l p s 剂量 6 m g k g 为建立a u 模型。因此，本实验 采用l p s 8 m g k g 建立a u 模型。 l p s 是g 菌外膜的成分之一，由o 特异性抗原多糖、核心多糖和脂质a 三 部分共价连接而成的长链化合物。o 抗原居l p s 的外层，结构易变异，它的多 样性是菌种血清学特异性的结构基础：脂质a 结构稳定，是l p s 生物学活性的主 要表现者；核心多糖居中起连接二者的作用。l p s 进入体内后和脂多糖结合蛋白 ( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d eb i n d i n g p r o t e i n ，l b p ) 结合从而单体化，是其发挥毒性作用的 第一步。l b p 和l p s 结合后并无激活细胞的效应，而是将l p s 传递给c d l 4 形 成l b p l p s c d l 4 复合物，该复合物在分泌性蛋白m d 2 参与下【2 2 1 ，通过某种 方式结合细胞表面的跨膜受体t l r 4 ，使t l r 4 受体发生二聚化【2 3 1 。t l r 4 受体 构型改变后，其胞内区可与接头蛋白髓样细胞分化因子( m y d 8 8 ) 的t h 结构域相 互作用，依次激活l 1 受体相关激酶( i r a k ) 、接头蛋白t n f 受体相关因子 ( t r a f 6 ) 、n f kb 诱导激酶( n i k ) 、i kb 激酶( i k k s ) ，i k k s 引起ikb 的泛素化， 这样n f - kb 就可以从ikb n f - kb 复合物中释放出来【州。游离的n f - kb 呈活 化状态，可转移至细胞核内，结合d n a 特异的kb 序列，启动和调节众多与免 疫应答、炎症反应及细胞生长调控等即早基因的表达1 2 5 1 。 1 0 蔺卅幺害 兰州大学硕士学位论文 4 结语 研究显示n f - kb 广泛参与炎症介质和前炎症介质、粘附分子、趋化因子和 一些炎性相关酶类( 基质金属蛋白酶、环氧化酶) 等基因的调控，在机体产生对病原 体的快速防御和诱导早反应基因表达中发挥重要作用，与机体非特异性免疫反应 具有密切关系【2 6 1 。在静止细胞中，n f kb 与其抑制因子形成复合体，以无活性形 式存在于细胞浆。当细胞受到l p s 刺激后，n f kb 抑制因子发生磷酸化和降解， 使n f - kb 游离并进入细胞核，与目的基因结合位点结合，启动基因转录。 由于细胞因子在a u 发病中起到了重要作用，既往提出过许多包括特异性 抗体在内的调控措施，但临床实践效果均不甚理想，原因之一是细胞因子之间存 在极其复杂的网络和相互代偿关系。n f - kb 因能在d n a 这个“源头 水平上 影响多种促炎因子转录，有研究表明在a u 动物模型上观察到抑制n f kb 活化 程度对肺损伤有较明显的缓解作用【2 7 , 2 8 】。本文使用n f - kb 阻断剂吡咯烷二硫氨 基甲酸酯( p d t c ) 预处理来治疗l p s 所致的大鼠肺损伤，以探讨p d t c 对炎症 因子的影响和肺保护作用。 蔺卅幺害兰州大学硕士学位论文 1 研究对象 1 1 动物与分组 材料与方法 7 2 只雄性w i s t a 大鼠，体重2 0 0 - - 2 5 0 9 ，由，由兰州大学实验动物中心提 供，随机分为三组：对照组( c 组) ，l p s 组( l 组) ，p d t c + l p s 组( p 组) 。根据 腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为1 、3 、6 、1 2 h 亚组，每组六只。 1 2 模型制备 l 组和p 组采用腹腔注腹腔射l p s 8 m g k g ( 5 m g m 1 ) 制作内毒素性肺损伤 模型，c 组腹腔注射同体积的生理盐水。p 组在腹腔注射内毒素前3 0 m i n ，尾静 脉注射p d t c l 2 0 m g k g ( 6 0 m g m 1 ) ，l 组和c 组给予同体积的生理盐水。按分组 规定的时间点，1 0 水合氯醛3 5 0 m g k g 腹腔注射麻醉，开胸心脏放血处死，采 集标本。 2 指标测定 肺组织病理检查取左肺下叶，4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，h e 染色后 光镜下观察肺组织形态学变化。 肺组织湿干重比值( w d ) 取左肺下叶，滤纸拭去表面血液，称湿重后( w ) 置于8 0 烤箱烘烤4 8 小时使肺组织达恒重后称干重( d ) ，计算w d 比值 r t - p c r 检测用p c r 专用器械迅速取右肺下叶，经预冷的d e p c 水冲洗 表面的血液后立即雹于液氮中速冻，8 0 c 冰箱保存，待测r t - p c r 。 血清t n f - q 、i l - 6 含量：取血液3 7 。c 水浴半小时后离- 1 二, ( 2 5 0 0 9 x1 0 m i n ) ， 取上层血清7 0 冰箱保存备用。放免法测定t n f - q 、i l - 6 含量。 1 2 蔺晰幺害 兰州大学硕十学位论文 3 主要试剂与仪器 3 1 主要试剂 l p s ( e c o l i 0 5 5 ：b 5 ) p d t c 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 特异性引物 r n a i s or e a g e n t 一步法r t - p c rk i t t 7t r a n s c r i p t i o nk i t o n e s t e pr e a lt i m er t - p c rk i t d n a 酶( r n a a s ef r e e ) 放免试剂盒 3 2 实验仪器 电热恒温鼓风干烤箱( d h g - 9 1 2 3 a 型) 自动台式灭菌器( t m q r - 3 8 5 0 ) 高速低温离心机( b e c k m a n ) r t - p c r 扩增仪 三恒多用电泳仪( d y y - i i i 一1 2 b 型) 4 实验方法与步骤 4 1 苏木素伊红( h e ) 染色 s i g m a 公司 s i g m a 公司 美国g i b c o 公司 上海生物工程有限公司 大连t a k a r a 宝生物工程有限公司 杭州博日科技有限公司 美国m b i 公司 大连t a k a r a 宝生物工程有限公司 美国m b i 公司 北京北免东雅生物技术研究所 中国 中国 美国 中国 中国 ( 1 ) 4 多聚甲醛固定的标本做石蜡包埋处理，切片机连续切片，片厚5 u m ， 于载玻片上自然风干； 蔺埘虫害 兰州入学硕士学位论文 ( 2 ) 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化； ( 3 ) 1 0 盐酸酒精分化3 5 s ； ( 4 ) 返蓝，自来水冲洗5 m i n ； ( 5 ) 5 伊红浸染3 0 s ； ( 6 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 4 2r t p c r 检测i c i a m 1 m r n a 含量 4 2 1 引物设计 利p r i m e rp r e m i e r5 o 引物设计软件，根据美国国立生物技术信息中心 ( n c b i ) 公布的大鼠1 3 a c t i nm r n a 、i c a m 1 m r n a 的基因序列，设计b a c t i n 、 和i c a m 1 引物。并且通过n c b i 中b l a s t 功能，初步检测引物的特异性。所需引物 均由上海生物工程有限公司合成。 1 3 a c t i n s e n s eg t g g g c c g c t g l = a g g c a c c a a ( 5 4 0 b p ) a n t i s e n s ec t c r i t g a t g t c g c a c g a i t i t c i c a m 1 s e n s ea g g t a t c c a r c c a r c c c a c a