FISH技术及应用.ppt

FISH相关技术及其应用,荧光原位杂交FluorescenceinsituHybridization(FISH),FISH-aprocesswhichvividlypaintschromosomesorportionsofchromosomeswithfluorescentmolecules荧光原位杂交是一个可以用荧光分子将染色体或部分染色体涂染的过程identifythepresenceandlocationofaregionofDNAwithinmorphologicallypreservedchromosomepreparations,thencanidentifieschromosomalabnormalities在保持染色体形态的基础上识别某一段DNA存在与否、位置是否改变，因此可识别染色体异常oftenusedduringMphasebutisnowusedoninterphaseaswell常用于中期分裂相的分析，现在也用于间期细胞的分析,荧光原位杂交,优势:lesslabor-intensivemethod省时省力forconfirmingthepresenceofaDNAsegmentwithinanentiregenomethanotherconventionalmethods相比于在基因组中证实DNA片段存在的其他常规方法,FISH操作步骤,Denaturethechromosomes染色体变性Denaturetheprobe探针变性Hybridization杂交Fluorescencestaining荧光染色Examineslidesorstoreinthedark显微分析,探针类型,Yq12重复序列探针,重复序列探针-14、22着丝粒,单色FISH-1号着丝粒探针,单色FISH(端粒探针),位点特异性探针,全染色体探针,双色FISH,多色荧光原位杂交,SpectralKaryotyping(SKY)光谱核型分析,24色FISH,多色FISH（着丝粒和端粒特异性探针）,M-FISH（染色体条带特异性探针）,IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S4399B1005B3,11,11.1,11.21,11.22,13.2,13.3,13.1,24,25,14.2,14.3,14.1,13.4,13.5,21,12,13,14,15.1,15.2,15.3,15.4,15.5,11,12,22.3,22.2,22.1,23.2,23.1,23.3,间期FISH,CompositeMouseKaryotypewithCentromeric分析和计算要估算剂量人员的外周血淋巴细胞的基因组易位率；参照标准曲线估算全身吸收剂量,Lucas公式,PAINT方法仅分析少数几条染色体，观察到的易位率转化成全基因组易位率，参照公式：Fp=2.05fp(1-fp)FGFp:FISH分析观察到的染色体易位率FG:全基因组染色体易位率fp:探针涉及的染色体占整个基因组的份额,双色：Fp=2.05fg(1-fg)+fr(1-fr)-fgfrFG三色：Fp=2.05fg(1-fg)+fr(1-fr)+fy(1-fy)-(fgfr+fgfy+frfyFG,应用的假设,辐射所诱导的染色体易位率是保持不变的，至少变化很小；双着丝粒和易位均发生在两条不同染色体的两个断裂上，辐射造成的断裂点在染色体上分布是随机的，断裂点的重接也是随机的，双着丝粒和易位的发生率应相当。染色体畸变在染色体上和染色体间的分布是随机的，每条染色体发生畸变的概率应与染色体长度成正比,影响因素,年龄、吸烟与否：自发易位频率1949岁为新生儿的3倍，5079岁老年人是新生儿的10倍，作者认为在低于50岁时，染色体自发易位频率与年龄成直线关系，但从5060岁开始，自发易位频率显著增高，偏离直线，吸烟者偏离更大。Lucas对35名健康对照(098岁)的自发染色体易位频率进行分析，认为自发易位频率与年龄不是直线关系，而为二次方程模式。不能定论,用PAINT估算剂量的限制性,标准曲线大多为急性照射的；易位是否稳定存在？细胞寿命(长寿命6年)、复杂易位10年左右基本稳定染色体发生畸变的概率是否与染色体长度成正比有些小片段的易位会错误地计为正常：分辨率最小彩染片段为11.10.08Mb，未彩染片段为14.60.6Mb,染色体涂染（ChromosomePAINTING）,RERF,多色FISH方法,Biotin标记-绿色荧光Dig-标记-红色荧光Biotin+Dig-标记-黄色荧光,双着丝粒和易位,F,Dic,Normal8,Tr,Tr,Dic+F(7:9),Translocation(8:other),问题,应用方面的工作方法的实施：21个BAC探针的平衡问题推广的难度与PAINT方法的比较？,研究内容,比较本实验室建立的FISH方法和PAINT方法建立的剂量效应曲线：给予正常外周血样品离体照射一系列的剂量（05Gy），制备染色体标本，用本室建立的端粒和着丝粒组合的方法（用1、2或4号染色体）进行分析，建立剂量-效应曲线，与已经建立的PAINT剂量-效应曲线进行比较；在实际剂量估算应用中比较：收集早先事故病人（受照后短期内有生物剂量）的外周血，制备染色体标本，用两种方法进行分析，进行剂量估算。,BACFISH方法观察到的染色体易位,正常中期分裂相,4号染色体易位,用BACFISH分析05.00Gy60Co射线诱导的染色体易位,用BACFISH分析05.00Gy60Co射线诱导的染色体易位剂量效应曲线,Y=0.043D2+0.0008D+0.0048R20.9997,用染色体涂染方法观察到的染色体易位,正常中期分裂相,发生染色体易位,用染色体涂染方法分析05.00Gy60Co射线离体照射诱发的淋巴细胞染色体易位,用染色体涂染方法建立的05.00Gy60Co射线离体照射诱发淋巴细胞染色体易位剂量效应曲线,Y=0.043D2+0.006D+0.0036R20.9998,两个曲线方程的比较,BACFISH：Y=0.043D2+0.0008D+0.0048R20.9997PAINT：Y=0.043D2+0.006D+0.0036R20.9998,早先事故病人的剂量估算,结论,用1、2和4号染色体端粒和着丝粒