（分析化学专业论文）毛细管电泳分离多酚及其与化学发光联用的研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文 中文摘要 中文摘要 本论文综述了毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 的分离模式、化学 发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 分析的原理、发光体系分类，以及与毛细管电 泳联用的研究现状和最新进展。指出将c e 的高分离性能和c l 的高灵敏检测性 能结合，c e c l 联用技术已经成为一种较理想的分离分析技术，也是分析化 学近十几年来的研究热点之一。但是，由于c e 和c l 联用需要使用引入发光 辅助试剂的接口，接口的设计影响到发光的灵敏度和分离性能。本文设计了一 种狭缝式c e c l 联用接口，并应用于实际样品多酚物质的分离检测。为了更 进一步分离多酚物质，本文还用t w e e n2 0 一胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a r e l e e 仃o k i n e t i ec a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h , m e k c ) 方法分离了其他方法难以分离的 两种多酚。最后，本文探讨了一种制备型的微柱电泳。具体研究工作如下： l ，研制了新式的狭缝式c e c l 联用接口，实现了分离毛细管和反应毛 细管在显微镜下快速、精准对接。用内径1n l l n 的石英管作为发光试剂流路， 又作为检测光信号窗口。石英管的应用使引入发光试剂所需要的接口制作简便。 由于分离毛细管和反应毛细管内径接近，所以样品从分离毛细管进入反应毛细 管时扩散小，对峰宽的影响小，是一种较理想的c e c l 联用接口。制作玻 璃砂芯片将高电位电极池分隔成两部分：一部分含鲁米诺的缓冲溶液，放置毛 细管入口端；另一部分仅含缓冲溶液，放置电极。隔离池有效阻止了鲁米诺的 电解，解决了支持缓冲液中鲁米诺电解造成的发光信号漂移问题，避免发光试 剂的损耗，并延长缓冲溶液的使用时间，也解决了鲁米诺电解造成的电流增大 问题。 2 ，将狭缝式c e c l 联用接口用于烟草中多酚物质的测定。实验测得芦丁、 绿原酸、槲皮素和咖啡酸的检出限分别为：3 7 x l o - 9 、6 4 x l o - 8 8 5 x 1 0 一、1 3 x l o - 1 0 m o l l ，比套式接口检测多酚物质的检出限( 1 0 巧m o l l ) 降低了二、三个数量级。 3 ，分别用s d s 、t w e e n2 0 、t w e e n8 0 三种表面活性剂作为胶柬和混合胶 束，用毛细管胶束电动色谱分离分析莨菪亭、芸香苷、七叶亭、咖啡酸和绿原 酸。发现只有采用t w e e e n2 0 的m e k c 法可以使芸香苷和七叶亭分离。对分离 中国科学技术大学博士学位论文 中文摘要 条件，包括分离电压、p h 、t w e e n2 0 、甲醇以及n a 2 8 4 0 7 浓度进行系统研究， 最后对三种秦皮中草药实际样品进行了五种多酚物质的定量测定。鉴于莨菪亭、 芸香苷、七叶亭在s d s 、t w e e n8 0 胶束电动色谱中难以分离，用示差分光光 度法测定了t w e e n 2 0 与芸香苷和七叶亭的反应平衡常数和结合比，反应平衡常 数分别为4 5 3 x 1 0 5 和2 2 3 x 1 0 5 ( l t o o 炉，结合数均为n - - - 2 。结果表明吐温 2 0 - m e k c 分离三种多酚是基于多酚与吐温2 0 结合作用和电泳淌度的差异。 4 ，制作内径为2 2m m 的电泳微柱，用1 0 0 1 2 5 岫石英砂填充进石英玻璃 管，两端用柱塞防漏。比较了多孔尼龙、水玻璃、玻璃砂芯柱塞，实验结果证 明水玻璃和玻璃烧砂芯柱塞吸附严重，而尼龙柱塞吸附小、不产生气泡。在1 5 0 0 v 电压下分离氨基酸样品，结果峰型对称。色氨酸、组氨酸检出限分别为0 9 ， 2 ，8p m o l l ( o 3 0 ，0 2 7r a g l ) ，较毛细管电泳有明显改善。2 2n l n l 内径石英 砂填充微柱电泳限制了热效应，柱容量大，检出限低，可使用常规分析仪器检测， 是一种制备型的微柱电泳。 电泳 关键词：毛细管电泳胶束电动毛细管色谱化学发光多酚物质微柱 中国科学技术大学博士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) c o u p l e dw 硒c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) d e t e c t i o n h a v ec e r t a i n a d v a n t a g e s o fh i 曲s e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n ds e n s i t i v i t y i nt h i s d i s s e r t a t i o n t h ei n s m u n e n t a ld e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fc ld e t e c t i o ni nc e w l e l er e v i e w e d i nt h el a s t1 0y e a r s ，t h ee x t e n s i v ew o r ko fc e - c lw a ss t u d i e d h o w e v e r , o n eo ft h em o s tf o r m i d a b l ec h a l l e n g e si na p p l y i n gc ld e t e c t i o nt oc ei s t h eo n - l i n ei n t r o d u c t i o no fc l r e a g e n t si n t ot h es e p a r a t i o ns y s t e m s u i t a b l ei n t e r f a c e s a r ev e r yi m p o r t a n tt oe s t a b l i s has u c c e s s f u lc e - c ls y s t e m i nt h i sp a p e r , an o v e l i n t e r f a c ef o rc ec o m b i n e dw i l l lc lw a sd e v e l o p e da n du t i l i z e dt os e p a r a t e p o l y p h e n o l s ak i n do fm i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h yo 订e k c ) u s i n gp o l y o x y e t h y l e n es o r b i t a nm o n o l a u r a t e ( t w c e n2 0 ) w a si n t r o d u c e df o rt h e s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no ff i v ep o l y p b e n o l sa l s o 。a tl a s t ，am i c r o c o l u r r mw a s p r e p a r e db yf i l l i n gw i t hq u a r t zs a n do f1 2 0 - 1 5 0 啪i n a2 21 1 1 1 1 1i d q u a r t zt u b ea n d a d o p t e dt os e p a r a t ea m i n oa c i d s 啊r e s e a r c ht o p i c sa r ed i s c u s s e di nd e t a i l e da s f o l l o w s ： 1 an o v e lo n - l i n ec h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t o rw a sd e s i g n e df o rc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ag a pi n t e r f a c ew i t hh e i g h ti n j e c t i o nw a sm a d eb yt w oc a p i l l a r i e s ， w h i c hw e r ep l a c e di nc l o s ep r o x i m i t yb yc a r e f u lm i e r o p o s i t i o n i n g ，a n dt h ed i s t a n c e be | 懈nt h ec a p i l l a r i e sw a s5 0 眦la p p r o x i m a t e l y t h ep r e p a r a t i o np r o c e s s e so ft h e g a pi n t e r f a c ew e r ee a s yw i t ha no r i e n t e dc a p i l l a r y , w h i c hw a se l i m i n a t e da f t e rt h e g a pp r e p a r a t i o n t h eg a pi n t e r f a c ew a sc a r e f u l l yi n s e r t e di n t oa1 0 r k r ni d q u a g z t u b e ，a sad e t e c t i o nw i n d o ws i t u a t e dj u s ti nf r o n to fap h o t o m u l t i p l i e rt u b e ( p m l ) ， a n da r e a g e n tt u b es u r r o u n d e db yc lr e a g e n ts o l u t i o n a l l i g hp o t e n t i a lb u f f e rr e s e r v o i rw a sc o n s t r u c t e df r o mar u n n i n gb u f f e rc e l la n d 触e l e c t r o d eb u f f e ro n e ，w h i c hw e r ej o i n t e dw i t haf l i t ，i no r d e rt oa v o i dt h el u m i n o l e l e c t r o l y s i s ，t h ee x c u r s i o no fc h e m i l u m i n e s c e n c eb a s e l i n e ，a n d t h ei n c r e a s eo f e l e c t r i cc u r r e n ti nc e c l 2 t h ec e c ls y s t e mw a se m p l o y e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff o u rp o l y p h e n o l s l 中国科学技术大学博士学位论文英文摘要 i nc i g a r e t t e s a m p l e s t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o fm t i n , c h l o r o g e n i ca c i d ， q u e r c e t i na n dc a f f e i ca c i dw e r e3 7 1 0 - 9 , 6 4 x 1 0 - s , 8 5 1 0 。8a n d1 3 1 0 一加m o l l r e s p e c t i v e l y , t w oo r d e rm a g n i t u d el o w e rt h a nt h o s er e p o r t e di nt h ep r e v i o u sw o r k 3 as i m p l ea n dc o n v e n i e n tm e t h o do fm e k cu s i n gt w e e n2 0a ss i n g l em i c e l l e a n dm e t h a n o la sb u f f e ra d d i t i v ew a si n t r o d u c e df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f f i v ep o l y p h e n o l s ，i n c l u d i n gs e o p o l e t i n t u r i n ，e s c u l e t i n , c h l o r o g e n i ca c i da n dc a f f e i c a c i d ar u n n i n gb u f f e rs o l u t i o no f p h9 3 ，2 0m m o f ls o d i u mt e t r a b o r a t ec o n t a i n i n g 6 4m m o l lt w e e n2 0a n d9 ( v v ) m e t h a n o lw a sa d o p t e di nt h es e p a r a t i o n f o rr u t i n a n de s e u l e t i nw e r ed i f f i c u l tt ob es e p a r a t e db yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) a n ds d s - b a s e dm e k c ，t w e e n2 0 - b e s e d 如也k cw f l su s e da n dt w op o l y p h e n o l sw c t e s e p a r a t e ds a t i s f a c t o r i l y t h es e p a r a t i o nm e c h a n i s mo ft w e e n2 0 - b u s e dm e k cf o rt h ep o l y p h e n o l sw a s d i s c u s s e dp r e l i m i n a r i l y t h ee q u i l i b r i u mc o n s t a n tko ft w e e n2 0a n dr u t i n ( o r e s e u l e t i n ) i sc a l c u l a t e dt ob e4 5 3 x 1 0 5 ( 2 2 3x l o s ) l 2 m o 产b yad i f f e r e n t i a l s p e c t r o p h o t o m e t r y , r e s p e c t i v e l y a n db o t l lo ft h eb i n d i n gn u n l b e r sw e r e2 i ts h o w s t h a tt h es a t i s f i e ds e p a r a t i o no ft h ep o l y p h e n o l sw a sa c h i e v e db yt h ed i f f e r e n t i n t e r a c t i o nb e t w e e nt w e e n2 0a n dt u r i n ( o re s e u l e f i n ) a n dt h ed i f f e r e n tm o b i l i t y t h ep r o p o s e dm e t h o dw a su s e dt od e t e m a i n et h ep o l y p h e n o lc o m p o n e n t si nt h e h e r b a lm e d i c i n eo fc o r t e x f l a x i n i t h ea v e r a g er e c o v e r i e so f t h ep o l y p h c n o l sr a n g e d f r o m9 5 t ol1 2 i tm e a n st h a tt h ep r o p o s e dm e t h o di ss u i t a b l ef o r t h e s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f t h ep o l y p h e n o l si nt h eh e r b a ls a m p l e s 4 t bo v e r c o m et h ed i s a d v a n t a g e so fc ed u et oi t ss m a l li n n e rd i a m e t e r , s u c ha s p o o rd e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n di o ws a m p l el o a d a b i l i 锣，am i e r o c o l u m nw a sp r e p a r e d b yf i l l i n gw i t h1 0 0 1 2 5i n nq u a r t zs a n di na2 2m i l li d q u a r t zt u b e 办ee f f e c to f e l e c t r i c 丘e l ds t r e n g t ha n dq u a r t zs a n ds i z eo ne l e c t r o o s m o t i of l o wr a t ew a ss t u d i c d n y l o nf i l m sw e r eu s e df i r s t l y 嬲f l i t s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h es e p a r a t i o nr e s m t so f t w oa n l i n oa c i d sw e r es a t i s f y i n gw i t ht h em i c r o c o l u m na n dt h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) w e r ei m p r o v e d ，o f w h i c ht r y p t o p h a na n dh i s t i d i n ew e l e0 3 0a n d0 2 7m 班， r e s p e c t i v e l y t h ee l e c t r o p h o r e t i cs e p a r a t i o no a nb ed e v e l o p e d 雒ac o m p l e m e n t a r y m e t h o df o rc et oi m p r o v et h es a m p l ec a p a c i t ya n dc o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t y k e y w o r d s ：h p c em 匣k cc lp o l y p h e n o l s i v 中国科学技术大学博士学位论文 c a e ： c c e ： c d e k c ： c e ： c e c ： c g e ： c l ： c i e f ： c n p ： c m c ： c t a b ： c z e ： d n p o ： e c l ： e k c ： e o f ： g c ； h p c e ： h p l c ： h r p ： e k c ： l c e ： l i f ： l o d ： m a c e ： m e k c ： m e e k c ： m s ： 缩写 c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ( 毛缅管阵列电泳) m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( 芯片式毛细管电泳) c y c l o d e x t r i ne k c ( 环糊精电动色谱) c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( 毛细管电泳) c a p i l l a r ye l e c t r o e h r o m a t o g r a p h y ( 毛细管电色谱) c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 毛细管凝胶电泳) c h e m i l u m i n e s c e n c e ( 化学发光) c a p i l l a r yi s o e l e e t r i c f o l u s i n g ( 毛细管等电聚焦) c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ( 毛细管等速电泳) c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( 临界胶束浓度) c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( 十六烷基三甲基溴化铵) c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( 毛细管区带电泳) b i s - ( 2 ，4 一d i n i t r o p h e n y l ) o x a l a t e ( 双- ( 2 ，4 - 硝基苯) 革酸酯) e l e c t r o l u m i n e s e e n e eo re l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( 电化学发 光) e l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h ( 电动色谱) e l e c t r o o s m o t i cf l o w ( 电渗流) g a sc h r o m a t o g r a p h ) 7 时， 丧失表面活性。阳离子表面活性荆分子易吸附于熔硅毛细管壁上。常用作e o f 改性剂，可有效减慢e o f 或使e o f 转向【2 6 】。 1 2 3 两性离子表面活性剂 两性离子表面活性剂指分子结构中同时含有阳离子亲水基团和阴离子亲水 基团的表面活性剂。分子中同时存在酸性基和碱性基，易形成“内盐”，碱性基主 要是胺基和季胺盐，酸性基主要是羧基、磺酸基和磷酸基。 两性离子表面活性剂不仅具有普通表面活性剂的性能，而且还具有许多独特 的性质。尤其是其低毒性和对皮肤及眼睛的低刺激性，良好的生物降解性，基本上 无公害和污染，以及耐硬水及高浓度电解质，可吸附在物质界面，而又不生成僧水 矗 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 薄层等许多独特优点，使其成为人们倍感兴趣的产品。s t e c nh o n o f i dh a n s c n 等人 用两性离子表面活性剂和t w c e n2 0 混合【2 4 】，成功分离结构类似的物质，纯化 麻药制品。 1 2 4 非离子表面活性剂 非离子表面活性剂不明显带电，在水溶液中不电离。亲水基主要由一定数 量的含氧基团( 如醚基和羟基) 构成( 见图1 2 中t w e e n2 0 的结构示意图) ，在 水溶液中稳定性高，与其他类型的表面活性剂相容性好。常用的非离子表面活 性剂还有b 埔3 5 ( p o l y c t h y l c n g l y c o ld o d e c y l c t h e r ) 、t a g a t ( p o l y o x y e t h y l e n e ( 2 0 ) g l y c e r o lm o n o o l e a t e ) 等种类。 目前报道的非离子表面活性剂在c e 中的应用主要有以下几点： l ，在m e k c 中常与离子型表面活性剂混合，形成混合胶束体系，如毛地 黄皂苷- - s d s 体系, t w c e n2 0 - - s d s 【2 5 2 8 ，3 1 1 。 2 ，未明确其在缓冲溶液中的状态是否呈胶束状，做为缓冲溶液添加剂使用， 也可以改善分离度。l i h o n gl i u 等人【3 2 】在缓冲液中加t w e c n2 0 ，内标法分离药 品中防乙醇灵( f a n g c h i n o l i n e ) 和粉防己碱( t e t r a n d r i n e ) 。s h u - p i n gw a n g 等人 3 3 】分 析化妆品中的苯甲酮，加t w e e n 2 0 以提高分离度。j i n j i ey a n g 等人 3 4 】分离中药 中防乙醇灵和粉防己碱，p h 用三乙胺调节到2 5 ，其缓冲液中含5 0 m m o l l t w e e n - 2 0 和2 0 甲醇。o e o f f 瓦p a l e r s o n 等人 3 5 】以t w e , e n2 0 为缓冲溶液添加 剂，分离牛乳清中三种含不同肽链的p 乳球蛋白。n g h i a c l l i e m 等人【3 6 】用微 芯片分析单克隆抗体和茶硷，缓冲液中有n a c l 和t w c e n - 2 0 ，茶硷的理论塔板数 达到4 x i 0 4 。n i c k im k i n g h o m 等人【3 7 】分离牛乳清中四种主要蛋白质；口一乳 白蛋白、p 一乳球蛋白a 、b 和白蛋白，为减小蛋白质和毛细管之间的吸附作用， 缓冲液中加t w c e n2 0 。a r i a r m as a e c o m a n i 等人【3 8 】等电聚焦分离变性的口和p 人 球蛋白、亚铁血红素，酸性缓冲液中含尿素、羟乙基纤维素和t w e e n 2 0 。 3 ，用于胶束亲和色谱( m i e e l l a ra f f m i t yc a p i l l a r ye l e e 廿o p h o r e f i s ，m a c e ) y a h y am r e s t a n i 等人 3 9 】认为安息香酸、水杨酸、苦味酸等几种药物和几种非 离子表面活性剂b 喇3 5 、t a g a t 和t w e c n 2 0 胶束之间有亲和关系，分析了这几 种表面活性剂和药物之间的结合能，g i b b s 自由能ag o 不同，会使分析物和胶束 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 之间分配不同，导致分离。r u nj u a n x u 等人【4 0 】在缓冲液中加入t w c e n 2 0 ，b 哟 3 5a n d7 8 ，实验表明对乳蛋白的分离有利，表面活性剂和蛋白质之间有交互作 用。j o s e m a n u e l h e r r e r o m a r t f n e z 等人 4 l 】用等电聚焦分离d 一乳白蛋白和一 乳球蛋白，用两种缓冲液，其中一种缓冲液中的t w e 圮n 2 0 含量1 0 ，确认表面 活性剂和蛋白质之间有亲和作用 非离子表面活性剂在c e 中应用很广，但是他们单独作为胶束用于m e k c 尚未见报道。 r = c l g h 3 6 r = c 1 2 h 2 4 c h 2 c h 2 0 ) n 2 h t w e e n8 0 t w e e n 2 0 图1 2 非离子表明活性剂t w e e n2 0 的结构示意图 f i g 1 - 2m o l e c u l es 仃u c t u r co f n o n - i o n i cs u r f a c t a n t ( t w w n2 0 ) 1 3 化学发光 1 3 1 化学发光机理 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是由高能量、不发热、不作电功或其 他功的化学反应所产生的次级光发射。化学发光反应至少需要两种反应试剂， 反应产生电子激发中间体或产物c ，j 、部分处于电子激发态的产物c 驰豫回到 基态时产生光子，或能将能量传递给另一分子来发光( 见图l - 3 ) 。它们的能级 能用荧光现象来识别，只是化学发光与荧光的激发模式不同。一般只有发热的 反应才能产生所需的热量。因此，c l 试剂大多是氧、过氧化氢，或是可能的氧 1 0 中国科学技术大学博士学位论文 第一章绪论 化剂。 厍 1 - 3 基本化学发光机理示意图：( a ) 直接发光( b ) 激发发光 f i g 1 3p r i n c i p l e so f t w ot y p e so f c h e m i l u m i n e 8 c c n t ：( a ) d i r e c t s 咄i t i z e d 发光强度取决于化学反应的速度、从基态到激发态的量子产率和激发态发 光的量子效率等。c l 不需要额外的光源，光路系统简单。由于不存在吸收检测 法中的强背景光，所以背景信号小，检出限得到改善。 1 3 2 化学发光体系 化学发光的主要类型有：1 自身反应能量激发产物分子的化学发光，如鲁米 诺、光泽精等的化学发光；2 激发中间体能量传递的化学发光，如化学发光激发 荧光；3 光解化学发光：4 电致化学发光；5 火焰化学发光：6 ，相间化学发光等。 就发光试剂体系而言又分为以下几种： 1 3 2 i 草酸酯化学发光( p e r o x y o x a l a t ec h e m il u m i n e s c e n t ， 中图科学技术大学博士学位论文 第一章绪论 草酸酯与h 2 0 2 反应生成一种商能量、不稳定的双氧基化合物，不稳定的双氧 基化合物的分解所放出能量转移到荧光剂分子，使之达到激发态。当其从激发 态跃迁回基态发出光子，能量就以光能的形式释放出来。这就是草酸酯与h 2 0 2 反应能量激发的荧光( 如图1 4 所示) 。 舡。一是髓。一鼙+ 嘛一b o 一& 乳加佣- ir | l ，1 j l 刚一m 鸭一v 恕鸭拶 d n i 自d 渊蠲 图1 4 草酸酯化学发光体系 f i g ，1 4 p o s s i b l er e a c t i o n p a t h w a y f o r t h e p o c ls y s t e m 草酸酯的水溶性较差，需要溶于有机溶剂中( 如乙腈，丁醇等) 。而且易 水解，不稳定，该性质使这一体系的使用受到限制。但是它的量子产率高，且 与其他c l 试剂相比，波长范围很宽( 2 6 5 - - 5 7 0r i m ) ，所以p o - c l 仍然是一 种常用的化学发光体系。双一( 2 , 4 ，6 一三氯苯基) 草酸酯 b i s - ( 2 ，4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n y l ) o x a l a t e ，t c p o 】和双一( 2 , 4 一硝基苯) 草酸酯 i b i s ( 2 ，4 - d i n i t r o p h e n y l ) o x a l a t e ，d n p 0 】都是常用的草酸盐。 1 9 9 1 年，h a r a 等人【4 2 】用t c p o - - h 2 0 2 体系检测曙红，当有钼酸盐、戊酸盐、 银- ( i ) 和汞( i i ) 存在时，发现曙红等二元和三元化合物与蛋白质一起迁移。 t s u k a g o s h i 等人【4 3 】使用t c p o - - h 2 0 2 体系分析了曙红和罗丹明，并由此揭示含 曙红和罗丹明的脂质体的电迁移性质。2 0 0 2 年，t s u k a g o s h i 等m 又用该体系分 离苯酚、2 一氯苯酚、4 一氯苯酚、2 ，4 一二氯苯酚，2 ，6 一二氯苯酚，2 , 4 ，6 一三氯 苯酚，检出限为l x l o m o l l 。他们还在该体系下用微芯片化学发光装置分析了 氨基酸，检出限为l 1 0 qm o l lf 4 5 1 。 1 3 2 2 酰肼类化合物 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 r 卜“ 图1 5 鲁米诺化学发光反应 f i g 1 5c lr e a c t i o no f l u m i n o l 由于这类化合物具有发光效率高、试剂稳定、反应在水相中进行等特点， 其化学发光机理及应用研究已有若干报道。d o d o o 4 6 等人用l u m i n o l - - 荧光素 酶体系分析l u m i n o l 和三磷酸腺营a t p ，检出限分别为2 x l o 嵋m o l l 和5 x 1 0 一m o l l 。s h a o - y e nl i a o 和c h e n - w e nw h a n g 等人【4 7 1 采用l u m i n o l - - h 2 0 2 - - c u ( i i ) 分析体系分析氨基酸，检出限达到1 0 0 4 0 0f m o l 。j i c t mr e n 等 4 8 】用 l u m i n o l - - h 2 0 2 体系，采用c o o t ) 为催化剂，分析镧系金属阳离子，检出限达到 ( 3 0 - 6 0 ) x 1 0 一m o l l ，优于紫外检测法3 个数量级。2 0 0 5 年，他们用 p a r a - i o d o p h e n o l 为催化剂 4 9 】，分析辣根过氧化酶0 - a u ) 和用h r p 标记的 c a l 2 5 抗体，检测限分别为2 5 x 1 0 - l i 和1 o x l o m o l l 。2 0 0 7 年，又用该体系 分析血色素，检测限达到1 7 肛g m l - - 6 8p g m l 伫2p g ) 5 0 。f r a n c i s c oj l a r a 等人【5 1 】用l u m i n o l - - k 3 f e ( c n ) 6 分析体系分析吩噻嚷，检出限达到ln g m l 。 c h e n g 5 2 - 5 8 、s h u l i nz h a o 5 9 7 2 】、h e 6 3 、w e i - w e im 6 4 、z h u - j u n z h a n g 6 5 - 6 6 、h u i w a nh a n 6 7 、s u q i nh a n 6 8 - - 6 9 、k a z u h i k ot s u k a g o s h i 等 7 0 ， 7 2 和b i f e n gl i u 7 1 等也多次使用l u m i n o l 体系。 1 3 2 3 光泽精( l u c i g e n i n ) 中国科学技术大学博士学位论文 第一章绪论 光泽精以硝酸盐的形式存在，在碱性介质中，过氧化氢将其氧化成四元环过 氧化物中间体，而后分解生成激发态的吡啶酮而发光，见图1 6 。利用光泽精与还 原剂作用，可用于测定临床医学上一些重要的还原性物质，如抗坏血酸、肌酸酐、 谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖和葡萄糖等。早在1 9 9 2 年，m i c h a e la r u b e n o 7 3 】 就用光泽精分析体系分析t a c r i d i n i u m ，检出限为1 1 0 一m o l l 。 伊，跳 器瑟q 羚悯d 的 驭p + o o _ hv ( 九= 4 7 0g m 图1 6 光泽精化学发光反应 f i g 1 6p r o p o s e dm e c h a n i s mf o rt h ec lr e a c t i o no f ar e p r e s e n t a t i v ea c r i d i n i u me s t e r ( 1 u c i g e n i n , 1 0 , 1 0 - d i m e t h y l - 9 ，9 。b i s a c r i n i u md i n i t r a t e ) 1 3 2 4 电化学发光 电化学发光( e c l ) 是利用电极原位产生试剂，这些试剂在溶液中反应， 完成较高能量的电子转移而产生激发态的分子，不稳定的激发态分子回到基态 过程中以光辐射形式释放能量，如当电极施加双阶跃正负脉冲时，分子4 在正 电位阶跃时被氧化为彳+ 。 4 一一+ + 口 在负电位阶跃时被还原为五一，4 + p 哼彳 1 4 i h b f i c 中国科学技术大学博士学位论文第一章绪论 彳+ 和小反应生成激发态的爿 彳+ + 彳_ 2 一 彳一彳+ h u 因此若体系中含有还原性物质r 或氧化性物质d 时，仅在工作电压上施加正 或负电压，即可生成激发态的a 而发光。 一4 + + e 一 或 一十e 一_ 爿一 彳+ + 尺一彳+ d 或彳。+ d 彳+ r 联吡啶类 m ( b p y ) 3 2 + 】化合物如r u 0 1 秒) ，“、o s o p y ) 3 “、c ，( 匆砂) ，“等 都可用作发光试剂。这类化合物的代表是r 封( 巨p 咖，“，它具有水溶性好，试剂稳 定，发光效率高等优点，其发光波长为6 1 0n m 。当正负脉冲施加于工作电极上 时，r u o p y ) ，“被氧化还原： r u ( b p y ) 3 “一e 震甜( 6 秽) 3 “ r u o t 秒) 3 “+ e 专l u 0 1 0 , ) 3 + r u 0 1 秒) ，“和r “( 色砂) ，+ 反应形成激发态的r “( 匆砂) ，2 + r “( 自渺) 3 “+ r u ( b p y ) 3 + 寸r u ( b l o , ) 3 2 + 电子转移 r u ( b 1 秒) 3 “_ r u ( b 1 秒) 3 2 + + h u ( a = 6 1 0 n t o ) 化学发光 当体系中含有强氧化或还原物质，只要旌加单向正或负电压就可得到 盂甜( 乒渺) 3 “的e c l ，如典型的r 甜( 劫咖3 “一g o , 2 r u ( b w ) 3 “一s 2 0 , 2 体系。 x i a o - j i n gh u a n g 7 4 、g 缀e t t a f o r b e s 【7 5 、x u e - b oy i n 7 6 和m e i - t s u c h i a n g 7 7 等人相继做了这方面的研究。 1 3 2 5 高锰酸钾氧化体系 中国科学技术大学博士学位论文 第一章绪论 高锰酸钾在酸性介质中氧化会产生化学发光。y i t i n gl e e t s 用高锰酸钾一 硫酸体系，分析了血液中的复合胺( s e r o t o n i n ) 、多巴胺( d o p a m i n e ) 、肾上腺素 ( e p m e p l l r i n e ) 、绎肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ) 、几茶酚( e a t e c h 0 1 ) ，检测限达至m j l o p m o l ，比c e - u v 法效果好。g o n g 等人 7 9 】用高锰酸钾作为c l 试剂同时检验 吗啡、6 - 乙酰吗啡和海洛因，并将环糊精加到缓冲液中，以提高分离效果和c l 信号强度。他们得到三种分析物的检出限分别为2 3 、6 6 和11 5f m o l ，比c e - u v 法 好。b a r n e t t 8 0 检测了吗啡、3 去氧甲蒂巴因和假吗啡，这些分析物可以在缩 聚磷酸盐存在下与酸性高锰酸钾反应。三种分析物的检出限分别为2 5 x 1 0 q m o l l 、2 5 x 1 0 7m o l l 和5 x 1 0 m o l l 。 经过几十年的发展，从纯有机相中多环芳烃的c l 反应机理研究到鲁米诺 和r u ( b p y ) ，“体系在h p l c 中的实际应用，充分显现了这种方法的灵敏度高、 重现性好和连续可测的优点。e c l 微电极的研究领域出现，是人们走向利用这 种方法进行微区和细胞活体分析的第一步，已出现的d n a 探针技术预示e c l 将在生物化学的应用上有更大的发展。 1 4 化学发光与毛细管电泳的联用技术 c e 发展初期，j o r g e n s o n 曾指出，c e 技术的广泛应用于深入发展所面临的 主要挑战是高灵敏度与多模式检测器的发展。十几年来，为了适应c e 微体积 在柱检测的需要