（药物分析学专业论文）水产品中孔雀石绿和甲醛残留检测方法研究.pdf

中山大学硕士学位论文 水产品中子l 雀石绿和甲醛残留 检测方法研究 专业：药物分析学 姓名：贾静 指导教师：鲁统部教授 黄仲立工程师 摘要 本文研究了水产品中孔雀石绿残留的高效液相色谱检测方法和一种用于水 产品中甲醛残留快速测定的甲醛试纸。第一部分在国标g b 厂r1 9 8 5 7 2 0 0 5 水产 品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定的基础上对样品预处理过程和色谱条件进 行优化，省去了二氯甲烷反提取一步，色谱测定中采用乙腈+ 乙酸铵缓冲液( v ：v = 8 0 ：2 0 ，p h = 4 5 ) 作为流动相洗脱，实验结果表明：孔雀石绿、隐色孔雀石绿 的加标回收率分别为7 8 7 5 和8 3 1 3 ，最低检测限均为lu g l ( g ，线性范围为 1 0 1 0 0u 鲫吗，且孔雀石绿、隐色孔雀石绿色谱峰分离度良好，该方法优于国标 方法。第二部分研制了一种用于水产品中甲醛残留快速测定的甲醛试纸。实验中 确定了试纸的显色原理为甲醛一乙酰丙酮显色法原理，试纸显色剂中乙酰丙酮和 无水乙醇的含量分别为6 和3 0 ，该试纸的检测限达到了国标对于水产品中 甲醛残留限度要求的1 0m g l ( g 水平。本文中水产品中孔雀石绿和甲醛残留的检 测方法能够满足当前水产品中有毒有害物质残留检测高通量筛选的要求。 关键词：孔雀石绿；隐色孔雀石绿；甲醛；乙酰丙酮；检测方法 中山大学硕士学位论文 t h em e t h o d o l o g yf o rt h ed e t e r m i n a t i o n so fm a l a c h i t e g r e e na n df o r m a l d e h y d er e s i d u e si na q u a t i cf o o d s m a j o r ：p h a m 砭l c e u t i c a la m l y s i s a u t h o r ：j i aj i n g s u p e r v i s o r ：p r o 佗s s o rl ut o n g b u e n g i l l e e rh l 埝n gz h o n g - l i a bs t r a c t 1 1 1 er e s e a r c hi nt m st h e s i si sc o n s i s t e do ft w op a r t s ：t h em e t h o d o l o g y 南rt h e d e t e m 血a t i o n so fr e s i d u e so fm a l a c 址eg r e e n ( m g ) 、a n di t sm e t a b 0 h cp r o d u c t l e u c o - 眦l a c 址e 伊e e n ( l m g ) ，嬲w e ua s t h e f 0 珊a l d e h y d e i n a q u a t i c 南o d s a c c o r d 吨t ot h eg b 厂rl9 8 5 7 - 2 0 0 5 ，t h es a i n p l ep r e 仃e a t m e n t 、糯o p t 砌z e d ：( 1 ) t h e c o u r s eo fr e e ) ( t r a c t i o nw i t hd i c h l o r o m e t l l a n ew 勰o m i n e d ；( 2 ) i tu s e d 确c r a t i cm o b i l e p 1 1 a s ec o n t 妣1 92 0 ( v 蜘a c e t a t eb u 妇衙( p h 4 5 ) i i la c e t o n t r i l e t h er e s u h 砌i c a t e s t h a t ，r e c o v e d e so f m g 锄dl m g w e r e7 8 7 5 锄d8 3 1 3 ，陀s p e c t i v e l 弘t h e1 0 w e s t d e t e c t i o nl i i 疵( l o d ) w 嬲1u g l ( g 南r b o t hm g 锄dl m ga n dh i l e a r i t y 、a so v e r t h e r a r 培e l0 l0 0u g l 【g ，d e m o n s t r a t i r 培t h a tt h eo p t i i i l 妇dm e t h o di i lt 1 1 i st h e s i sw 勰 s l j p e r i o rt 0t h es t a l l d a r dm e t h o do fg b 厂r1 9 8 5 7 2 0 0 5 i nt h e c o n dp a n ，at e s tp a p l e r 如rt h ed e t e f m i n a t i o no f 向功 1 a l d e h y d ei 1 1a q u a t i cf o o dw 弱o p t i m i z e d t 1 1 ec o n t e m so f a c e t ) r la c e t o n e 觚d 锄h ) 让0 u s 戗h 卸0 1 向rt h e 舯e p 删i o no ft e s tp 印e rw e r e6 加d 3 0 ，r 唧e c t i v e l y t h e1 0 w e s td e t e c t 啦l i 血w 雒1 0n l g 他，砌c ha c l l i e v e dt h e d e m a l = i d 旬r t h ed e t e m l i n a t i o no f r e s i d u eo f 南加：l a l d e h y d ei i la q u a t i cf o o d k e yw b s ：m a l a c 硫e 伊e e i l ，l e u c 0 i i l a l a c 硫e 伊e e 玛f o 咖a l d e h y d e ，a c e t y la c e t o m ， m e t h o d o l o g y 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：1 它青争 日期：如夕年 月彦日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密的学位论文在解密后使用本规定。 学位论文作者签名：蚴 日期：砷年月彦日 导师签名名1 乞卸导师签名名j 7 厂 嗍咖7 年莎月扩日 中山大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 孔雀石绿和甲醛背景资料 孔雀石绿( m a l a c 硫e 骶e n ，m g ) 为带有金属光泽的翠绿色结晶，属三苯 甲烷类染料。分子式为c 2 3 h 2 5 n 2 c l ，化学名四甲基代二氨基三苯甲烷，别名碱性 绿、盐基块绿、苯甲醛绿、孔雀绿( 结构式如图1 1 ) ，极易溶于水，溶液呈蓝 绿色，溶于甲醇、乙醇和戊醇【1 1 。水溶液的颜色为蓝绿色，最大吸收波长6 1 8 砌。 自然界中m g 以多种形式存在，主要是草酸盐和盐酸盐，与其它三苯结构染料 一样，m g 以两种离子形态存在，即染料盐和假碱。以假碱形式存在的m g 由于 其极高的脂溶性而能进入细胞中【2 】。在动物体内m g 被生物转化为无色孔雀石绿 ( l e u c o m a h c 址eg r e e n ，l m g ) ( 结构式如图1 2 ) 而被长期滞留在组织中i ”。 l m g 的结构类似于典型的芳香胺化合物，是m g 染料合成的前体物，也是工业 生产中严重的污染物。 h 3 弋 h l 气、 r c 珥 r a i ； 图1 2 隐色孔雀石绿结构式 中山大学硕士学位论文 甲醛( h c h o ) ，又名蚁醛，相对分子质量为3 0 0 3 ，常温下是一种无色、具 有强烈刺激性气味的气体【4 】，熔点9 2 ，沸点1 9 5 ，相对密度o 8 1 5 【5 】，易 溶于水、醇和醚，其3 5 4 0 水溶液称之为“福尔马林 ，此溶液在室温下即易 挥发，加热则更甚。甲醛的化学性质很活泼，能与氢氰酸、亚硫酸氢钠、氨的衍 生物( 如2 ，4 二硝基苯肼、苯肼、羟胺等) 以及醇类发生加成反应；经催化氢化， 甲醛被还原成甲醇；甲醛可以被氧化剂氧化生成甲酸：它在浓碱的作用下，能发 生自身的氧化还原作用，即所谓的歧化反应【6 】。 1 2 孔雀石绿和甲醛的应用 1 2 1 孔雀石绿在生产、生活中的应用 ( 1 ) 抗寄生虫药： m g 被广泛用于局部抗真菌和体外寄生虫感染，m g 一般用作体外抗寄生虫 药，也可以用于抗皮肤吸虫和腮吸虫。此外，m g 可用于治疗蟹鱼虱病，古比鱼 的腰鞭毛虫和四膜虫病川。 ( 2 ) 抗细菌药： 主要用于预防卵菌纲真菌在鱼体和鱼卵的生长繁殖，同时可预防和治疗二次 感染【引。在筛选抗卵菌纲真菌的4 9 种化合物时发现，m g 的抗菌效果最好网，m g 对某些鱼类的曲霉菌感染也有不错的疗效。 ( 3 ) 用于其它疾病的治疗： 对于红鳟的增生性肾炎( p l ) 、大西洋鲑鱼的皮肤溃疡有很好的控制，与 福尔马林联合应用对部分原虫和粘细菌感染有很好的控制【l o 】。0 1 的m g 在临床 方面有非常广泛的应用，可用于治疗丘疹性尊麻疹、蚊虫叮咬、血管性水肿等；痉 挛性皮肤病、脓疥疮、毛囊炎等化脓性皮肤病；带状疽疹、单纯疤疹等皮肤病；湿 疹、足癣等继发感染引起的脓疽及小片糜烂等皮肤损害以及冷冻、激光后所致的 皮肤损害。 m g 在水产养殖业中有悠久的使用历史，它经常被用于预防鱼类等水产品的 水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等，并获得了极佳的效果。在运输过程甚至市场、 饭店销售时也有人将m g 用作消毒剂，以延长鱼类的存活时间【1 1 1 。 2 中山大学硕士学位论文 ( 4 ) m g 在其它行业的应用： m g 还被大量用于食品添加剂、消毒药、驱虫药和作为染料用于丝绸业、毛 纺业、麻纺业、皮革业、棉纺业、印刷业和丙烯酸工业【12 1 。 1 2 2 甲醛的用途 甲醛的工业生产于1 8 8 8 年始于德国，1 9 1 0 年酚醛树脂工业化后甲醛开始大 量生产，工业上生产甲醛主要采用甲醇空气氧化法，按照催化剂的类型主要是银 催化法和铁钼催化法。我国的甲醛工业在过去的一百多年时间里也得到了迅猛 发展，目前，我国甲醛的生产和消费量均居世界首位，甲醛在现代社会中被广泛 的应用。 甲醛是重要的基本化工原料，在木材工业中，用于生产脲醛树脂及酚醛树脂， 由甲醛与尿素按一定摩尔比混合进行反应生成；在纺织业中，服装在树酯整理的 过程中都要涉及甲醛的使用。服装的面料生产，为了达到防皱、防缩、阻燃等作 用，或为了保持印花、染色的耐久性，或为了改善手感，就需在助剂中添加甲醛。 目前用甲醛印染助剂比较多的是纯棉纺织品，因为纯棉纺织品容易起皱，使用含 甲醛的助剂能提高棉布的硬挺度；甲醛还可以生成许多有用的化学品，如合成医 药、合成香料、合成炸药等；甲醛在农业、畜牧业、生物学和医药中普遍用作消 毒、防腐、熏蒸剂【1 3 】。3 5 4 0 的甲醛水溶液俗称福尔马林，具有防腐杀菌 性能，可用来浸制生物标本，给种子消毒等。 1 2 3 水产品中甲醛的来源及危害 甲醛是一种原生质毒，它对人体中枢神经系统及视网膜有刺激作用，对人的 神经、肺、肝脏均可产生损害，并具有潜在的致癌作用。其在食品中的来源有： ( 1 ) 食品及其原料被周围环境污染；( 2 ) 在食品生产过程中人为加入，如：作 为增白剂加入米、面制品中的吊白块；啤酒生产过程中为降低多酚物质、花色苷 及可凝蛋白质含量，在糖化工艺中投放的甲醛，以及将甲醛非法用于水发产品以 及蜜枣、瓜子等的加工等；( 3 ) 在食品生产过程中，如在啤酒的发酵过程中产生 的甲醛；( 4 ) 食品包装所用的化工材料中的残创1 4 】。 而水产品中甲醛残留情况在整个食品行业甲醛残留中尤为突出，曾一度受到 中山大学硕士学位论文 社会各界的广泛关注，也是本文的研究重点。水发产品中甲醛的来源可能有以下 几个方面：( 1 ) 将1 的福尔马林用于设施、工具消毒；将3 - 4 的福尔马林 作为环境改良剂和消毒剂或与其他药物配伍作为空间熏蒸消毒造成在水产品养 殖水体中一定量的残留【1 5 】；( 2 ) 作为渔药使用。甲醛可与蛋白质作用，与细胞 质的氨基部分结合，使其烷基化而呈现杀菌作用，对寄生虫、藻类、真菌、细菌、 芽胞和病毒具有杀灭效果，特别是对车轮虫病、小瓜虫病等原生动物引起的鱼病 有很好的效果。因此，可用于鱼类和甲壳类等疾病防治【l 6 1 。 在我国水产品市场中，有些不法商贩为牟取暴利，利用甲醛对水产品的：甲 醛可使水产品蛋白质发生凝固，延缓腐败变质，延长水产品保质期；甲醛可保持 水产品表面色泽光亮，使消费者误以为新鲜而购买；甲醛可使水发水产品体积增 大，感官上变硬且保持较高的含水量：甲醛可增加水产品的持水性、韧性等这些 作用【1 7 j9 1 ，在水产品特别是水发水产品中人为添加甲醛，经过甲醛处理的水产品 不仅营养价值降低，而且毒性大大增加，直接危害到消费者的使用安全。 1 3 孔雀石绿和甲醛的药理、毒理、代谢 1 3 1 孔雀石绿的药理、毒理、代谢特征 从上世纪9 0 年代开始，国内外学者陆续发现，m g 及其代谢产物l m g 具有 高毒素、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用【2 0 1 。而其化学官能团三苯 甲烷是一类致癌物质，人类食用经m g 治疗的水产品后，发现免疫系统和繁殖 系统受到较大的影响。 m g 治疗鱼类疾病的主要机理为其进入人类和动物生命体后，对其菌类微生 物的生命活动所必需的生化系统发生竞争性对抗，如对谷氨酸有相近似的氧化电 位势，发生竞争对抗，使谷氨酸无法转化为蛋白肽，细胞分裂受到抑制，而呈现 疗效。 m g 能引起鱼类的鳃和皮肤上皮细胞轻度炎症；使肾管腔有轻度扩张，肾小 管壁细胞的胞核也扩大；更重要的是影响鱼肠中的酶，使酶的分泌量减少，从而 影响鱼的摄食及生长【2 1 1 。另外，研究表明，m g 还能引起该动物肝、肾、心脏、 脾、肺、眼睛、皮肤等脏器和组织中毒。m g 对鱼类器官( 肾、肠) 造成损害后， 4 中山大学硕士学位论文 鱼类正常排泄困难，降低药物在鱼类机体内的消除速度，从而造成解毒、排泄障 碍而发生中毒，既药物蓄积性中毒。 b a n e r 等【2 2 】报道，鱼暴露于m g 水溶液后，会很快从水中大量吸收m g ，并 代谢成简单的无色化合物l m g ，大约9 0 以l m g 的形式贮藏在肌肉组织 中。m g 在体内消除快，而l m g 消除则很慢，其在组织中的消除率很大程度上 取决于鱼体内的脂肪含量。所以l m g 是十分稳定的残留物，是m g 在生物体内 的主要代谢产物和存在形式。 1 3 2 甲醛的毒性及代谢 ( 1 ) 甲醛的代谢 甲醛进入人体后，很快在体内代谢为甲酸和二氧化碳等。它们与生物体内的 一些亲核物质有高度的反应性，可能参与合成蛋白质和核酸的过程。甲酸及其代 谢物还可与氨基酸、蛋白质、核酸等形成不稳定的结合物，转移至肾、肝和造血 组织【2 3 1 。从代谢途径上来说，人体内的甲醛( 包括外界进入的和内生的) 有多 种代谢途径，主要有：经肺直接呼出；进入尿液被排除【2 4 1 ，与体内组 织蛋白质、细胞d n a 反应形成加合物而贮存在体内；在肝脏和红细胞中的 甲醛脱氢酶、醇脱氢酶的催化下生成甲酸，生成的酸主要有3 个代谢途径【2 5 】：进 入尿液排出、进一步氧化，生成二氧化碳和水、进入生物合成途径。 ( 2 ) 甲醛的毒性 广泛存在的甲醛对人类的身体健康造成了不良影响，能引起许多症状和体 征。目前多能获得的甲醛对人体的毒性危害的资料大部分为吸入和皮肤黏膜接触 的毒性资料，经口摄入的资料极为有限。 甲醛对人体的危害主要表现在：甲醛在低浓度下最初刺激眼黏膜。长期接触 低浓度甲醛可增高人体对甲醛的敏感性，表现为皮肤出现广泛的皮疹【2 6 1 。在浓 度稍高时刺激上呼吸道，对皮肤和呼吸道有致敏以及致突变作用。接触甲醛或含 甲醛制品可造成哮喘或非特异性支气管炎，还会引起胸闷，同时额部有特殊的压 迫感，并使粘膜溃烂，进而在肺部引起炎症，吸入甲醛后还可引起食欲减退、厌 食、体重减轻、衰弱、失眠症，甲醛对中枢神经系统有麻醉作用，尤其是对视力 有强烈的毒害作用。应用多种诱变测试系统进行试验表明，甲醛是一种较强的致 中山大学硕士学位论文 突变剂7 1 。此外，甲醛还能损伤细胞内的遗传物质，是可疑的致癌物质，研究 表明，甲醛具有遗传毒性，活泼的醛基使得它不需经过代谢就能攻击亲核基团， 能够与d n a 共价结合形成加合物，引起d n a 链间交联，d n a 断裂等【2 引。国外 职业流行病调查资料提示，甲醛接触人群诱发多器官肿瘤发病增加趋势，主要在 消化系统、神经系统、泌尿系统和淋巴系统，国际癌症机构甲醛工作小组认为， 甲醛蒸气的吸入确认对鼠类有致癌作用。有报道认为，经口摄入甲醛可导致白血 病等血液系统肿瘤，但目前证据尚不充分。 1 4 目前水产品中孔雀石绿和甲醛残留检测方法 1 4 1 孔雀石绿的检测方法 由于发现m g 对人体的潜在毒副作用，我国于2 0 0 2 年5 月将m g 列入食 品动物禁用的兽药及其化合物清单( 农业部公告1 9 3 号) 。m g 在水产养殖中的 使用屡禁不止，不但对人们的身体健康造成威胁，而且严重影响了我国水产品的 出口。因此，对m g 的残留检测就显得尤为重要【2 9 1 。 报道的用于m g 检测的方法大致可以分为化学检测法和生物检测法两类。 1 4 1 1 化学检测法 e d e l a e u s e r 等曾用薄层色谱法( t l c ) 检测孔雀石绿【3 0 】，该法虽然简便快 速，但不能同时检测m g 和l m g 。与高效液相色谱法相比，t l c 灵敏度较低 ( 1 0 0 0 l o 毋) ，一般只作定性分析，很少用于残留检测。s a 陆i l 【等曾用普通分光 光度法( a a s ) 检测水样中m g 含量，但检测限较高，灵敏度较低，准确性较差， 也不能检测l m g ，而且仅局限于水样的检测，且仅可用于m g 原料药等的测定【”】。 范翔等依据m g 与磷钼酸根阴离子在硫酸介质中形成离子缔合物而产生共振瑞 利散射，建立了以磷钼酸根阴离子为载体，共振瑞利散射测定痕量m g 的新方法 p 引。该方法灵敏度高，分析速度快，仪器设备简单，分析成本低，检测鱼池水 和水产品中m g 的结果较好。但是该法不能用于测定l m g 的残留。1 、珊岫s e e d 等 于1 9 8 5 年用气相色谱质谱联用法( g c m s ) 测定l m g 的残留【3 3 】。与液相色谱法 相比，该法灵敏度低，但不能测定m g ，所以很少被采用。近年来发展起来的新 6 中山大学硕士学位论文 的检测技术是液相色谱质谱联用法( l c m s ) ，该方法兼具定性功能、灵敏度高， 但仪器价格昂贵，在我国现有国情条件下，还无法普及。 朱蕾采用了高效液相色谱法分离、二极管阵列检测器检测、外标法定型3 4 】， 发现该方法简便、定量准确、精密度高，且仪器相对于液相色谱质谱联用仪便宜， 大多数实验室有能力购置，适用于水产品中m g 及其代谢物l m g 残留量的检测。 本课题正是基于高效液相色谱法检测水产品中孔雀石绿残留的上述优点展开的。 1 4 1 2 生物检测法 生物检测技术以竞争性酶联免疫法( e l i s a ) 为代表，具有快速、准确和无 污染等优点。龚朋飞初步建立了l m g 的e l i s a 测定方法1 3 5 1 。中华人民共和国上 海出入境检验检疫局和中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所就“水产品中孔 雀石绿间接竞争e u s a 检测试剂盒 共同申请了中国专利【3 6 l 。试剂盒的操作简 单，能较好满足目前对水产品孔雀石绿残留检测的迫切需要。用于海关检测、食 品卫生部门检测等，易于大范围推广应用，但这2 种方法的不足之处是只能检测 l m g 的残留。 1 4 2 甲醛的检测 随着甲醛在人们生产生活中的日益广泛应用，以及人们对于甲醛毒性认识的 不断提高，甲醛的检测方法也取得了快速发展。目前，甲醛测定的方法主要可以 分为以下几类：分光光度法、色谱法、电化学法、荧光法、化学发光法等。 1 4 2 1 分光光度法 分光光度法是甲醛测定中应用最为广泛的一种方法。它主要包括：乙酰丙酮 法【3 7 、3 8 1 、变色酸法( c 1 a 法) 【3 9 】、间苯三酚法【4 0 。4 3 1 、酚试剂法m 】、a h m t 法1 4 5 4 6 1 、品红亚硫酸法【4 7 】、盐酸苯肼法嗍和催化光度法【4 9 巧1 1 。 乙酰丙酮法：甲醛与乙酰丙酮及氨作用生成黄色2 ，5 二乙基1 ，4 二氢卢剔 啶，最大吸收波长为4 1 2m ，本法具有试剂来源方便、操作简便、稳定性好、 误差小、干扰少等优点，比色液可稳定1 2h 不变，当酚含量为1 5m g 以下和乙 醛量为3i i l g 以下时不干扰测定【5 2 1 。缺点是易受二氧化硫和含氮氧化物的影响。 7 中山大学硕士学位论文 该法线性范围为0 1 0ug m l ，检测下限为0 0 8ug m l 。乙酰丙酮法是测定甲 醛的较为理想的分析方法，目前在各个领域已得到了广泛的应用。现被广泛用于 水发产品及米、面制品的测定。本文中所述的用于检测水产品中甲醛残留的甲醛 测定试纸的试纸显色剂的组成正是基于这一显色原理。 变色酸法：也称，铬变酸法，甲醛在浓硫酸介质中与变色酸( 1 ，8 二羟基萘 3 ，6 二磺酸) 发生特异性反应，生成稳定的紫色化合物，该化合物最大吸收波长 在5 8 0 姗处，可用分光光度法进行测定。该法是国内外沿用了几十年的经典方 法，检出限为o 0 6i i l l 扎，优点是此反应的特异性较强，色阶清晰，颜色稳定， 灵敏度高于乙酰丙酮法，缺点是实验中硫酸用量大且操作不便，需在强酸溶液中 煮沸加热，不易控制，苯酚、醛类对测定有干扰。因为变色酸由浓硫酸配制，氧 化性强，样品蒸馏液中含有易炭化的杂质使溶液呈红紫色，无法比色【5 3 1 ，因此， 此法不适用于米粉、白砂糖的测定。 间苯三酚法：l m a c h a l l d r a 等将甲醛与间苯三酚在碱性溶液中生成桔红色物 质来进行分光光度测定，最大吸收波长为4 7 0 砌，此法的摩尔吸光系数为2 1 1 0 4l ( n 1 0 1 c m ) ，线性工作范围为0 1 2i i l g n l l ，具有操作方便，醛类化合物对测 定无干扰等优点，缺点是生成的桔红色物质褪色快，不易控制。 酚试剂法：酚试剂学名3 甲基苯并噻唑酮腙( t h ) ，酚试剂法的原理是 甲醛与酚试剂反应生成嗪，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物， 该物质的最大吸收波长为6 3 0 姗。本法测定范围为0 0 2 o 3m g l 。此法灵敏度 高，操作简便，但易受其他醛的干扰，溶液中存在二氧化硫时会使结果偏低，反 应受温度限制。 a h m t 法：a h m t 中文名为4 氨基3 联胺5 巯基1 ，2 ，4 三氮杂茂。该法基 本原理是甲醛与a 盯在碱性条件下缩合，然后经高碘酸钾氧化成紫红色化合 物，在波长5 5 0 姗处有最大吸收峰，比色测定。此法具有显色灵敏，选择性好， 显色稳定和操作简便，无需加热且亚硝酸根离子和亚硫酸离子对测定无干扰等优 点，对测定酒中甲醛选择性非常好。该法是测定树脂交联过程中释放甲醛的有效 方法，最低检出限为o 0 1 耐，较适宜于一般情况下室内空气的检测，缺点是 颜色随时间逐渐加深，要求标准溶液的显色反应和样品溶液的显色反应时间必须 严格统一。 中山大学硕士学位论文 品红亚硫酸法：甲醛与品红亚硫酸作用呈玫瑰色，遇硫酸后，颜色变成深蓝 色，比色定量。生成物的最大吸收波长为5 7 0i l i n ，检测限为5 0u l 。此法是 测定甲醛的经典方法，醛类均能与品红亚硫酸反应，但在硫酸存在下只有甲醛所 产生的颜色不褪，因此，该方法测甲醛的特异性很好，操作方便，测定范围广， 但该比色液不稳定，重现性差，灵敏度较低。 盐酸苯肼法：甲醛与盐酸苯肼及铁氰化钾在酸性或碱性条件下反应生成橙红 色化合物，在该物质的最大吸收峰波长为5 2 0 衄处测定，此法灵敏度高，但操 作繁琐，重现性差，苯肼剧毒且显色生成物不稳定。 催化光度法：该法的原理是在磷酸介质中甲醛催化溴酸钾溴钾酚紫氧化 还原反应，使其反应体系褪色，建立了测定甲醛的方法。 1 4 2 2 色谱法 气相色谱法：甲醛在酸性条件下吸附在涂有2 ，4 二硝基苯肼( 2 ，4 d n p h ) 6 2 0 1 担体上，生成稳定的甲醛腙，用二硫化碳洗脱后，经色谱柱分离，用氢火 焰离子化检测器测定。该方法具有操作简单、测定线性宽、分离度好、灵敏度高、 重复性好等优点。该方法测定的线性范围为2 5 1 0 0 0m g l ，检测限为1 呲。 液相色谱法：甲醛被在酸性条件下的2 ，4 二硝基苯肼( 2 ，4 d n p h ) 吸收后，生 成2 ，4 二硝基苯腙，紫外3 6 0i m 处测定。该法的最低检测限为2 5 宰1 0 3u n 1 l ， 该法具有效果好，准确性好，灵敏度高等优点。 1 4 2 3 电化学法 电化学法主要有示波极谱法，其次还有吸附伏安法和“哥腊”衍生试剂法。 示波极谱法是近年来发展起来的一种快速分析技术，许多含有羰基结构的醛( 酮) 化合物通过联氨衍生物可以用示波极谱法测定。原理是在7 0 的 l 址二瞰a c 缓冲溶液中，甲醛、氨和乙酰丙酮反应生成二乙酰基二氢卢剔啶，在滴汞电极上 还原产生o 9 6v 不可逆还原波。甲醛浓度在o 0 2 0 1 0p 卧1 1 l 范围内与极谱峰高 呈良好的线性关系，检测限为0 0 2ug n 1 l 【5 4 】。 1 4 2 4 荧光法 9 中山大学硕士学位论文 荧光法在测定微量甲醛中具有广阔的发展前景。原理是：在酸性介质中，甲 醛与肼酚嗪反应并在沸水浴中加热2 5i n i i l 后生成s 三氮杂茂【3 ，4 一a 酚嗪，产生 的物质用荧光光度计分别在激发波长2 3 6l m 和发射波长3 8 9 咖处测定荧光强 度。该方法可分为荧光光度法和催化荧光动力学分析方法。该方法相当灵敏，重 现性好，分析时间短，是一种近乎实时的分析方法，可用于室内空气环境中痕量 甲醛的分析检测。 1 4 2 5 化学发光法 该法主要基于没食子酸过氧化氢甲醛体系的化学发光，该方法的优点在于 灵敏度高、线性范围宽、反应迅速，缺点是乙醛和丙醛对测定有较小影响。 1 5 水产品中孔雀石绿残留限量标准 我国对于水产品中孔雀石绿残留限量的标准主要有： 国家标准： 1 ) g b t1 9 8 5 7 2 0 0 5 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定中规定， 孔雀石绿的检测限为2ug 蚝。 2 ) g b 厂r2 0 3 6 1 2 0 0 6 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色 谱荧光检测法中规定，孔雀石绿的检测限为o 5ug l 【g 。 水产行业标准： s c 厂r3 0 2 1 2 0 0 4 水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法中规定， 本方法检测限：孔雀石绿为2ug l ( g ；无色孔雀石绿为4ug k g 。 检验检疫行业标准： 1 ) s n 厂r1 4 7 9 2 0 0 4 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法中规定， 本方法采用瑚? l c s 法孔雀石绿的测定低限为2ug l 【g ，采用h p l c m s m s 法 孔雀石绿的测定低限为1ug 1 ( g 。 2 ) s n 厂r1 7 6 8 2 0 0 6 水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定 方法中规定，本方法中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的检测限均为2 0l ig k g 。 欧盟委员会2 0 0 4 年规定的检出限为2 opg 他( 孔雀石绿和隐色孔雀石绿的总 量) 。 l o 中山大学硕士学位论文 1 6 甲醛检测标准及快速检测现状 目前，世界卫生组织( w h o ) 和美国环境保护局( e p a ) 均将甲醛列为潜 在危险致癌物与重要的环境污染物【5 5 】。因此在食品卫生检验、环境检测和临床 诊断等方面，对甲醛的测定都有着重要的意义。2 0 0 1 年8 月6 日国家质检总局 批准发布了g b1 8 4 0 1 2 0 0 l 纺织品甲醛含量的限定强制性国家标准，严格规 定了纺织品中的甲醛含量。即：a 类( 婴幼儿用品) 2 0 哦，b 类( 直接接 触皮肤的产品) 7 5m g l ( g ，c 类( 非直接接触皮肤的产品) 3 0 0 哦。该标 准于2 0 0 3 年1 月1 日实施。我国有关空气中甲醛的卫生标准如下：居民区大气 中甲醛最高容许浓度为o 0 5 酬( t j 3 6 7 9 ) ；居室内空气中甲醛最高容许浓度 0 0 8n l g m 3 ( g b 厂r 1 6 1 2 7 - 1 9 9 5 ) ；公共场所甲醛最高容许浓度o 1 2 n 岔( g b t 9 6 6 3 9 6 6 7 1 9 9 6 ) ；车间空气中有害物质最高容许浓度3 m 酊( t j 3 6 7 9 ) 。食品方面，甲醛为国家明文规定的禁止在食品中使用的添加剂， 在食品中不得检出。但由于水发食品中甲醛具有本底值，限量为1 0m g l ( g 【5 6 1 ， 因此规定，水产品中甲醛的残留量不得高于1 0 蛾。 由上述叙述可知，目前测定甲醛含量的常规方法普遍使用大型仪器，其优点 包括检测灵敏度高、定量准确等，但是这些方法测定步骤复杂、需专业人员操作、 测定费用高，或消耗受验对象大、检测结果滞后，不能适应现场快速检测，也不 易普及。在这样的形势下，可用于甲醛快速定性、半定量检测的试剂盒、试纸应 运而生。 目前国内已有商品化的甲醛试剂盒，如王志城【5 7 1 ，提到的甲醛速测盒，以 及王焕桥【5 引，提到的甲醛检测管。甲醛测定试纸的出现相比于试剂盒在共同具 有可以用于甲醛的快速定性、半定量检测的优点的同时，由于其价格更加低廉， 一次性使用，成本仅仅是一小片纸和少量的浸泡液，且对环境的污染小，因此具 有十分广阔的发展前景。 目前用于甲醛检测的试纸主要有如下三种： c n1 5 6 3 9 5 4a 空气中甲醛快速测定试纸【5 9 1 ，该试纸以a t 溶液为显 色剂，灵敏度高，检测灵敏度为o 0 4 耐； c n1 1 1 7 2 7 8a 用于检测甲醛、甲醇成分的试纸及其检测方法【6 0 1 ，它是以 希夫试剂为浸泡液；检测灵敏度高； 中山大学硕士学位论文 c n1 4 8 7 2 9 6a 不受蛋白质干扰快速检测水发或水产品中甲醛成分的试 纸【6 1 1 ，它是以乙酰丙酮为显色剂，检测水产品中的甲醛残留不受蛋白质的干扰， 检测的灵敏度为3 0i i l ；l 【g 。 1 7 本章小结及论文选题意义 本章围绕孔雀石绿和甲醛的基本理化性质、应用、毒性、检测标准及方法展 开论述。 孔雀石绿方面，由于孔雀石绿本身的结构特征，它一度作为一种物美价廉的 渔药在水产养殖业中广泛应用，作为染料还被大量应用于纺织、皮革、印刷、化 工等领域。但随着孔雀石绿对人体潜在的致癌、致畸、致突变毒性的揭开，世界 各国对于孔雀石绿的检测和控制越来越严格，孔雀石绿检测的检测方法也得到了 快速的发展，出现了薄层色谱法、分光光度法、共振瑞利散射法、气一质联用法、 液相色谱法、液一质联用法和酶联免疫法等检测方法，我国陆续出台了关于孔雀 石绿检测和限量的国家标准和行业标准，其中g b 厂r1 9 8 5 7 2 0 0 5 中，水产品中孔 雀石绿残留的高效液相色谱紫外检测法规定m g ( 包括其代谢物l m g ) 的限量 为2 啦肚g 。本文的研究重点之一就是在g b 厂r1 9 8 5 7 2 0 0 5 方法的基础上，采用 高效液相色谱二极管阵列检测法，对水产品中孔雀石绿残留的检测方法进行优化 改进，满足当前水产品中孔雀石绿残留高通量筛选的要求。 甲醛方面，甲醛在现代社会中的越来越广泛的应用，给生产生活提供便利的 同时，也带来了甲醛对于人体安全性的隐患。有文献表明，吸入甲醛气体、皮肤 间接或直接接触甲醛溶液、口服食入甲醛溶液或残留甲醛的食物都会引起甲醛的 毒性反应。甲醛是一种原生质毒，已有报道称甲醛具有致癌性，同时还会引起呼 吸、消化、神经等系统的毒性。基于此，近十几年间对于甲醛的研究日益广泛和 深入，用于检测食品、环境、物品等中的甲醛含量的检测方法也越来越多，本文 对甲醛检测的主要仪器分析方法作了简要概述。笔者预期，甲醛残留检测的未来 发展趋势将是甲醛快速检测试纸。本文的研究重点之二，就是研究出一种快速、 准确、用于水产品中甲醛残留的半定量检测的甲醛试纸，让它能够走进普通百姓 的日常生活。 1 2 中山大学硕士学位论文 第二章水产品中孔雀石绿残留检测方法优化研究 2 1 概述 本章内容主要围绕水产品中孔雀石绿残留的检测方法优化改进展开。主要对 样品预处理过程进行优化改进，并通过加标回收率、标准曲线制各、最低检测限 测定系列方法学实验和样品差异对于加标回收率的影响、色谱柱柱效测定实验验 证该方法的可靠性，并对广州市场上孔雀石绿残留情况作了调查研究。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器( p d a ) ( l c 2 0 a ，岛津公司) ； 家用搅拌机：高速组织均质机( 德国i k a 公司) ；涡漩混合器( 天津) ；离心机( 上 海飞鸽) ；旋转蒸发仪，配有循环水式多用真空泵( 河南巩义) ；超声波清洗仪 ( 4 5 1 0 ，美国b r 锄s o n 公司) ；d 伽w e r 分析天平( 德国塞多利斯) ；固相萃取( s p e ) 小柱空柱管和垫片( 大连) ；固相萃取装置( 美国s u p e l c o 公司) 。 孔雀石绿纯度 9 0 0 、隐色孔雀石绿纯度 9 2 0 标准品( 德国 d r e h r e r 埘o m rg i r l b h 公司) ；乙腈( 色谱纯，美国m e r c k 公司) ；高纯水；无水乙 酸铵( 分析纯，广州化学试剂厂) ；冰乙酸( 分析纯，天津市大茂化学试剂厂) ； 酸性氧化铝：( q 们ei ，b r o c k m a n 力公司) ；乙酸铵缓冲溶液：o 0 5m o l l ，称取 3 8 5g 无水乙酸铵溶解于1 0 0 01 1 1 l 高纯水中，冰乙酸调p h 到4 5 ；对甲苯磺酸溶液： 1 0 m o l l ，称取1 7 2g 对甲苯磺酸，水溶解、定容至1 0 01 1 1 l 。 2 2 2 标准溶液的配制 m g 、l m g 标准储备液( 1 0 0p m l ) ：准确称取m g 和l m g 标准品各1 o o i n g ，用乙腈溶解、定容于1 0i i l l 棕色容量瓶中，1 8 冰箱避光密封保存。 中山大学硕士学位论文 m g 、l m g 标准中间液( 1p 鲋【i l l ) ：分别移取上述m g 和l m g 标准储备液 0 2 5m l 于2 5n l l 棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，1 8 冰箱避光密封保存。 m g 、l m g 混合标准工作液( o 1 ug 1 1 1 l ) ：分别移取上述m g 和l m g 标准中 间液2 5m l 至同一2 5i n l 棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，1 8 冰箱避光密封 保存。 2 2 3 样品预处理 将采来的水产品样品去除内脏、皮、骨，取肌肉部分用刀切成约lc m 3 大小 的小块，然后放入搅拌机中搅成泥状，放入冰箱中1 8 冷冻保存。取上述处理 过的水产品样品，解冻，准确称取2 5 0g 于5 01 1 1 l 离心管中，加入1 2 5i i l l1 0m o l l 的对甲苯磺酸、5n 1 l 乙腈，用均质机以1 0 0 0 0 以1 1 i 1 1 的速度均质3 0s ，再加入5g 酸性氧化铝，5n 1 l 乙腈，用涡漩混合器以3 0 0 0r i 血的速度混合提取1m i i l ，4 0 0 0 r r 咖离心8i l 血，把上清液转移至5 0i n l 三角瓶中，保持密封避光。再向离心管 中加入5i n l 乙腈，重复上述操作两次，合并乙腈层。 把自填的6i i l l 酸性氧化铝s p e 小柱安装在专门用于对样品进行固相萃取的 固相萃取装置上，装置与真空泵连接，通过调节泵压来控制样液的过柱速度。将 三角瓶中的样液转移到s p e 小柱上( 上样前小柱用1 0i i l l 乙腈活化) ，控制流速 不超过o 6n l l i 血，待样液液面下降到距离s p e 小柱上面筛板约0 1 姗处时， 用2 51 1 1 l 乙腈洗涤三角瓶，将洗涤液过柱，重复洗涤一次，收集全部流出液于 5 01 1 1 l 圆底烧瓶中，4 0 旋转蒸发至没有乙腈蒸出为止，残渣准确加入li i l l 乙 腈，超声波超声溶解51 1 1 i i l ，过o 4 5 啪滤膜，得滤液于冰箱中1 8 冷冻过夜， 以使样品中残留的少量水分凝结，并与样品溶液分层，取样品溶液供液相色谱测 定。 2 2 4 高效液相色谱测定 色谱条件： 色谱柱：c 1 8 色谱柱( 迪马公司，2 5 0n 姐4 6i 衄( i d ) ，粒度：5 岫) ， p b 0 2 氧化柱( 上海安普公司，p b 0 2 ：硅藻土= l ：1 ) 接于色谱柱后； 流动相：乙腈：乙酸铵缓冲液( v ：v ) = 8 0 ：2 0 ； 1 4 中山大学硕士学位论文 流速：0 8m i ，m h 柱温：3 5 ； 检测器：p d a ( 二极管阵列检测器) ； 检测波长：6 1 8m n ： 进样量：1 0 0u l 。 2 3 方法学验证 2 3 1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿线性关系考察 分别取m g 、l m g 混合标准工作液( 0 1ug i n l ) 5 、2 、1 、0 5i i l l 于1 0i n l 棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，得浓度分别为5 0 、2 0 、l o 、5u g l ( g 的m g 、 l m g 混合标准溶液，分别取上述不同浓度的混标溶液进行液相色谱测定，绘制 峰面积浓度标准工作曲线。 2 3 2 空白样品加标回收率实验 空白样品取已确定不含孔雀石绿的罗非鱼肌肉。 取上述已匀浆的罗非鱼肌肉2 5 0g 于5 01 1 1 l 离心管中，加入0 51 1 1 lm g 、l m g 混合标准工作液( c m g = c l m g = 0 1ug i n l ) ，避光密封静置1 01 1 血，加入1 2 51 1 1 l 1 0m o l l 的对甲苯磺酸、5i i 儿乙腈，用均质机以1 0 0 0 0r i l l i i l 的速度均质3 0s ，再 加入5g 酸性氧化铝，5m l 乙腈，用涡漩混合器以3 0 0 0r i i l i i l 的速度混合提取1 m i i l ，4 0 0 0 蛐离心8m i n ，把上清液转移至5 0m l 三角瓶中，保持密封避光。再 向离心管中加入5i l l l 乙腈，重复上述操作两次，合并乙腈层。 把自填的6n l l 酸性氧化铝s p e 小柱安装在专门用于对样品进行固相萃取的 固相萃取装置上，装置与真空泵连接，通过调节泵压来控制样液的过柱速度。将 三角瓶中的样液转移到s p e 小柱上( 上样前小柱用1 01 1 1 l 乙腈活化) ，控制流速 不超过o 6m l m i n ，待样液液面下降到距离s p e 小柱上面筛板约o 1m m 处时， 用2 51 1 1 l 乙腈洗涤三角瓶，将洗涤液过柱，重复洗涤一次，收集全部流出液于 5 0l i l l 圆底烧瓶中，4 0 旋转蒸发至没有乙腈蒸出为止，残渣准确加入li i l l 乙 腈，超声波超声溶解5 曲，过0 4 5 啪滤膜，得滤液于冰箱中1 8 冷冻过夜， 中山大学硕士学位论文 以使样品中残留的少量水分凝结，并与样品溶液分层，取样品溶液供液相色谱测 定，结果与与国标g b t1 9 8 5 7 2 0 0 5 方法进行比较。 2 3 3 不同浓度梯度样品加标回收率实验 以基围虾样品作为基体空白，平行取六份样品，每份2 5g ，分别加入m g 、 l m g 混合标准工作液( c m g = c l m g = 0 1p 1 1 1 l ) o 1 、0 。3 、o 5n 1 l ( 即加标量 分别为1 0 、3 0 、5 0i l g ) ，每