（耳鼻咽喉科学专业论文）蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究.pdf

复日大学硕p 毕业论文盘丝作为软骨纽织t 程支絮材 l 的实验研冗 蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究 中文摘要 目的：进一步证实蚕丝具有良好的生物相容性；观察蚕丝的体内降解过程；探讨 钙盐溶解对蚕丝降解性的影响；比较微溶蚕丝、切割蚕丝与p g a 在细胞黏附性方 面的差异；探讨用蚕丝作为组织工程支架体外构建软骨的可行性。 方法：实验分三个部分：第一部分蚕丝生物相容性及降解性研究，将脱胶后的蚕 丝在c a c l 。h ：0 ( 摩尔比1 ：8 ) 溶液中按不同时间进行溶解，沉淀于直径l o m m 培养 皿底部自然干燥呈圆盘状，剪刀剪成数块3 5 船2 大小薄片。取实验用昆明小鼠 5 4 只，随机分为：c a c l 2 处理2 0 m i n 组；c a d ：处理6 0 m i n 组；未处理组，每组 1 8 只，每只小鼠背部皮下埋植3 块材料。埋植术后1 月、2 月、3 月、4 月、6 月、8 月，每组各处死小鼠2 只，取出材料。埋植术后1 2 月，处死剩余小鼠。 行大体观察、组织学切片观察蚕丝的降解情况、降解产物对组织的影响及钙盐溶 解对其降解性的影响。第二部分蚕丝与p g a 的细胞黏附性比较研究，通过亲水 性测试及扫描电镜观察切割蚕丝性能及结构变化，取新生兔关节软骨消化分离获 取软骨细胞，体外培养扩增，将传至第3 代细胞消化下来制成1x1 0 5 ml 浓度 单细胞悬液，以每孔1 0 5 个细胞( 1m1 ) 分别接种于微溶蚕丝材料和切割蚕丝材料 及p g a 材料上培养2 4h ，然后通过细胞计数法及m 1 v r 法作黏附细胞数检测，评价 黏附率。第三部分蚕丝复合兔关节软骨细胞体外构建组织工程软骨，选新生兔 关节软骨消化分离获取的原代软骨细胞为种子细胞，分别试用切割蚕丝及p g a 为 支架材料，采用体外培养4 周构建组织工程软骨。通过倒置相差显微镜、扫描电 镜、组织学及免疫学检测评价新生软骨。 结果：第一部分蚕丝生物相容性及降解性研究结果：术后动物无不良反应，术 区及邻近皮肤无红肿、水肿、破溃及异常隆起等。埋植术后1 月、2 月、3 月、4 月时可见材料表面包裹一薄层纤维结缔组织，外形较植入时略有缩小。6 个月时 c a c l2 处理6 0 m l n 组发现1 块材料消失。8 个月时c a c l 2 处理2 0 m l n 组有1 块及c a c l ： 处理6 0 r a n 组有2 块材料消失。1 2 个月时分别有7 块和9 块消失。以上结果提 示蚕丝已降解可能。组织病理学检查可见，最初几月各组均可见异物巨细胞排列 于蚕丝周围，随月份增加逐渐减少，少见白细胞及淋巴细胞浸润。体内埋植2 月 后多数切片均可见蚕丝有裂解现象，c a c l ：处理6 0 r a i n 组较2 0 m i n 组出现早且明 显。6 个月的组织切片中可以观察到蚕丝局部结构消融现象。第二部分蚕丝与 p g a 的细胞黏附性比较研究结果：经过切割处理，蚕丝亲水性明显增加，扫描电 镜下可见经切割后蚕丝表面有更多的微丝剥脱，使得网孔增加、孔隙减小，丝与 t 复巨大学硕 毕业论文盂丝作为软骨组织丁程支絮材料的卖验研究 丝之间连接增加。细胞计数法测得微溶蚕丝、切割蚕丝及p g a 三种材料黏附率分 别为6 7 3 、8 4 2 、7 7 8 9 6 ，m t t 法测得三种材料黏附率分别为6 8 3 、8 3 3 、 7 7 。各组数据经方差分析，微溶蚕丝组与切割蚕丝组有统计学差异，切割蚕丝 组与p g a 组无统计学差异。第三部分蚕丝复合兔关节软骨细胞体外构建组织工 程软骨研究结果：倒置相差显微镜下见软骨细胞接种2 4 h 后单个或成团吸附在支 架纤维表面或密布于纤维孔隙中。培养5 天时，可见大部分纤维上均有细胞缠绕， 纤维增粗。培养1 周时外观有所增大，复合物密不透光。复合物培养2 周时扫描 电镜下观察，可见细胞呈多角状伸展开来，胞外基质分泌旺盛，黏附并包绕蚕丝 纤维，成片状沉积覆盖于材料表面并进入支架内部。体外培养4 周后，进行组织 学检测，可见蚕丝构建的组织工程化软骨组织能形成近似于正常软骨的结构。免 疫组化检测可见蚕丝构建的软骨组织中有被染成棕黄色的i i 型胶原。 结论：( 1 ) 天然蚕丝具有良好的生物相容性，脱去丝胶后埋植皮下1 月后少见 急性炎症细胞浸润。( 2 ) 蚕丝体内1 年左右可以降解，降解产物不产生炎症反应。 ( 3 ) 经过钙盐溶解处理后降解时间加快，溶解2 0 分钟与6 0 分钟在降解率方面 比较无统计学差异，而2 0 分钟微溶解对蚕丝结构性能影响较小，更适合用作组 织工程支架材料。( 4 ) 切割蚕丝具有良好的亲水性和细胞黏附性，细胞黏附率较 未切割组相比较有统计学差异；和p g a 相比无统计学差异( 5 ) 切割蚕丝纤维制 作的支架能够维持软骨细胞立体培养的三维环境条件。孔隙大小适中，利于细胞 进入材料内部。( 6 ) 软骨细胞在蚕丝支架上生长旺盛，分泌大量基质，连成片状。 ( 7 ) 体外构建4 周可见软骨样组织形成。 关键词：蚕丝软骨细胞细胞培养组织工程支架材料 2 一 复旦大学硕j 毕业论文蚤丝作为软骨组织工程支絮材料的实验研究 c a r 打t a g et i s s u ee n g i n e e r i n g a b s t r a c t p u r p o s e ：1 ) t of u r t h e rc o n f i r mt h eg o o db l o c o m p a t l b i l i t y a n dt o o b s e r v et h e b i o l o g i c a ld e g r a d a t i o no fs 1 l k 2 ) t or e s e a r c ht h er e l a t i o n o fs i l kd e g r a d a t i o na n dc a l c i u ms o l u t i o n s 3 ) t oc o m p a r et h ec e l l a d h e s i v e n e s sb e t w e e nt w ot y p e so fs i l k ( b r o k e ns i l ka n ds l i g h t d i s s o l v e ds i l k ) a n dp g a 4 ) t oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fc o n s t r u c t i o n o fat i s s u ee n g i n e e rc a r t i l a g ei nv i t r o ，u s i n ga r t i c u l a rc h o n d r o c y t e s o fr a b b i t sa ss e e d i n gc e l la n db r o k e n s i l ka ss c a f f o l dm a t e r i a l s m e t h o d s ：t h ee x p e r i m e n t a li sc o m p o s e do ft h r e ep a r t s p a r t1 ：s t u d yt o b i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o l o g i c a ld e g r a d a t i o no f s 1 l k m a k et h es i l k d i s s o l v e di nc a c l 2s o l u t i o np r o g r e s s i v e l y ，a sf o l l o w e dt ob e2 0m n u t e s d i s s o l v e dg r o u pa n d6 0m l n u t e sd i s s o l v e dg r o u p ，d r i e da n dc u ti n t op i e c e s a p p r o x i m a t e l y3 m m x5 mi ns i z e 5 4k mm o u s ew e r eu s e d t h em a t e r i a l so f 2 0m i n u t e sd i s s o l v e dg r o u pw e r ei m p l a n t e ds u b c u t a n e o u s l yi n t ot h eb a c k o f1 8m o u s e ，3p l e c e se v e r ym o u s e ，t h es a m ea s6 0m l n u t e sd is s o l v e dg r o u p a n dc o n t r o lg r o u p a n i m a lw e r es a c r i f i c e da n ds p e c i m e n sw e r er e m o v e d 1 ，2 ，3 ，4 ，6 ，8o r1 2m o n t h sa f t e ri m p l a n t a t i o n s p e c i m e n sw e r ee v a l u a t e d g r o s s l ya n d t e s t e db yo nt h ew h o l eo b s e r v a t i o na n dh i s t o l o g i c a l e x a m l n a t i o n s p a r t2 ：c o m p a r l s o no fc e l la d h e s i o nt os i l ka n dp g a t o r e s e a r c hs t r u c t u r ea n dp e r f o r m a n c eo fb r o k e ns 1 i kb yh y d r o p h i l i ct e s t a n ds c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p y a r t l c u l a rc h o n d r o c y t e so fr a b b i t s w e r ei s o l a t e da n de n z y m a t l cd i g e s t i o nw i t h0 1 c o l l a g e n a s et y p ei ia n d c u l t u r e di nv i t r o a f t e rt h et h i r dg e n e r a t i o n ，t h ec h o n d r o c y t e sw e r e s u s p e n d e di nc u l u r ea tac o n c e n t r a t i o no f1 l o sc e l l s m la n ds e e d e do n t o t h i st h r e em a t e r i a l sa n dc u l t u r e df o r2 4 h t h e nt h ea d h e s i v e n e s so f m a t e r i a l sw a sm e a s u r e do re v a l u a t e db ym e t h o d so fc e l lc o u n t i n ga n dm t t p a r t3 ：a ne x p e r i m e n t a ls t u d yo fa r t i c u l a rc h o n d r o c y t e sc u l t u r e do n s c a f f o l d so fs i l k si nv i t r o a r t i c u l a rc h o n d r o c y t e so fr a b b i t sw e r e i s o l a t e da n de n z y m a t i cd i g e s t i o nw i t h0 1 c o l l a g e n a s et y p ei ia n d c u l t u r e do nt h r e e d i m e n t l o n a ls c a f f o l d sm a d eo fb r o k e ns i i ko rp g ai n v i t r of o r4w e e k s t h en u m b e ro fc e l1w a sc o u n t e da n dh i s t o l o g i c a lc h a n g e s 3 复日大学硕上毕业论文蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究 w e r eo b s e r v e dw 1 t hh es t a i m n ga n du n d e rs c a n n i n ge l e c t r o m cm i c r o s c o p y i m m a n o h i s t o c h e m c a ls t a i nw e r ep e r f o r m e dt od e t e c tc h o n d r o c y t e s p e c i f l c c o l l a g e nt y p ei i r e s u l t s ：r e s u l t so fp a r t1 ：n oc o n g e s t i o n ，s w e l l i n go rs u b c u t a n e o u sf l u i d a c c u m u n l a t i o nw a so b s e r v e di nt h er e g i o ne m b e d d e dw i t hs i l k sa f t e rt h e s u b c u t a n e o u si m p l a n t a t i o n f r o mo n et of o u rm o n t h s ，i tc a nb es e e nt h a t t h eg r a f tw a ss m a l l e rt h a nt h a tb e f o r es u r g e r y r e s u l t ss h o w e dt h a to n e p i e c eo fg r a f tw a sa b s o r b e di ng r o u po fd i s s o l v e d6 0m i n u t e ss i xm o n t h s a f t e rs u r g e r y e i g h tm o n t h sa f t e rs u r g e r y ，o n ew a sa b s o r b e di ng r o u po f d i s s o l v e d2 0m i n u t e sa n dt w o d i s a p p e a ri ng r o u po fd i s s o l v e d6 0m i n u t e s b yt h ee n do ft w e l v em o n t h s ，s e v e na n dn i n ed i s a p p e a rr e s p e c t i v e l y h i s t o l o g i c a le x a m i n a t i o ns h o w e dt h a taf e wi n f l a n m a t o r yc e l lw e r es e e n a r o u n dt h es i l ko n l yi no n em o n t ha n dr e j e c t i o nr e a c t i o nd i dn o ta p p e a r o b v i o u s l y t h el a wo ft h ec h a n g i n go fm o r p h 0 1 0 9 1 c a ls t r u c t u r ec a nb e o b s e r v e df r o mt w om o n t h r e s u l t so fp a r t2 ：s i l ki se a s yt oh y d r o p h i l e b yb e z n gb r o k e n s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p ys h o wt h a tt h eb r o k e ns i l k h a v em o r ep o r o u sa n df i n ef i b r e st h a nn o tb r o k e no n e a d h e s i v e n e s sr a t e s o fc h o n d r o c y t ew e r e6 7 3 、8 4 2 a n d7 7 8 t ob r o k e n s i l k 、s l i g h t d i s s l o v e ds i l ka n dp g ar e s p e c t i v e l yb yc e l lc o u n t i n g ，w h i l ea d h e s l v e n e s s r a t e so fc h o n d r o c y t ew e r e6 8 3 、8 3 3 a n d7 7 r e s p e c t l v e l yb ym t tm e t h o d t h e r ea r es i g n l f i c a n ts t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eb r o k e ns i i k a n ds l i g h td i s s o l v e ds i i k t h es i m i l a rr e s u l tw a sp r e s e n tb e t w e e nt h e b r o k e ns i l kg r o u pa n dp g ag r o u p r e s u l t so fp a r t3 ：r e s u l ts h o w e dt h a t t h ec e l la t t c h e dt ot h ef i b e ri nt h ef o r mo fs i n g l e ，m u l t i l a y e ro rm a s s t h ec e l la p p e a r e dt ob es p h e r ea n da d h e r e dt ot h es c a f f o l d sg r a d u a l l y c o l l a g e nm a t r i c e sg e n e r a t e d1 i k es p i d e rb yt h ed a y5 w i t ht h ep r o l o n g o fc e l lc u l t u r e ，t h ec o n t o u ro ft h ec e l lb e c a m eu n c l e a r ，h es t a i n i n g i n d i c a t e dt h a tm a t r i x l a c u n aw a s a b l e t o b eo b s e r v e d i i n u n o h i s t o c h e m c a ls t a i n i n gs h o w e dp o s i t i r ec o l l a g e ni ii nb o t h s i l k a n dp g as c a f f o l d s f o u rw e e k sa f t e rc u l t u r e d ，c a r t i l a g i n o u st l s s u ew a s o b s e r v e di nt h ec a r t i l a g ec o n s t r u c t s w i t hs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ， t h ec h o n d r o c y t e sa d h e r e dt oe a c ho t h e ra n dc l u n gt ot h es c a f f o ld t h e d e n s l t yo fc h o n d r o c y t e si ns i i kg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a ti np g ag r o u p c o n c l u s i o n s ：1 ) i ti sa p p r o v e dt h a ts i l kh a v eg o o db l o c o m p a t i b i l l t ya n d 4 复口人学硕士毕业论文 蚕丝作为软骨组织t 程支架材料的实验研究 w a sb i o d e g r a d a b l ei no n ey e a ri nv l v o 2 ) t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t i o nw i l l n o tp r o d u c ei n f l a m m a t o r yr e a c t i o n 3 ) d i s s o l v e dw i t hc a l c i u ms o l u t i o n s c a ns p e e du pd e g r a d a t i o no fs i l k ，a n ds l i g h td l s s o l v e di n2 0m i n u t e sh a s n oe f f e c to ns t r u c t u r ea n dp e r f o r m a n c eo fs i l k i tw a sap r o m i s i n gm a t e r i a l f o rt l s s u ee n g i n e e r i n g 4 ) t h ea d h e s i v e n e s sa n dt h eh y d r o p h i l i cp r o p e r t y o fb r o k e ns i l kw a sb e t t e rt h a nt h a to fs l i g h td i s s o l v e ds i l k ，a n dt h e a d h e s i v e n e s sr a t e so fb r o k e ns i l ki ss i m l a ra st h a to fp g a 5 ) b r o k e n s i i kc a nb eu s ea ss c a f f o l d sf o rc h o n d r o c v t e si nt h r e ed i m e n s l o n a l c u l t u r e 6 ) t h ec h o n d r o c v t e sw e r es e e d e di n t os c a f f o l d sm a d eo fb r o k e n s i l ka n dc l u n gt os i l k sw e l l g e n e r a t i n gal o to fe x t r a c e l l u l a rm a t r i c e s 1 i k es p i d e r 7 ) f o u rw e e k s a f t e rc u l t u r e d ，c a r t i l a g i n o u st i s s u ew a s o b s e r v e di nv i t r o k e yw o r d s ： s i l k ， c h o n d r o c y t e ， c e l lc u l t u r e ，t i s s u ee n g i n e e r i n g ， s c a f f o l d sm a t e r i a l s 5 复旦大学硕七毕业论文叠丝作为软骨钮织t 程支架材料的实验研究 前言 在耳鼻咽喉一头颈外科领域，由于创伤、肿瘤、先天畸形等原因造成的头颈 部组织缺损修复重建，仍是一项主要工作。随着科技的进步和人们生活水平的提 高，使得重建工作不仅要在功能上，而且要在美学上达到理想的要求，这对医生 提出了更高的要求。目前临床上常用的重建方法有三种：自体移植，异体移植和 人工材料的植入。这三种方法都取得了一定的疗效，但仍存在很多不足之处。自 体移植需要牺牲一部分自体组织作为代价，取材范围和次数有限，与受体部位不 易相配。异体移植的主要问题仍是免疫排斥反应，需要服用一定剂量的免疫抑制 剂，这对重要生命脏器的移植来说是值得的，而对耳、鼻、喉这些非重要脏器则 有些得不偿失。人工材料仍有异物排斥反应，导致感染、松动、裸露、排出等问 题。因而，探索一种新的重建方法仍是耳鼻咽喉一头颈外科面临的重要课题之一。 组织工程是近年来发展起来的一个新的研究领域，它结合了生物材料学、细 胞生物学和细胞培养生物工程技术。其最基本的思路是采集功能相关的活细胞种 植于天然或人工合成的具有一定空间结构的三维支架上，在体外培养使细胞大量 增殖，然后将其移植入体内达到形成具有一定结构和功能的组织和器官的目的 由于软骨的组织结构、细胞成分相对简单( 软骨组织内无血管、神经、淋巴分布， 只含有一种细胞即软骨细胞) ，因此，应用组织工程的方法获得临床软骨替代物用 于软骨缺损修复的研究较为成熟o ”。软骨组织工程研究需要具备三个主要条件： 足够数量的功能正常的“种子”细胞。适当的细胞外支架一基质。调节种 子细胞增殖，并维持其表型等特征的细胞因子。 细胞外基质是细胞附着的基本框架和代谢的场所，其形态和功能直接影响着 组织的形态和功能，其替代物的研究一直是软骨组织工程的关键。合成或天然的 基质支架为植入的细胞提供了依附的支架和可控制的环境，控制细胞的生长，并 在植入时作为细胞的载体。虽然软骨组织工程中基质支架的研究与应用已取得了 一些的成功，但目前应用的材料均存在着这样或那样的缺陷，与理想的支架材料 有很大的差距。如目前认为比较好的是p l a 、p 6 a ，但它导致动物的全身与局部异 物反应明显，它高度疏水、降解迅速，体内培养4 周时9 9 的网架已降解“1 ，p g a 降 解产物羟基乙酸的聚集会引起p h 值的下降，会导致细胞中毒甚至死亡”。虽然已 有学者致力于通过改进工艺来改善其降解性能和生物相容性，但目前尚未取得理 想的结果。其它的聚合物材料也在不同程度上存在生物相容性的问题。而生物相 容性较为优越的天然的支架材料则存在力学性质较差、加工成型性能差等缺陷。 在众多生物相容性良好的天然生物材料中只有胶原能与之相比。然而胶原属于异 体动物组织提取物，存在传染病毒等疾病的潜在可能性，且制作过程复杂。而蚕 6 1 1 复旦大学硕l 毕业论文盂丝作为软骨组织t 程支梨材 的实验研究 丝属于天然蛋白，来源丰富，价格便宜，去除丝胶后的丝素蛋白不具有免疫原性， 较胶原更适合组织工程研究。 蚕丝作为天然高分子材料，具备良好的力学性能，同时在生物相容性方面又 优于传统的人工合成可降解高分子材料，在医疗领域获得了广泛的应用。以蚕丝 为原料编织的手术缝合线，在体内没有抗原性，几乎不会形成血栓旧；以蚕丝制 成的剑面保护膜适用于浅度烧伤、创伤和整形外科取皮区等皮肤缺损创面的治 疗，目前丝素膜在医疗方面的用途正趋完善；而国外以丝素来修复前十字韧带的 相关研究也有报道”1 。然而目前研究较多的是它的丝素溶液，是将蚕丝纤维脱胶 后溶解于中性钙盐中经透析得到纯的丝素溶液，重新纺丝或冷冻干燥后加工成为 各种形状的生物材料。如此一来，天然蚕丝良好的力学性能完全遭到破坏，变得 又脆又硬，没有弹性，达不到作为组织工程支架所需的力学要求。 本研究就蚕丝的降解性作进一步的观察，研究化学或物理方法处理后蚕丝的 生物学特性并与软骨细胞复合构建软骨组织。 7 复1 3 大学硕 毕业论文 盔丝作为软骨组织t 程支絮材料的实验研究 第一部分蚕丝生物相容性及降解性研究 蚕丝纤维是自然界最好的天然纤维之一，主要由丝素蛋白和丝胶外壳两部 分构成，己知丝胶和丝素均由1 8 种氨基酸所组成，但其含量有异。丝素是蚕丝的 主要成分，约占蚕丝的75 80 。去除丝胶的丝纤维不会引起t 细胞调节的体 内应答嗍，可以支持细胞的黏附、分化和组织的体外形成。丝纤维作为生物材料 有如下优点0 1 ：1 有优于其它天然纤维的独特的机械特性，能与许多高性能的纤 维相毗美；2 天然纤维制成的手术缝线在临床应用已有相当长的历史；3 可加工 成膜或其它材料形式；4 表面易于化学共价修饰黏附位点和细胞因子；5 可通过 遗传工程改造丝蛋白的成分来调节分子量的大小、可结晶性和可溶性；6 在体内 外降解速率缓慢。 在蚕丝作为组织工程支架材料的研究中，蚕丝的降解性引起了人们关注。在 通常情况下，丝素蛋白除其中占总体极少部分的非结晶区队稀酸稀碱较敏感外， 蚕丝的酶降解性能极差，被认为是不能降解的“”。也有研究认为丝素蛋白是可部 分生物降解的，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等 有营养与修复的作用“。在蚕丝作为组织工程支架材料的研究中，蚕丝的降解 性引起了人们关注m i n o u r a 等认为，丝素蛋白是可部分生物降解的，其降解产物 本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用。 本实验就蚕丝的生物相容性及降解性作进一步的研究。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 - 1 蚕丝样品的制备 1 ) 脱胶：桑蚕茧( 图l ，来源：江苏海安茧丝集团股份有限公司) 洗净 后剪开取出虫体，称取l o g 茧层用0 5 n a 2 c 0 3 溶液精练2 次，除去丝胶。 浴比1 ：2 0 0 ，温度9 8 。时间3 0 m l n 。先用自来水再用蒸馏水充分洗 净，6 0 烘箱烘干备用。 2 ) 微溶：将脱胶后得到的蚕丝分别称取1 9 用c a c l 。h ：o ( 摩尔比1 ：8 ) 溶 液溶解，浴比1 ：2 5 ，温度7 0 ，分两组即溶解时间2 0 m i n 组及6 0 m i n 组， 蒸馏水洗涤2 次，沉淀于直径l o m m 培养皿底部自然干燥呈圆盘状( 图 2 ) 。剪刀剪成3 5 m 大小薄片。 1 1 2 动物及分组 实验用昆明小鼠5 4 只( 由复旦大学动物实验中心提供) ，雌雄不限，体重 3 2 3 6 9 ，平均3 4 9 ，鼠龄均为1 月，随机分为：c a c l 2 处理2 0 m i n 组( n = 1 8 ) ， 8 复旦大学硕士毕业论文 蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究 c a c l 。处理6 0 r a i n 组( n _ 1 8 ) ，c a c l 2 未处理组( n = 1 8 ) 。 图1 ：未处理桑蚕茧图2 ：脱胶、钙盐微溶后蚕丝形成絮状沉 淀 1 1 3 试剂和配制 1 ) 0 5 n a 勰 2 ) c a c l 。h 2 0 ( 摩尔比1 ：8 ) 3 ) 脱毛剂8 n a 2 s ：n a 。s8 9 溶于l o o m l 水内，搅拌均匀。 4 ) 10 9 6 甲醛固定液 1 1 4 实验器材 1 ) 天平 2 ) 电热恒温水浴锅( 上海医疗器械五厂) 3 ) 电热恒温鼓风干燥箱( 上海博讯实业有限公司医疗设备厂) 4 ) 无菌手术包：无菌巾、纱布、刀片、刀柄、血管钳、镊子、持针器、 针、线等。 1 2 实验方法 1 2 1 麻醉方法：所有小鼠均采用全身麻醉，腹腔缓慢注射氯胺酮2 0 m g k g 。 1 2 2 手术方法：小鼠全麻后，固定于手术台上，背部术区8 n a 2 s 脱毛后，局 部皮肤使用安而碘消毒，铺无菌手术洞巾，剪开背部颈下皮肤约l c m ，每 只小鼠植入制备好的蚕丝材料3 块。3 - 0 丝线缝合皮肤。 2 取材及实验结果 术后动物由本院动物实验中心饲养，术后无不良反应，术区及邻近皮肤无 红肿、水肿、破溃及异常隆起等。埋植术后1 月、2 月、3 月、4 月、6 月、8 月， 每组各处死小鼠2 只，取出材料。埋植术后1 2 月，处死剩余小鼠。埋植术后1 月、2 月、3 月、4 月时可见材料表面包裹一薄层纤维结缔组织，外形较植入时 略有缩小( 图7 、图8 ) 。6 个月时c a c l 。处理6 0 r a i n 组发现1 块材料消失。8 个月 9 复旦大学硕士毕业论文蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究 时c a c l 2 处理2 0 r a i n 组有1 块及c a c l 2 处理6 0 r a i n 组有2 块材料消失。1 2 个月时 分别有7 块和9 块消失( 表1 ) 。以上结果提示蚕丝已降解可能。 组织病理学检查可见，蚕丝埋植体内1 月，较多异物巨噬细胞和淋巴细胞浸 润，蚕丝表现为染色均匀异物( 图3 ) 。最初几月各组均可见异物巨细胞排列于 蚕丝周围，随月份增加逐渐减少，少见白细胞及淋巴细胞浸润( 图5 ) 。体内埋 植2 月后多数切片均可见蚕丝有裂解现象( 图4 ) ，c a c l ：处理6 0 r a i n 组较2 0 r a i n 组出现早且明显。6 个月的组织切片中可以观察到蚕丝局部结构消融现象( 图6 ) 。 表t ：蚕丝埋植体内各月数量变化( 块) 确切概率法检验埋植体内1 2 个月时降解率各处理组之间无统计学差异( p 0 0 5 ) ，处理组与未处理组之间有统计学差异( p 0 0 5 ) 图3 ：h e x 2 0 0 蚕丝埋植体内1 月，较多异物巨噬细胞和淋巴 细胞浸润。蚕丝表现为染色均匀异物。 l o 复旦大学硕士毕业论文 蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究 图5 ：h e 4 0 0 蚕丝埋植体内4 月，蚕丝周围仅可见少量成纤维 细胞及淋巴细胞。蚕丝截面裂纹明显。 复旦大学硕士毕业论文 蚕丝作为软骨组织工程支架材科的实验研究 图6 ：h e x 2 0 0 蚕丝埋植体内6 月，可以观察到局部结构溶解消失。 图7 ：埋植1 月取出时，蚕丝材料形状 大小基本没变。 图8 ：埋植8 月时，可见材料明显缩 小变薄。 1 2 t 复哩大学硕l 毕业论文蚕丝作为软骨以1 织丁程支架材暮i 的实验研究 3 讨论 蚕丝是人类最早利用的天然材料之一，作为一种性能优良的纤维，主要应用 于纺织品中。近来它还应用于生物技术、医药、精细化工等诸多方面，如手术后 的缝合线、涂料、化妆品、药物的缓慢释放、分离膜及生物活性物的固定化和生 物传感器的制作等。蚕丝具有纯度高，来源广等一系列优点。尤其我国是丝的生 产大国，家蚕生丝产量己占世界一半，如能更好的利用蚕丝将会带来巨大的经济 收益。 天然桑蚕丝是有十八种氨基酸按不同比例和空间组合而成的一种蛋白纤 维，由丝素蛋白( f l b r o i n ) 和丝胶( s e r i c i n ) 两部分组成。丝胶包裹丝素蛋白， 约占总重的2 5 ，丝素蛋白约占7 0 ，蚕丝中还有5 的杂质。丝素蛋白以反平 行折叠链构象( p s h e e t ) 为基础，形成直径大约为l o n m 的微纤维，无数微纤维 密切结合组成直径大约为1i lm 的细纤维，大约1 0 0 根细纤维沿长轴排列构成直 径大约为1 0p m 1 8l lm 的单纤维，即蚕丝蛋白纤维。丝素蛋白中包含1 8 种氨基 酸，其中侧基较为简单的甘氨酸( g l y ) 、丙氨酸( a l a ) 和丝氨酸( s e r ) 约占总组成 的8 5 ，三者的摩尔比为4 ：3 ：1 ，并且按一定的序列结构排列成较为规整的链 段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域，而带有较大侧基的苯丙氨酸( p h e ) 、 酪氨酸( t y r ) 、色氨酸( t r y ) 等主要存在于非晶区域。 丝纤维用于外科手术缝线已有几十年的历史。近年来大量的实验研究显示 丝素具有良好的生物相容性，无毒、无刺激性“”。脱胶后的丝素经加工制成 丝素膜抗原性不明显，皮下埋植试验表明无明显炎症或占位现象发生。为了确 保生物材料的安全性，宁丽等于1 9 9 8 年将用于烧伤创面保护膜的再生丝素膜按 国际标准化组织i s o 标准要求进行一系列的急性全身毒性试验、溶血试验、细 胞毒性试验以及细胞总r n a 量和细胞i 型胶原、纤维蛋白的基因表达试验，从 整体、细胞、分子三个水平综合分析认为再生丝素膜具有良好的生物相容性“”。 我们的实验同样证实了脱胶后的蚕丝生物相容性极好。埋植体内后炎症反应及 异物反应都不明显，通过组织学观察，我们可以看到，蚕丝仅在植入1 月时出 现较多的异物巨噬细胞，有白细胞浸润，植入2 月的组织学切片中蚕丝周围仅 有少量的淋巴细胞和单核细胞。植入6 月时，部分蚕丝开始降解，但降解产物 并未产生炎症反应。 目韵在组织工程领域应用和研究较多的是蚕丝的丝素再生产物，对丝纤维 的研究还很少。丝蛋白纤维是自然界最好的天然纤维之一，具有独特的机械特 性。由多股家蚕蚕丝绞合的纤维抗拉强度达5 0 0 m p a ，模量达5 1 2 g p a ；组织工 程支架材料构建中常用的聚乳酸生物材料的抗拉强度为2 8 5 0 m p a ，模量为 1 2 3 o g p a ；生物肌腱抗拉强度为1 5 0 m p a ，模量为1 5 6 p a 。蚕丝在生物力学性 复日大学硕上毕业论文蚕丝作为软骨组织t 程支架村 i 的实验研究 能方面与生物肌腱楣近，在组织工程领域可以满足维持预制形状新生组织形态 的力学要求，这是目前其他天然或人工材料所不具有的。 一直以来，蚕丝被认为是不可降解的一种生物材料，这一缺点阻碍了蚕丝 在组织工程中的应用。我们的实验在长达1 年的时间里，分阶段取出植入体内 的蚕丝，通过组织学观察不同时期蚕丝的组织相容性及降解情况。可以看出， 蚕丝的降解极为缓慢，但随着时间的延长，蚕丝结构开始松散，内部出现缝隙。 8 个月到1 年左右部分材料随着降解完全吸收，经过钙盐微溶处理后的蚕丝可 以加快这一进程，即加快蚕丝的降解时间，估计可能与溶解过程中蚕丝发生分 纤举动，其内部酶切位点暴露有关。经统计学比较，溶解2 0 m n 组和6 0 m i n 组 无明显差异。 在大多数情况下。具有生物相容性的材料在宿主细胞内降解为小分子是很 有利的，但是降解速率必须与组织的生长发育相匹配，或不能迟于组织的发育， 这种平衡可保证在宿主和移植物整合期间具有合适的机械和生物相容性。当两 者不相匹配时，就会导致组织提前成熟而失败。相对于组织工程高分子聚合材 料，蚕丝的降解速度比较缓慢，蚕丝通过一种缓慢的降解，为细胞培养基质和新 组织的形成提供足够的时间和机械支持。这与其它可降解的合成材料相比，蚕丝 显示出其优越性。 蚕丝纤维在中性钙盐二元或三元体系( 氯化钙、水和乙醇1 ：8 ：2 ) 处理下， 会发生溶解现象。根据现有的研究”，蚕丝纤维在溶解过程中具有分阶段溶解 特性，即由于蚕丝纤维内部结构的差别使其在溶解过程中弱结构更易首先被侵 蚀剥离。蚕丝结构上分结晶区和非结晶区两部分，结晶区结构致密不易发生变 化，决定蚕丝的力学性能；非结晶区结构疏松，随着外界条件的改变易发生变 化，氯化钙溶液短时间处理蚕丝后，钙离子与非结晶区的羟基侧链结合使蚕丝 纤维微丝间连接松散，发生微溶现象，但这种非结晶区的变化不会改变蚕丝的 力学性能。一般将微溶解的时间控制在2 5 m l n 内，当溶解时间延长，溶解温度 持续上升，会使得结晶区向非结晶区转变，改变蚕丝结构特性从而改变其外在 形态，甚至完全溶解。因此，微溶后的蚕丝既可加速降解又不改变其力学性能， 更适合成为组织工程支架材料，较再生丝素膜有更广阔的应用前景。 4 结论 天然蚕丝具有良好的生物相容性，脱去丝胶后埋植皮下1 月后少见急性炎症 细胞浸润。蚕丝体内1 年左右可以降解，降解产物不产生炎症反应。经过钙盐溶 解处理后降解时间加快，溶解2 0 分钟与6 0 分钟在降解率方面比较无统计学差异， 而2 0 分钟微溶解对蚕丝结构性能影响较小，更适合用作组织工程支架材料。 1 4 复日大学硕上毕业论文 蚕丝作为软骨组织丁程支架材 的实验研究 第二部分蚕丝与p g a 的细胞黏附性比较研究 在组织工程研究中，细胞与支架材料的黏附十分重要。所以细胞黏附性也成 为评价支架材料特性的重要指标之一。目前发现，影响黏附的因素主要有生物学 和材料学两个方面衄1 。蚕丝的生物相容性在前面的实验中已经得到证实。就材料 学方面来说，材料表面的亲疏水性、表面自由能、荷电特性等对材料的黏附性都 存在较大的影响。一般规律为亲水的表面有利于细胞黏附生长，高表面能的材料 表面有利于细胞的黏附与铺展。如何有目的的进行组织工程材料的表面修饰以 利于细胞黏附、增殖及分化是组织工程要解决的基本问题。目前，广泛应用的表 面修饰方法包括材料表面包被、改变表面的几何形状如粗糙度等等。 天然蚕丝完全不亲水，液体很难进入蚕丝内部，经过脱胶后亲水性有所提高。 以往蚕丝作为支架材料的研究中往往将蚕丝完全溶解于中性钙盐中得到丝素溶 液，冷冻干燥后制成各种形状的支架材料，经过上述处理的蚕丝亲水性得到了很 大提高，但失去了原有的纤维样结构及力学性能；也有在蚕丝表面包被其他亲水 性物质以改变其亲水性的研究。我们在研究中发现经粉碎机切割的蚕丝表面性状 及亲水性都有所改