（微生物与生化药学专业论文）黏细菌及其抗菌活性物质的筛选与鉴定.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四j i l 大学所有，特此声明。 申请人：宕t 1 习。李己 艚捌吼伞芬、 一1 ，i 、 o v 一) 四川大学硕士学位论文 黏细菌及其抗菌活性物质的筛选与鉴定 生物制药教研室 研究生刘冰花导师余蓉教授 摘要 黏细菌属于原核生物，是一类可滑动的、专性好氧的具有复杂多细胞行为 的单细胞革兰氏阴性杆菌，不仅在细胞分化、发育和生物进化研究中占有重要 地位，而且近年来作为一种可产生丰富而有用的次级代谢物的微生物类群逐渐 受到世界青睐，其中有些可抗细菌、有些可抗真菌、有些抗癌、有些溶栓，这 对于药物的研发具有重要意义。但分离纯化黏细菌相当困难和耗时，并且难于 培养，同时方法特殊。这极大地限制了对这类微生物物种资源的开发，以致其 应用研究较其它的微生物类群更为落后。所以，探索更好的分离纯化黏细菌的 方法非常重要。 本研究以纯食草兔粪为原料筛选黏细菌。采用多菌灵、灰黄霉素、克霉唑 抑制霉菌、丝状真菌等真菌的生长，用加热法除去不耐热的杂菌，用低温冷冻 的方法除去可能存在的蠕虫以及不耐反复冻融的细菌，兼用选择培养基v y 4 培 养基、纤维素培养基、w c x 培养基富集黏细菌。研究中得到了3 株细菌，通过观 察它们在、n 4 培养基、纤维素培养基、w c x 培养基、l b 培养基中的菌落形态、生 四川大学硕士学位论文 长状况及在电子显微镜下菌株的子实体、营养细胞和黏孢子的形态、结构等特 征，初步鉴定这3 株细菌均为嗜细菌群黏细菌中的囊球黏细菌属，发现这三株菌 还未曾被报道过，被初步认为是新菌株。 实验中发现多菌灵、灰黄霉素、克霉唑等均可抑制霉菌、丝状真菌等的生 长，但多菌灵的抑菌效果较好。多菌灵为农业用药比先前报道的放线菌酮价廉、 易得并且毒性较小。 实验重点研究了1 号菌，发现其对数生长期为3 5 1 1h ，最适起始p n 为7 2 2 ， 最适生长温度为3 4o c ；同时发现1 号菌胞外及胞内物中都有抗菌活性物质，且 抗菌谱不同，胞外物对革兰氏阳性细菌有较明显的抑菌作用，胞内物对部分革 兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌如e 埔抑菌作用，但对革兰氏阴性细菌的抑 菌作用较强，两者对真菌均无抑菌作用。 将1 号菌的胞外培养物6 0 。c 旋转蒸干后加水溶解，通过液相萃取、薄层层 析、硅胶柱层析，得到了抑制放线菌生长的单一组分，并通过光谱法、双缩尿 法、p a g e ( 聚丙酰胺凝胶电泳) 、三氯醋酸沉淀、m o l i s c h 反应、葸酮反应等对 其进行了初步鉴定，发现其在九= 2 7 0 n m 时有最大光吸收值，初步鉴定为醛基或 酮基的衍生物。 由于1 号菌胞外抗菌活性物质耐热性、稳定性较好，同时其水溶性较好、对 g + 的抗性又明显、4 放置3 个月后仍有活性，所以有较大的研究价值。 实验还发现3 号菌的胞内物也可抑制大肠杆菌的生长，以上这些都表明这3 株黏细菌的研究具有实用性和新颖性价值。 关键词：黏细菌新菌株生长特性抗菌活性分离纯化 2 四川大学硕士学位论文 s c r e e n i n ga n d i d e n t i f i c a t i o no f m y x o b a c t e r i aa n di t s a n t i b i o t i cm a t t e r d e p a r t m e n to f b i o p h a r m a c e u t i c s r o s t g r a d u a t e n t o r l i ub i n 【g h u a p r o y ur o n g a b s t r a c t m y x o b a c t e r i ai st h ep r o k a r y o t e ，g l i s s a d i ca n d 蹦c t l ya e r o b i c i t i sg r a m - n e g a t i v e b a c i l l u sa n dh a sm u l t i p l i c n yc e l ll sb e h a v i o r n o to n l ym y x o b a c t e r i ai sp o s s e s s e do ft h e i m p o r t a n tp o s i t i o no l lc y t o d i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n tb u ta l s oc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nh a s b e e np a i dt om y x o b a c t c r i ar e c e n t l yb e c a u s eo f p r o d u c t i n gm o r ca b u n d a n ta n du s e f u ls e c o n d a r y m e t a b o l i s m ，i n c l u d i n ga n t i b a c t e r i a l , a n t i f u n g a l a n t i c a n c e ra n dt h r o m b o t y s i sc o m p o u n d s b u ti ti s v e r y d i f f i c u l th a n d l ea n d t i m e - c o n s u m i n g t o p u r i f i c a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f m y x o b a c t c r i a , a sw e l la sh a r d i n gc u l t u r e a l lt h e s ec o n f i n eo v e r w h e l m i n g l yt h ee x p m i m t i o n o fm y x o b a c t c r i & s ot h ee x p l o r a t o r yd e v e l o p m e n tt om y x o b a c t c d af a l l sb e h i n dt h eo t h e r m i c r o - o r g a n i s m t h e r e f o r e , i ti sv e r yi m p o r t a n tl o o k i n gf o rt h eb e t t e rm e t h o do f p u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no f m y x o b a c t e r i a i nt h e s er e s e a r c h i n g , t h ep u r eg r a z i n gh a r ed u n g sw a su s e di no r d e rt os c r e e n j i i gt h e m y x o b a c t e r i a d u r i n gt h es c r e e n i n go fm y x o b a c t c r i a , d u oj u n l i n g , c o r l i n gf a c t o ra n d s t e nw e r eu s e dt oi n h i b i tp r o d u c t i o no ff u n g u s h e a t i n gt r e a t m e n tw a su s e dt o i n h i b i tp r o d u c t i o no fh e a t - l a b i l em i x e db a c t e r i aa n df r e e z i n gt r e a t m e n tw e r eu s e dt o i n h i b i tv c i x n c s * sp r o d u c t i o na n dp r o d u c t i o no fb a c t e r i at h a tc a n tb e a rt h e f r e e z e - t h a w i n ga g a i na n da g a i n i na d d i t i o n , s e l e c t i v em e d i u ms u c ha sv y 4m e d i u m , c e l l u l o s em e d i u ma n dw c xm e d i u mw 哪u s e df o re n r i c h i n gm y x o b a c t e d a d u r i n gt h e 3 四川大学硕士学位论文 r e s e a r c h i n gt h r e es l r a i n sh a v eb e e no b t a i n e d i no r d e rt oi d e n t i f yt h em y x o b a c t e r i a , n 、f 4c u l t u r em e d i u m c e l l u l o s ec u l t u r em e d i u r n , w c xc u l t u r em e d i u ma n d e l e c t r o n m i c r o s c o p ea n dl bm e d i u mw e r eu s e d t h e s t r a i n sw c t i op r e l i m i n a r y c l a s s i f i e da sa n g i o c o c c u sg e n e r i ca c c o r d i n gw i t ht h e i rm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r s , i n c l u d i n gf r u i t i n gb o d i e s ，c o l o n y , m y x o s p o r e sa n dv e g e t a t i v ec e l l s a l lt h e s es t r a i n s o fm y x o b a c t e r i aw e i e1 1 e ws t r a i n so fm y x o b a c t e r i ab e c a u s et h e yh a v en o tb e e n r e p o r t e du n t i lt o d a y i ti sd i s c o v e r e dt h a td u oj u u l i n g , c u r l i n gf t o ra n dc a n e s t e na l li n h i b i t sp r o d u c t i o n o ff u n g u sa n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c to fd u oj u u l i ni sb e t 吼d u oj u n l i n gi sa g r i c u l t u r e m e d i c a t i o na n di ti sc h e a l x e a s yt oo b t a i na n dt i t t l et o x i c i t yt h a na c t i n o n et h a tw a sn p o n e d p r e v i o u s s od u oj u n l i n gi sw o r t hs p r e a d i n g i nt h i s s e a r c h i n g ，曲忙n o 1m y x o b a c t e r i a ( a n g i o c o c c u s 置p ) w a ss t u d i e da n d r e s e a r c h e dm a i n l y i ti sd i s c o v e r e dt h a ti t sl o g a r i t h m i cp h a s ei sf r o m3 5h o u r st o1 1h o u r s a n dt h eo p t i m u mi n i t i a lp hi s7 2 2a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ei s3 4o c a tt h eg a m e t i m e ，t h ea n t i b i o t i co fi t sc e l l si n t e r i o ra n de x t e r i o rw a sd e t e c t e db yf i l t e rp a p e r m e t h o d b o t ht h ei n t e r i o ra n de x t e r i o rm a t t e ro fc e l lh a sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n d t h e yh a v ed i f f e r e n ta n t i b i o g r a m t h ec e l l se x t e r i o rm a t t e ri n h i b i t st h eg r o w t ho f c c a m - p o s i t i v eb a c t e r i as t r o n g l y t h ec e l l si n t e r i o rm a t t e ri n h i b i t sb o t ht h eg r o w t ho f f l o m l ，g r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aa n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a , s u c h 弱e s c h e r i c h i a c o l i , b u t t h eb a e t e r i o s t a t i c a c t i v i t y t o g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i ai sm o r e p o w e r f u l n e i t h e rt h ei n t e r i o rn o re x t e r i o rm a t t e ro ft h ea n g i o c o c c u ss p c e l li n h i b i t s f u n g u s a f t e rt h ec e l l se x t e r i o rm a t t e rw a se v a p o r a t i o nt od r y n e s so i l6 0 i ti sd i s s o l v e di n d i s t i l l e dw a t e r a n dt h e nt h ea n t i b i o t i co ft h en o 1s t r a i n se x t e r i o rw a si s o l a t e db y l i q u i dp h a s ee x t r a c t i o n s , t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n ds i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a na n t i - s t r e p t o m y c e sm i c r o f l m , u sa c t i v es i n g l ec o m p o n e n tw a s o b t a i n e d i no r d e rt oi d e n t i f yt h ea c t i v ec o m p o n e n t , m a n ym e t h o d sw e i eu s e d ，s u c ha s 印协硌c o p y ，b i u r e tm e t h o d ，p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) , t r i c h l o r o a c e f i ca c i d s e d i m e n t , m o l i s c hr e a c t i o n , a n t h r o n er e a c t i o n , a n ds oo m i ti s d i s c o v e r e dt h a tt h e r ei st h e m a 】【i i n mp h o t o - a b s o r p t i o no n 入= 2 7 0 n ma n di ti sp r e l i m i n a r yc l a s s i f i e da sd e r i v a t e 4 四川大学硕士学位论文 o f a l d e h y d eg r o u po rk e t o n eg r o u p b e c a u s eo ft h eb e t t e rh e a tr e s i s t a n c e , t h eb e t t e rs t a b i l i t y , t h eb e t t e rw a t e rs o l u b i l i t y , t h e p o w e r f u lr e s i s t a n c et og r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aa n dh a v i n ga c t i v i t ya f t e r3m o n t h si n4o c r e f r i g e r a t o r , t h ec e l l se x t e r i o rm a t t e ro fn o 1s t r a i n si sv e r yw o r t hs t u d y i n ga n d r e s e a r c h i n g i ti sa l s of o u n dt h a tt h ec e l l si n t e r i o rm a t t e ro ft h en o 3s t r a i n sc a ni n h i b i tt h e p r o d u c t i o no fe s c h e r i c h i ac o l it o o a nt h e s ei n d i c a t et h a tt h er e s e a r c h i n gw o r ko ft h e3 m y x o b a c t e r i as t r a i n si sak i n do f u s e f u la n do r i g i n a lw o r k k e yw o r d s ：m y x o b a c t e r i a ，n e ws t r a i n s c h a r a c t e r i z a t i o no fg r o w t h , a n t i b i o t i c a c t i v i t y , p u r i f i c a t i o n 四川大学硕士学位论文 前言 黏细菌属于原核生物，是一类可滑动的、专性好氧的具有复杂多细胞行为 的单细胞革兰氏阴性杆菌【l 】，共1 2 个属，4 0 多个种。营养细胞杆状，柔软，无 坚硬的细胞壁，无鞭毛，包埋在坚韧程度不同的粘液层中，在固体表面或气一 水交界面上能缓慢滑动，其生活史包括营养细胞阶段和休眠体( 子实体) 阶段。 营养细胞发育到一定阶段，在适宜条件下，细胞聚集并形成由细胞和粘液组成 的子实体，因种属不同而形状各异。常具红、黄等鲜艳的颜色，肉眼可见。在 子实体中，细胞变成休眠细胞，称为粘孢子( m y x o s p o r e ) 。有些属中粘孢子 与营养细胞无显著区别，有些属的粘孢子折光性强，并包有荚膜。子实体可以 仅仅是一团松散的粘液和粘孢子的球状块，也可以形成一定形状的孢子囊柄和 子实体壁的复杂形体，与营养细胞相比，粘孢子对干燥、声波振荡、紫外线和 热的抗性较强，但耐热力不及芽孢。黏细菌生长缓慢，细胞分化发育行为与多 细胞真核生物更为相似，是研究细菌细胞多细胞行为、细胞信号传导与调控， 以及生物进化的很好的模式材料【2 】。 黏细菌随处可见，在温暖、半干燥、干燥环境中可大量生存，如亚热带和 温带的大草原、半沙漠地区。黏细菌的生活环境有土壤，腐烂的植物，食草动 物的粪便、活或死的树皮及新鲜的水。它们是有机化能营养型，能分解很多不 同的生物大分子。根据营养方式，黏细菌可简单分为两个生理类群：溶细菌群 和溶纤维素群。溶纤维素群黏细菌可分解纤维素，目前己确认的只有一个属一 个种，即纤维堆囊菌；溶细菌群黏细菌能高效率地分解酵母、大肠杆菌等微生 物的整个细胞和各种成分，包括黏球菌属、孢囊杆菌属、珊瑚球菌属、囊球黏 菌属等。黏细菌不仅在细胞分化、发育和生物进化研究中占有重要地位，而 且近年来作为一种可产生丰富而有用的次级代谢物的微生物类群逐渐受到世 界青睐，其中有些可抗细菌、有些可抗真菌、有些抗癌、有些溶栓等，这对于 药物的研发具有重要意义【3 j 。至今为止，已经发现黏细菌产生了几百种结构不 同的化合物，这些化合物中的许多是以前从未发现过的| 4 1 。在原核生物中，按 6 四川大学硕士学位论文 已发现生物活性物质的数量，黏细菌仅排在放线菌和芽孢杆菌之后，而其产抑 菌活性的阳性菌率高于放线菌。黏细菌产生生物活性物质的主要特点有：( 1 ) 种类多，包括芳香族、杂环类、醌类、大环类、聚醚类、多烯类、肽类化合物 等；( 2 ) 结构新，很少和其他微生物产生的相同；( 3 ) 一株菌可以产生一种基本 结构的许多衍生物；( 4 ) 菌株特异性而不是种属特异性，同种的不同菌株产生生 物活性物质的差异较大，某些生物活性物质的产生菌的分布可跨越种、属，甚 至科的界限；( 5 ) 不同类别的多种生物活性物质可由一个菌株同时产生；且许多 生物活性物质作用于真核细胞。黏细菌产生的生物活性物质的类型有：( 1 ) 引起 细胞微管超稳定的e p o t h i l o n e s 。( 2 ) 呼吸抑制剂( 主要是电子传递抑制剂) m y x o t h i a z o l 。( 3 ) 核酸合成抑制剂d i s o r a z o l 。( 4 ) 蛋白质合成抑制剂如 m y x o v a l a r g i n 、a l t h i o m y c i n 。( 5 ) 干扰糖类代谢的a m b r u t i c i n 等【2 1 】。在传统微生 物学方面，已有研究利用传统的抗生素发酵方法优化调节菌体发酵条件，提高 活性物的产量，还可以改变化合物的种类；在分子生物学方面，研究主要在生 物合成途径的分析、模块基因功能的研究、异源表达和基因簇的遗传改造方面。 其中，对e p o t h i l o n e s 的研究较成熟，已有报道将全部e p o t h i l o n e s 基因簇克隆并在 放线菌z t p 7 t t o w z oz o h z 0 九o pc h 9 9 9 q a 表达产生e p o t h i l o n e sa 和b ，与生 长缓慢的纤维堆囊菌相比，放线菌比e p o t h i l o n e s 的天然产生菌生长速度快1 0 倍， 而且更易于基因操纵，有望提高e 砌i l o s 的产量1 4 】。 但分离纯化黏细菌相当困难和耗时，并且难于培养，同时方法特殊。一般 情况下，分离一株黏细菌需要几个月的时间，有些类群如纤维堆囊菌的分离纯 化一般需要1 2 年的时间【5 】，这极大地限制了对这类微生物物种资源的开发，以 致其应用研究较其它的微生物类群更为落后。所以，探索更好的分离纯化黏细 菌的方法非常重要。 本研究用多菌灵、灰黄霉素、克霉唑抑制霉菌、丝状真菌等真菌的生长从 纯食草兔粪中分离出3 株嗜细菌群黏细菌，并初步鉴定为囊球黏细菌( 这三株 菌在我国乃至世界黏细菌资源库中还没有，被初步认为是新菌株，已经申请了 专利保护) ，同时从1 号菌胞外及胞内都发现了抗茵活性物质，且抗菌谱不同， 加之胞外抗菌活性物耐热性、稳定性和水溶性均较好，所以本研究具有新颖性 和实用性价值。 7 四川大学硕士学位论文 1 材料与仪器 1 1 材料与试剂 1 1 1 兔粪 采自四川成都文家场盐井村( 属纯喂草家兔粪便) ，风干后马上使用。 1 1 2 化学试剂和材料 多菌灵：徐州锐农农化有限公司 灰黄霉素：西安利君制药股份有限公司 克霉唑软膏：河南省新乡同心制药厂 安琪酵母( b r ) ：湖北安琪酵母股份有限公司 琼脂粉( b r ) ：天津市大茂化学试剂厂 纤维素粉( b r ) ：北京大学生物系二厂 维生素b 。：上海伯奥生物科技有限公司 氯化钠( a r ) ：成都市方舟化学试剂厂 胰蛋白胨( b r ) ：北京奥博星生物技术责任有限公司 牛肉膏( b r ) ：北京奥博星生物技术责任有限公司 磷酸氢二钾( a r ) ：成都化学试剂厂 二水合氯化钙( a r ) ：天津市天达净化材料精细化工厂 实验用蒸馏水：四川大学药学院华星公司 柱层析用硅胶( 工业品，2 0 0 一3 0 0 目) ：青岛海浪硅胶干燥剂厂 乙酸乙酯( a r ) ：成都市方舟化学试剂厂 冰醋酸( a r ) ：天津市瑞金特化学品有限公司 无水乙醇( a r ) ：成都市方舟化学试剂厂 氯仿( a r ) ：天津致远化学试剂有限公司 8 四川大学硕士学位论文 丙酮( a r ) ：上海有机化工试剂研究所 石油醚( a r ) ：天津市致远化学试剂有限公司 d 一萘酚( a r ) ：中国停新化工试剂厂 磷酸二氢钾( ：天津市瑞金特化学品有限公司 甘氨酸( ：天津市博迪化工有限公司 4 0 甲醛溶液( a l 酌：成都市方舟化学试剂厂 戊二醛( a r ) ：天津市科密欧化学试剂开发中心 甲醇( a l 妫：成都市方舟化学试剂厂 浓硫酸( a r ) ：成都市欧海兴化工试剂厂 葸酮( m u ：天津市科密欧化学试剂开发中心 结晶硫酸铜( a r ) ：成都化工试剂厂 柠檬酸三钠( a r ) ：成都化学试剂厂 无水碳酸钠( a r ) ：天津市博迪化工有限公司 氢氧化钠( a r ) ：天津市致远化学试剂有限公司 牛血清白蛋白：上海伯奥生物科技有限公司 三氯醋酸( a r ) ：天津市科密欧化学试剂开发中心 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ：天津市科密欧化学试剂开发中心 丙烯酰胺( a r ) ：成都科龙化工试剂厂，进口分装 甲叉双丙烯酰胺( a r ) ：天津市化学试剂研究所 双蒸水：自己在实验室烧的 过硫酸铵( a i i ) ：成都市方舟化学试剂厂 考马氏亮兰g 2 5 0 、r 2 5 0 ：上海化学试剂采购供应站 硅胶g 和羧甲基纤维素：上海化学试剂采购供应站 薄层硅胶板( 化学纯) ( 5 0 x 2 0 0 m m , 厚度：0 2 一o 2 5 r a m ) ：青岛海浪硅胶 干燥剂厂制造 镁粉( a r ) ：天津市福晨化学试剂厂 香草醛( a r ) ；天津市科密欧化学试剂开发中心 脱脂奶粉：武汉大学保藏中心提供 浓盐酸( a r ) ：成都市欣海兴化工试剂厂 葡萄糖( a r ) ：市售 9 四川大学硕士学位论文 蔗糖( a r ) ：天津市化学试剂六厂三分厂 混合纤维微孔滤膜：孔径( o 4 5l im ) ，上海市新亚净化器件厂 微孔过滤器( 由= 3 e r a ) ：市售 结晶紫：南京奥佳化工有限公司 草酸铵：南京奥佳化工有限公司 碘片：市售 碘化钾：上海化学试剂采购供应站试剂厂 番红：市售 1 1 3 供试菌株 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l d ：成都大学医护学院微生物实验室提供。 酿酒酵母( s a c c h a r o 口y c e sa r l s b e r g e n s i s ) ：四川大学生命学院植物生 殖工程实验室提供。 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u sh u r i n g i e n s i s ) ：四川大学生命学院植物生殖 工程实验室提供。 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ：四川大学生命学院植物生殖工程实 验室提供。 5 4 0 6 放线菌( s t r e p t o 四y c e sm i c r o f l av u s ) ：四川大学生命学院植物生殖 工程实验室提供。 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) ：四川大学生命学院植物生殖工程实验室提 供。 柑橘绿霉【p e n i c i l l i u ai t a l i c u 嘧w e h m e r , 只d i g i t a t u r n 纯，】：四川大学 生命学院植物生殖工程实验室提供。 1 2 仪器 j s m - 5 9 0 0 l v 型扫描电子显微镜：日本电子公司 x s p 1 6 a 光学显微镜：江南仪器厂 s w - c j 1 f 洁净工作台；苏净集团安泰公司 h h b ll 电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械厂 1 0 四川大学硕士学位论文 t h z c 恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂 y b 电子天平：上海良平仪器仪表有限公司 千分之一电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司 p h s 一3 c 精密p h 计：上海雷磁仪器厂 t h z c 恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂 w s 2 8 4 6 4 手提式高压蒸汽消毒器：上海医用核子仪器厂 u l tf r e e z e r - 美国t h e r m of o r m a 公司 t h z - 9 2 a 台式恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂 7 5 1 一g w 分光光度计：安捷伦科技上海分析仪器有限公司 m o d e l - 3 旋转蒸发器：上海医械专机厂 l d 5 - 2 a 型低速离心机：北京医用离心机厂 循环多用真空泵：郑州杜甫仪器厂 玻璃仪器气干燥器：郑州杜甫仪器厂 玎) _ 之核酸蛋白检测仪：上海沪西分析仪器厂 f d 一1 型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司 高频电火花真空检测仪：北京牧晨科技有限公司 d y y _ 一iii2 8 a 型垂直板电泳槽：北京市六一仪器厂 电泳仪：北京市六一仪器厂 j u - - 2 a 型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司 c s l 0 11 型电热鼓风干燥箱：重庆试验设备厂 立式染色缸( 5 片) ：市售 卧式展开槽( 2 5 x 6 4 c m ) ：市售 玻璃碘缸( 1 4 x 2 0 c m ) ：市售 4 3 5 c m 具塞玻璃层析柱：市售 喷瓶( 5 0 m 1 ) ：市售 微量加样器( 2 0 0 u1 ) ：金花牌 微量加样器( 1 0 0 0 | l1 ) ：金花牌 分液漏斗( 1 2 5 m 1 ) ：蜀牛牌 1 8 1 0 b 型石英管加热式自动纯水蒸馏器：上海玻璃仪器一厂 四川大学硕士学位论文 2 黏细菌的筛选与鉴定 2 1 培养基 2 1 1 安琪酵母水培养基 安琪酵母o 2 ，琼脂粉1 5 ，p h7 2 2 1 2 v y l 4 培养基 安琪酵母0 2 5 ，c a c l 2 2 h 2 0o 1 ，维生素b 1 20 5o g m l ，琼脂粉1 5 ， p h 7 2 2 1 3 纤维素培养基 纤维素粉1 5 ，多菌灵3 0 1 t g m l ，琼脂粉1 5 ，p h7 2 2 1 4 们x 培养基 c a c 1 2 2 1 - 1 2 0o 1 ，多菌灵3 0 1 a g m l ，琼脂粉1 5 ，p 1 4 值7 2 2 1 5 l b 液体培养基 胰蛋白胨1 ，酵母膏o 5 ，氯化钠1 ，p h 值7 0 。 2 1 6 牛内膏蛋白胨培养基 牛肉膏o 3 ，蛋白胨l ，n a c l o 5 ，琼脂粉1 5 ，p h 值7 2 四川大学顽士学位论文 2 1 7 土豆培养基 土豆( 去皮) 2 0 ，蔗糖2 ，琼脂粉1 5 ，p h 自然 2 2 黏细菌的筛选方法 2 2 1 黏细菌的初步分离 2 2 1 1取兔粪适量，分别用抗真菌药( 3 0m l 的多菌灵、6 0m g l 的灰黄霉素、 6 0m g 几的克霉唑溶液) 浸泡6h 。 2 2 1 2 将2 2 1 1 中得到的兔粪分别接种于安琪酵母水培养基中( 为减少霉菌等 真菌的污染，培养基中以浸泡样品时所用抗真菌药的种类分别加) k 3 0 1 u g m l 的多 菌灵、6 0 扯g m 1 的灰黄霉素、6 0 b g m 1 的克霉唑) ，置3 0 。c 孵箱恒温保湿培养， 并及时挑取疑是黏细菌的茵落( 颜色鲜艳、光亮的菌落) ，转接于含v y 4 培养基 的平板上，继续置3 0o c 恒温保湿培养。 2 2 2 黏细菌的进一步分离纯化 2 2 2 1 平板划线稀释法 象2 2 1 2 中一样及时挑取疑似黏细菌的菌落边缘的细菌，反复转接于含 v y 4 培养基的平板上，3 0o c 恒温保湿培养。 2 2 2 2 低温反复冻融处理：将经过2 2 2 1 处理得到的单菌落接种于v y 4 斜面培 养基上，置- - 8 0 冰箱冷冻4 8h ，取出放至室温后立即转接于v y 4 培养基上， 3 00 c 恒温保湿培养，反复3 次，除去可能存在的蠕虫以及不耐反复冻融的细菌。 2 2 2 3 加热处理 将2 2 2 2 得到的生长在v y 4 培养基上的疑似黏细菌菌落连同斜面一起置于 5 8o c 的孵箱恒温保湿培养3 0 m i n ，然后放至室温，转接于v y 4 培养基上，3 0o c 孵箱培养。这样可除去一些不耐热的杂菌，如大肠杆菌等。 2 2 2 4 筛选噬细菌群黏细菌 2 2 2 4 1 菌悬液的配制 1 3 四川大学硕士学位论文 将酵母菌接种在3 支土豆培养基斜面上，3 0a c 恒温保湿培养2 4h ，然后向其 中2 个斜面中分别加入2 m l 无菌水，用无菌竹片刮下菌落制成菌悬液，将菌悬液 倒入5 m l 安瓿瓶中1 2 1o c 加热2 0 m i n 使菌悬液中的酵母菌全部死亡，制成死酵母菌 悬液。同时分别向一支酵母菌斜面和一支大肠杆菌斜面( 牛肉膏蛋白胨培养基) 中加入2 m l 无菌水，用无菌竹片刮下菌落制成菌悬液，将菌悬液倒入5 m l 安瓿瓶 中制成活的酵母菌和活的大肠杆菌菌悬液。 2 2 2 4 2 用玻璃棒分别攒取活的酵母菌、大肠杆菌及死的酵母菌菌悬液，分别 在w c x 培养基上划交叉线，然后将2 2 2 3 得到的v y 4 培养基上的疑似黏细菌菌 落转接于划线处，3 0o c 恒温保湿培养4 d 观察在划线处是否有黏细菌可疑菌落出 现。除筛选噬细菌群黏细菌外，此方法也起鉴定噬纤维素群黏细菌的作用。将 划线处的可疑黏细菌菌落转接于v y 4 培养基上。 2 2 3 黏细菌的纯度检验 2 2 3 1v y 4 培养基验纯 将分离得到的黏细菌用交叉划线法涂布在v y 4 平板上，观察是否有杂菌生 长。 2 2 3 2l b 液体培养基验纯 挑取经多次纯化的菌落接种于l b 液体培养基中，3 0o c ，1 0 0 r p m 恒温震荡培 养4 8h ，观察培养液是否混浊【5 1 ，如果培养基浑浊则证明有杂菌，如果澄清则证 明已经纯化( 黏细菌在l b 液体培养基中不生长) 。 2 3 黏细菌的鉴定方法 2 3 1 通过培养基鉴定、分类 2 3 1 1v y 4 培养基鉴定 将分离得到的黏细菌涂布在v y 4 平板上，3 0o c 恒温保湿培养4 d ，观察菌落是 否滑动、是否产生黏液、菌落的形状、子实体的颜色等。 2 3 1 2 纤维素培养基鉴定 将疑似黏细菌的单菌落接种于纤维素培养基上，3 0 。c 恒温保湿培养4 d 。如 果能在纤维素培养基上生长说明可能属于嗜纤维素群黏细菌。 1 4 四川大学硕士学位论文 2 3 1 3w c x 培养基上鉴定 如同2 2 2 4 一样分别用活酵母菌、死酵母菌及活大肠杆菌在w c x 培养基上 划交叉线，然后将疑似黏细菌的单菌落接种于划有交叉线的w c x 培养基上，3 0 o c 恒温保湿培养4 d 。如果能在划交叉线的w c x 培养基上生长则可能是嗜细菌群 黏细菌。 2 3 1 4l b 液体培养基鉴定【1 2 】 如同2 3 2 ，将疑似黏细菌的单菌落接种于l b 液体培养基中，3 0o c ，1 0 0 r p m 恒温震荡培养4 8h ，观察其是否生长，如果不生长则证明可能属于黏细菌( 黏细 菌在l b 液体培养基中不生长) 。 2 3 2用革兰氏染色法鉴定 参照文献 6 】将所得菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察其属于革兰 氏阳性还是属于革兰氏阴性。 2 3 3 用电子显微镜鉴定、分类 在扫描电子显微镜下观察分离到的疑是黏细菌菌株【7 l 选取新培养的生长良好的己进入稳定期( 培养了3 5 d ) 的疑是黏细菌斜面， 用接种环将细菌涂于盖玻片上( 盖玻片上先加上无菌水) ，将盖玻片在酒精灯上 轻轻烘烤，烘干水分后分别把涂有细菌的盖玻片放入4 o 的戊二醛( o 2 m p h 7 2 磷酸缓冲液2 5 m l ，2 5 戊二醛水溶液8 m l ，双蒸水1 7 m 1 ) 中固定4 小时，用0 2 m p h 7 2 磷酸缓冲液冲洗掉多余的戊二醛，然后进行脱水处理( 分别把盖玻片依次放入 装有3 0 、5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 、1 0 0 、1 0 0 乙醇的染色缸中， 每种浓度的乙醇中均放置1 0 分钟) ，取出，自然凉干后送至四川大学分析测试中 心扫描电子显微镜室，液态c 如临界点干燥，镀金抽真空后观察其形态。 2 4 结果 2 4 13 株菌形态特征及生理生化特性 经过大量、多次筛选，最终得到3 株菌，其形态特征及生理生化特性见表1 、 图1 、表2 。 四川大学硕士学位论文 表1 筛选得到的3 株细菌与伯杰氏手册描述的黏细菌的形态及生理生化特征 1 号菌 2 号菌3 号菌 图13 株细菌在- w 4 液体培养基中的生长情沉 从表l 和图l 可以看出，分离到的3 个菌株均符合黏细菌的特征，同时由于这 3 株菌的子实体颜色不同，次级代谢物的颜色、气味及抗菌活性也不同，再加上 这3 株菌的生长周期不同( 1 号菌需要4 5 d 才能长出子实体，2 号菌和3 号菌需要 的时间相差不大，需要3 4 d 就可长出子实体) ，所以它们属于不同的黏细菌菌 株。 1 6 四川大学硕士学位论文 寰2 筛选得到的3 株菌与伯杰氏手册描述的噬细菌群黏细菌在不同培养基上的生长情况 根据噬细菌群黏细菌可以分解活的或死的细菌、真菌，不能分解纤维素的 特征，从表2 可以看出，我们分离到的3 个菌株均符合噬细菌群黏细菌的特征。 2 4 23 株菌的子实体及菌体的显微结构 电子显微镜下看到的3 株菌的子实体、孢子及菌体如图2 、图3 、图4 及表3 。 图2 1 号黏细菌子实体的扫描电镜图b a r s ：5 pi l l 1 7 四川大学硕士学位论文 圈3 2 号黏细菌子实体的扫描电镜图b a r s = 1 _ 图4 3 号黏细菌子实体的扫描电镜图b a r s = 5 pi l l 1 8 四川大学硕士学位论文 图5 中国黏细菌资源库中的囊球黏细菌属( a n g i o c o c c u s ) 表33 株麓与伯杰氏手册描述的囊球黏细菌扈的菌体，子实体，孢子体的对照表 由图2 、图3 、图4 、图5 及表3 得知这3 株菌均属于嗜细菌群黏细菌的囊球黏 细菌属( a n g i o c o c c u s ) 。 1 9 四川大学硕士学位论文 2 5 黏细菌的保存 所得黏细菌菌株的保存采取以下几种方法： 2 5 1 用w 4 斜面培养基保存 将菌体接种于v y 4 斜面培养基上，培养3 4 d ，待长出子实体或特征性菌落 后，将斜面存放在4o c 冰箱中保存，然后每3 个月转接一次。 2 5 2 用液体石蜡封存 将消过毒的液体石蜡( 1 2 1 。c ，2 0 分钟) 缓慢加入新培养的生长良好的被试 菌株的v y 4 斜面中，然后放入4o c 冰箱保存，每年转接一次。 2 5 3 利用消毒兔粪保存 在含有纯黏细菌的平板上重新放入经过高温消毒( 1 2 1 。c ，2 0 分钟) 的食草兔 粪，3 0o c 培养5 8 d ，当成熟的子实体出现以后，把长有子实体的兔粪放入真空 干燥器保存 2 2 1 ，每年转接一次。 2 5 4 低温冻干保存 用