（园林植物与观赏园艺专业论文）相思树离体培养与人工种子制作.pdf

福建农林人学硕士学位论文 摘要 摘要 本研究以厚荚相思( a c a c i ac r a s s i c a r p a ) 、黑木相思( 一m e l a n o x v l o n ) 、灰木相思( 一 i m p l e x a ) 、荚竹桃相思( n e r i f o l i a ) 、薄荚相思( 4 1 c p t o c a r p a ) 、卷荚相思( 正c i n c i n n a t a ) 、 纹英相思( a u l a c o c a r p a ) 和台湾相思( 一c o n f u s a ) 等相思树的种子、幼胚、茎段为外植 体，进行相思树的离体培养与人工种子制作研究。试验以厚英相思、台湾相思为主要研究对 象，进行如下研究：厚荚相思高效离体再生体系的建立：台湾相思等树种的愈伤组织 诱导、悬浮细胞系的建立及其原生质体的分离：黑木相思、灰木相思、薄荚相思、卷荚相 思、纹英相思的离体繁殖；厚荚相思人工种子制作及其r a p d 分析等。主要研究结果如 下： 1 相思树种子预处理方式对种子离体萌发的影响。采用浓硫酸结合沸水浸泡预处理方 式( 浓硫酸2 5r a i n + 沸水浸泡2 0m i n ) 处理厚荚相思种子，种子离体萌发率可达9 5 o 。采 用该方法处理多种进口相思原种，在离体条件下都可达8 0 0 - 9 0 o 的萌发率。 2 厚荚相思高效离体再生体系的建立。试验结果表明：天然添加物对增殖率的影响效 果是香蕉匀浆物 番茄匀浆物 相思树叶片；用1 2m s + 0 i o 执c 培养基在短期内可达到快速 增殖、壮苗、生根的同步效果；以沙子：相思树林地上表土( 3 ：1 ) 作为移栽基质，移栽成 活率可达8 7 5 。 3 应用石蜡切片技术进行厚荚相思绿色瘤状物( g t t ) 的组织细胞学观察。观察表明： 绿色瘤状物同时具有不定芽发生和体细胞胚胎发生2 种途径；不定芽原基与体细胞胚起源于 茎段基部所形成的愈伤组织表层细胞，属于外起源；体细胞胚经历了原胚、球形胚、心形胚、 子叶胚阶段。 4 相思树愈伤组织系的建立与长期继代保持。试验以相思树种子离体萌发的下胚轴、 幼胚为外植体诱导愈伤组织。研究结果表明：采用0 5m g l 一2 , 4 d 和2 0m g l 。b a 的激素 组合有利于愈伤组织的诱导：诱导出的淡黄、松散的愈伤组织可在附加0 5m g l 2 , 4 - d 、2 0 m g l ib a 和3 0 0m g r l h 的培养基中长期继代。 5 台湾相思悬浮培养细胞系的建立与长期保持。研究表明：选用淡黄、松散、增殖旺 盛的愈伤在2w k 内可快速建立悬浮细胞系：蔗糖是悬浮细胞系保持的理想碳源；采用固一 液轮回培养法可对悬浮细胞系进行长期保持。 6 台湾相思悬浮细胞系原生质体的分离纯化。以生长旺盛、松散的悬浮细胞为材料， 在含1 纤维素酶和2 果胶酶的c p w 一1 3m 酶解液中，在黑暗静置条件f 酶解1 6h ，可获 得产量和存活率都较高的原生质体。 7 厚英相思人工种子制作技术体系的建立。研究表明：以厚荚相思2 - 3m m 的微芽为 包埋材料，在海藻酸钙包埋系统中2 海藻酸钠为最佳的包埋浓度，2 0m i n 为最佳的包埋时 间；中空海藻酸钙包埋法优于海藻酸钙包埋法，用该法制成的人工种子无菌萌芽率高达 1 0 0 ，转株率达8 3 5 ；营养物质和激素的使用有利于人工种子萌芽率的提高；人工种子 较适的贮藏温度为1 5 。 8 厚荚相思人工种子再生植株的r a p d 检测。对相同材料来源的厚荚相思人工种子再 生植株进行r a p d 检测，结果表明：厚荚相思人工种子再生植株之间的r a p d 图谱不存在 显著差异，说明厚荚相思人工种子具有高度的遗传稳定性。 总之，本研究摸索出了相思树种子高频率离体萌发技术；应用石蜡切片对g t t 进行组织 细胞学观察，首次发现g t t 具有不定芽发生和体细胞胚胎发生2 种混合途径；建立了台湾相思 悬浮细胞系并分离原生质体；率先建立了相思树人工种子技术体系，对相思树离体快繁和生 物技术育种具有重要意义。 关键词：相思树；离体再生；石蜡切片：悬浮细胞培养；人工种子 r a p d 福建农林大学硕士学位论文摘要 i nv i t r oc u l t u r ea n d p r o d u c t i o no fa r t i f i c i a ls e e d si na c a c i as p p a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n tt h es e e d s 。i m m a t u r ee m b r y o sa n ds t e mn o d e sw e r eu s e da se x p l a n t sf o ri n v i t r oc u l t u r ea n da r t i f i c i a ls e e d sp r o d u c t i o ni na c a c i as p e c i e ss u c ha sa c a c i ac r a s s i c a r p a , a m e l a n o x v l o n ，a i m p l e x a ，a h e r 扣妇a t c p t o e a r p a ，a e i n e i n n a t a ，a a u l a c o c a r p aa n da c o n f u s a ， e s p e c i a l l yi na c r a s s i c a r p aa n da c o n f u s a 1 1 1 em a i nc o n t e n t so ft h ee x p e r i m e n tw e r e a s f o l l o w s ：e s t a b l i s h m e n to ft h es y s t e mo ft h eh i g h - e f f e e i e n c yr e g e n e r a t i o ni n v i t r o i na c r a s s i c a r p a ；i n d u c t i o no fc a l l u s ，c u t u r oo fs u s p e n s i o n sa n di s o l a t i o no fp r o t o p l a s t si na c a c i a s p e c i e ss u c ha sa c o n f u s a l ；i nv i t r op r o p a g a t i o no f am e l a n o x v l o n , a i m p l e x a , a 1 c p t o c a r p a , a c i n c i n n a t a , a 口“肠甲口；p r o d u c t i o no fa r t i f i c i a ls e e d sa n dr a p da n a l y s e si na c r a s s i c a r p a t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tp r e - t r e a t m a n t so nt h eg e r m i n a t i o no ft h ea c a c i as e e d s t h ei nv i t r o g e r m i n a t i o nr a t er e a c h e d9 5 u n d e rt h ep r e - t r e a t m e n to ft h et h i c kv i t r i o lf o r2 5m i nc o m b i n e d w i t ht h eb e f l e dw a t e rf o r2 0m i no na c a c i a e r a s s i c a r p as e e d s u n d a rt h ep r e t r e a t m e n to nt h e s e e d so f s e v e r a li m p o r t e d a c a c i as p p t h e ya l lg e r m i n a t e da th i g hf r e q u e n c yw i t h8 0 0 - 9 0 0 2 e s t a b l i s h m e n to ft h es y s t e mo ft h eh i g h - e f f e c i e n c yr e g e n e r a t i o ni na c r 口s s i c n r p d t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c t so f t h en a t u r a la d d i t i v e so nt h ep r o l i f e r a t i o nr a t ew a sa s t h eo r d e r b a n a n a j u i c e t o m a t o j u i c e l e a f o f a ，c r a s s i c a r p a ；t h er a p i dm u l t i p l i c a t i o n ，s h o o t g r o w t ha n dr o o t i n gc o u l db ec o n d u c t e di nt h es 啪et i m eo nt h e1 2m sm e d i u mw i t h0 1 a c ： a n dt h es u r i v a lr a t ew a su pt 08 7 5 a f t e rt r a n s f e r i n t ot h em i x t u r eo fs a n da n dt h es o i lf r o m a c a c i as p p f o r e s t ( 3 ：1 ) 3 t h eh i s t i o e y l i co b s e r v a t i o nt h eg r e e nt u r n o u t - s h a p e dt i s s u e s ( g 网b yp a r a f f i ns e c t i o ni n a c a c i ac r a s s i c a r p a t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tb o t ht h ea d v e n t i t i o u sb u df o r m a t i o na n ds o m a t i c e m b r y o g e n e i se x i s t e di nt h eg t ta n db o t ho r i g i n a t e df r o mt h es u r f a c ec e l l so fc a l l u sf r o mt h e b a s eo fs h o o t s ，w h i c hb e l o n g e dt oe x o g e n e s i s t h es o m a t i ce m b r y o g a n e i sp o c e s s e dt h e s es t a g e s s u c ht h ep r e m b r y o s ，g o u b l ee m b r y o i d s ，h e a r t e d s h a p e de m b r y o i d sa n dc o t y l e d o ne m b r y o i d s 4 i n d u c t i o na n d l o n g - t e r ms u b c u l t u r eo f c a l l u s i n a c a c i as p p t h e h y p o c o t y la n d i m m a t u r e e m b r y o sw e r eu e s e d e x p l a n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o m b i a n t i o no f h o r m o n e so f 0 5 m g l 12 , 4 da n d2 0m g l 1b af a l i c i a t e dt oi n d u c ec a l l u s a n dt h et y p eo f f r i a b l el i g h t - y e l l l o w c a l l u sc o u l db em a i n t a i n e df o ral o n gt i m eo nt h 6m e d i u mw i t h0 5m g l 2 , 4 - d ，2 0m g l 1b a a n d3 0 0m g l 1 l h 5 e s t a b l i s h m e n ta n dl o n g - t e r mm a i n t e n a n c eo fc e l ls u s p e n s i n si na c o n f l i s a t h er e s u l t e d s h o w e dt h a tt h es u s p e n s i o n se e l il i n e sc o u l db eb eq u i c k l ye s t a b l i s h e dw i t h i n2w e e k sf r o mt h e l i g h t - y e l l o wf r i a b l ev i g o r o u sc a l l i ；s u c r o s ew a st h eb e t t e rc a r b o ns o u r c ef o rm i a n t e n a n c eo f s u s p e n s i o nc e l ll i n e s ；a n dt h es u s p e n s i o n sc o u l db el o n gs u b c u l t u r e da l t e r n a t i v e l yc u l t u r e dw i t ht h e s o l i da n dl i q u i dm e d i a 6 i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fp r o t o p l a s t si na c o n j 船a h i g h - y i e l da n dh g i h v i a b i l i t y p r o t o p l a s t sw e r eo b t a i n e df r o mt h ev i g o r o u sd i s p e s i v es u s p e n s i o n sw h e nt h e yw e r ei n o c u l a t e di n t o t h ec p w 一1 3 me n z y m a t i cm i x t u r ec o n t a i n i n gl e e l l u ! o s ea n d2 p e c t i n a s ea n dk e p ts t i l li n d a r k f o r l 6h 7 d e v e l o p m e n to f t h et e c h n i q u eo f t h ep r o d u c t i o no f a c r a s s i c a r p aa r t i f i c i a ls e e d s 2 - 3m m l o n gs h o o tc u t sw e r eu s e d e n c a p s u l a t i n gm a t e r i a l s 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e2 s o d i u m a l g i n a t ea n d2 0r a i no f e n c a p s u l a t i n gt i m ew e r et h eb e s tf o rt h es y s t e mo f c a l c i u ma l g i n a t eb e a d s ； i i i 福建农林大学硕士学位论文 摘要 a n dc a l c i u ma l g i n a t eh o l l o wb e a d sw a sb e t t e rt h a nc a l c i u ma l g i n a t eb e a d s ，t h eg e r m i n a t i o nr a t eo f a r t i f i c i a ls e e d sr e a c h e dt o1 0 0 a n dt h er e g e n e r a t i o nr a t er e a c h e dt o8 3 5 ：t h em e d i aw i t h s o o r c ca n dh o r m o n e sw e r eg o o dt ot h eg e r m i n a t i o n ；1 5 w a ss u i t a b l ef o rt h es t o r a g eo ft h e a r t i f i c i a is e e d s 。 8 r a p da s s a yo nr e g e n e r a t e dp l a n t so fa r t i f i c i a ls e e d so fa c r a s s i c a r p ar a p da n a l y s e s i n d i c a t e dt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ep a t t e r n sa m o n gt h er e g e n e r a t e dp l a n t so f a r t i f i c i a ls e e d sf r o mt h es a m em a t e r i a l s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ea r t i f i c i a ls e e d sb eh g i h l ys t a b l e i nh e r e d i t y a saw h o l e ，i nt h i se x p e r i m e n tt h et e c h n i q u eo f h i g h - f r e q u e n c yg e r m i n a t i o n nv i t r oo fs e e d s w a sd e v e l o p e di nt h ea c a c i as p p ；t h eh i s t i o c y t i co b s e r v a t i o nb yp a r a f f i ns e c t i o ni nt h eg t t i n d i c a t e dt h a tb o t ht h ea d v e n t i t i o u sb u df o r m a t i o na n ds o m a t i ce m b r y o g e n e i se x i s t e di nt h eg r r ： t h es y s t e m so fs u s p e n s i o n sa n di s o l a t i o no fp r o t o p l a s t sw e r ee s t a b l i s h e di nac o n f u s a ；a n dt h e t e c h n i q u eo f t h ep r o d u c t i o no f a r t i f i c i a ls e e d sb ys h o o tc u t sw a sf i r s td e v e l o p e di na c r a s s i c a r p a ， w h i c hw o u l db eo fg r e a ti m p o r t a n c ef o ri nv i t r om u l t i p l i c a t i o na n db r e e d i n gb yb i o t e c h n o l o g yi n a c a c i a k e yw o r d s ：a c a c i as p p ；i nv i t r or e g e n e r a t i o n ；p a r a f f i ns e c t i o n ；s u s p e n s i o n ；a r t i f i c i a ls e e d s ； r a p d 福建农林大学硕士学位论文 缩写词 缩写词 缩写词 英文全称 中文全称 a c a c t i v a t e dc a r b o n 活性炭 a d a d e n i n e 6 b a 6 - ( b e n z y l a m i n o 、p u r i n e d d a y 2 , 4 d 2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d d n t p d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e d t a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d g a g i b b e r e l l i n s g t t g r e e nt u m o u r - s h a p e dt i s s u e h h o u r i a a i n d o l e - 3 a c e t i ca c i d i b a i n d o l e - - 3 - b u t y r i ca c i d l h l a c ( o ) t a l b u m i nh y d r o l y s a t e k t 6 - f u r f u r y l a m i n op u r i n e m l m i l l i l i t r e m m o i m i l l i m o l i l m i n m i n u t e m s m u r s a h i n g ea n ds k o o g n a a a - n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a p d r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a t a q u t h e r m o sa q u a t i c u sp o l y m e r a s e u n i t 腺嘌呤 6 一( 苄胺基) 嘌呤 天 2 , 4 一= 氯苯氧乙酸 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 赤霉素 绿色瘤状物 小时 吲哚乙酸 吲哚丁酸 水解乳白蛋白 6 一糠氨基嘌呤 毫升 每升毫摩尔 分钟 m s 培养基 a - 萘乙酸 聚合酶链式反应 随机扩增多态性d n a 嗜热水生菌d n a 聚合酶 酶活性单位 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立 完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中 已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一 同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被 查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。匿厂 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：硎：榭埒日期： 一， f ，f 指导教师亲笔签名：日强：凇。，| 福建农林大学硕士学位论文 篇一章引言 第一章 引言 相思树( a c a c i as p p ) 属豆科含羞草亚科金合欢属，全世界约有1 2 0 0 种，主要分布在 澳大利亚、非洲、印度和美洲( s i m m o n s ，1 9 8 7 ) 。相思树喜光照，干型通直，叶形奇异，冠 幅优美，具有对土壤适应性强，耐干旱瘠薄、病虫害少、能改良土壤和速生丰产的特点；其 生长量、制浆性能和纤维质量都可和桉树相媲美甚至具有更优异的性能而更值得推广种植 ( 龚木荣，2 0 0 1 ) 。目前已知具有较高利用价值的相思树有1 0 0 多种，原产于我国的只有台 湾相思叫c o n f u s 。我国从6 0 年代开始引种。至今己引种成功2 0 多种。现已有多种相思 树在我国南方广东、广西、海南、福建等地大面积造林，如厚荚相思( 爿c r a s s i c a r p a ) 、马 占相思“m a n g t l g r n ) 和大叶相思叫a u r i c u l a e f o r m i s ) 等。 我省引种的相思树多为澳大利亚相思。主要有大叶相思、马占相思、纹荚相思( a a u l a c o c a r p a ) 、厚荚相思、灰木相思似i m p l e x a ) 、黑木相思am e l a n o x v l o n ) 、夹竹桃相思口 n e r i f o l i a ) 等。大叶相思、马占相思生长迅速，适应性强，生物量高，混交性能好，但较不耐 寒；纹荚相思、厚荚相思能耐干旱、瘠薄和轻霜，根能固氨，抗风力较强；灰木相思、黑 术相思、夹竹桃相思是中亚热带用材树种，能生长于各种不同酸性土壤及裸露山顶，耐寒， 速生( 韩金发，2 0 0 5 ) 。相思树在我国南方短周期工业原料林发展、水土保持和丰富林木种 质资源等方面具有重要的作用和地位，正为当地森林生态建设和优莨纸浆材料的生产发挥着 积极作用( 陆道调等，2 0 0 4 ) 。 目前相思树主要是以播种繁殖和扦插繁殖为主，但由于目前相思树种子紧缺，良种主要 依靠进c i ，成本昂贵，而且播种繁殖要求条件严格，萌发率较低；而优良株系较少，扦插繁 殖因单宁含量较高，插条生根较困难( 陈青度，1 9 9 8 ) 的缺陷，极大地限制了当前相思树在造 林生产实践中的推广和应用。因此，进行相思树离体再生体系的建立及其人工种子制作研究， 是生产上亟需解决的问题。相思树离体再生体系的建立及制作人工种子，可以为相思树工厂 化育苗、细胞杂交、突变体的筛选、遗传转化等研究奠定技术基础。 1 相思树( a c a c i as p p ) 生物技术研究进展 林木生物技术作为生物技术的组成部分，虽然起步较晚，但已在林木遗传改良等方面发 挥了巨大的作用。目前，林木生物技术研究主要集中在基础研究、基因工程及细胞工程等领 域。林木基因工程的研究主要集中在抗性育种及品质改良等方面。近十几年来，已有多种树 木先后进行了抗病虫、抗除草剂、抗盐、抗早和抗寒等领域的基因工程研究( 曾燕如，2 0 0 3 ) 。 林木细胞工程在细胞胚胎发生、植株再生、人工种子技术、原生质体培养、细胞杂交和体细 胞突变体的筛选与利用等方面已取得了令人瞩目的进展。 相思树作为一种新兴的优势树种，对它的生物技术研究在国内外已相距展开，并已取得 了一定的进展。在此将近几十年来国内外对相思树生物技术研究做一个综述，为本文的研究 提供理论依据。 1 1 离体器官发生 1 1 1 器官发生型 器官发生型是指外植体在一定的条件下先脱分化形成愈伤组织，而后再分化形成各种植 物器官。t o m a r ( 1 9 9 8 ) 研究认为外源光敏色素的水平是决定着外植体是直接器官发生或间 接器官发生的主要因素。目前对相思树的器官发生型研究主要集中在外植体类型、培养基的 使用上。 外植体类型大叶相思外植体可从田间采集或以无菌苗为来源( r a o ，1 9 8 9 ) ，也曾尝试着 福建农林大学硕士学位论文 第一章引言 从_ s e n e g a l 高度分化的组织如形成层或韧皮部诱导可分化的愈伤( h u s t a c h e ，1 9 8 6 ) 。也曾从 马占相思的子叶、子叶节、胚轴、叶片和茎段成功诱导不定芽( d o u g l a s ，2 0 0 0 ；x i e ，2 0 0 1 ) 。 m i t t a l ( 1 9 8 9 ) 用大叶相思子叶、下胚轴为外植体诱导愈伤但没能分化出不定芽。颜幕勤( 1 9 8 2 ) 用大叶相思下胚轴、茎尖、子叶诱导愈伤。王金祥等表明台湾相思的子叶、下胚轴是诱导愈 伤的理想外植体( 王金祥等，2 0 0 0 ) 。 生长调节剂生长素和细胞分裂素在器官发生型途中起着重要的作用，在愈伤诱导中生长素 的诱导效果是2 ，4 - d n a a i a a i b a 。细胞分裂素中b a 可用来进行大叶相思、马占相思丛 生芽的诱导( m i t t e l ，1 9 8 9 ：d o u g l a s ，2 0 0 0 ) 。t d z 用于马占相思愈伤组织不定芽的诱导 ( x i e ，2 0 0 1 ) 。b a 可增加致密愈伤组织的诱导这种愈伤被认为更有利于植株再生，k t 也有这种效果，在大叶相思、儿茶和藤金合欢中得到体现。而国内有报道认为高浓度的b a 有利于愈伤组织的增殖，不利于芽的分化( 陈桂芳，2 0 0 4 ) 。 基本培养基m s 、1 2m s 都可用相k o a 再生体系的建立，也有报道m s 培养基能用于肯氏 相思愈伤的诱导并使其分化( 洪丽萍，1 9 9 7 ) 。在诱导儿茶分化时可用w p m 或1 2w p m ( d a s ， 1 9 9 6 ) ；近期d o u g l a s 等( 2 0 0 0 ) 用d k w 培养基获得马占相思的愈伤组织分化不定芽：s h 培养基被用于彳k o a 愈伤的诱导和芽的增殖。颜幕勤( 1 9 8 2 ) 用e r 以大时相思下胚轴、子叶、 茎尖为外植体诱导愈伤。 添加弃j 在诱导a k o a 和藤金合欢器官型发生时添加1 0 椰汁可达到良好的效果( s k o l m e n ， 1 9 7 6 ) 。r a n g ar a o 和p r a s a d 报道了用l 谷氨酰胺、l 脯氨酸可加快大叶相思愈伤的诱导和芽 的再生( r a n g ar a o ，1 9 9 1 ) 。 1 1 2 器官型 器官型发生披广泛应用于林业树种的离体快繁中，目前已经建立了多种相思树的再生体 系，如a s e n g a l 、a n i l o t i c a 、藤金合欢、大叶相思和马占相思( v e n g a d e s a ne ta l ，2 0 0 2 ) 。 外植体类型早期国外曾有关于用大叶相思种子离体萌发的茎段获得丛生芽的报道( m i t t a l ， 1 9 8 9 ) 。j o n e s ( 1 9 9 0 ) 用茎段和节间、叶状柄在离体条件下获得多种相思树的不定芽。有 人用马占相思4 年生优树的成熟茎段、嫩茎、种子萌发的无菌苗的下胚轴和腋芽为外植体 ( d a r u s ，1 9 8 9 ：t o d a ，1 9 9 5 ；m o n t e u u i s ，2 0 0 0 ) 。国内也有关于马占、大叶相思腋芽培养 再生植株的报道( 张宏伟等1 9 9 5 ) 。另外也有用黑荆相思种子离体萌发的一个月的无菌苗 的上胚轴、1 0 年生茎段为外植体( q u o i r i n ，2 0 0 2 ：b e c k ，1 9 9 8 ) ；离体培养2 0d 的顶端分生 组织也曾被用于克隆黑荆相思的材料( h u a n g 。1 9 9 4 ) 。据g a l i a n a ( 1 9 9 1 ) 报道用马占相思 幼嫩的外植体更容易诱导不定芽发生。赖家业( 2 0 0 3 ) 认为采用的嫩茎不宜过于幼嫩，应用 半木质化腋芽饱满即将萌发的茎段。2 0 0 3 年高洁也发表了关于大叶相思茎段腋芽的组织培 养技术( 高洁，2 0 0 3 ) 。 培养基m s 培养基被广泛用于相思树组织培养中国外报道了用m s 培养基可诱导多种相思 树不定芽萌发、抽长和生根。用改良的m s 培养基即把m s 中的盐类减至1 ，2 、1 3 、1 5 、3 4 有利于马占相思、黑荆相思、as e n e g a l 、a 枷i 出的培养( v e n g a d e s a ne ta l ，2 0 0 2 ) 。m i t t a l ( 1 9 8 9 ) 用b 5 培养基成功用于大叶相思的离体培养。其它培养基如w h i t e 、s h 也成功的用于 a a l b i d a 和a n i l o t i c a 的培养。 国内有人用改良的m s ( 8 0 0m g l n f l 4 n 0 3 、3 4 0m g l k i - i z p 0 4 、3 4m g 。l ” z n s 0 4 7 h 2 0 、2 0m g l o 盐酸硫胺素) 诱导5 年生嫩茎( 赖家业，2 0 0 3 ) 。蔡玲等人( 2 0 0 3 ) 通过改良m s 铵态氨与硝态氮比例( n h + n 0 3 h n 0 3 ) 由原来的1 9 0 0 2 5 0 0m g l “变为1 7 0 0 2 5 0 0m g l 一，认为改良m s 培养基最适合相思树组培苗的生长。不同相思树品种所需的 改良比例不同：马占相思为1 7 0 0 2 5 0 0 m g l 1 ，直干大叶相思为1 6 0 0 2 5 0 0 m g l 一、杂交 相思为1 8 0 0 2 5 0 0 m g l _ 1 、卷荚相思为16 5 0 2 5 0 0 m g l 、厚荚相思为17 5 0 2 5 0 0 m g 。 2 福建农林大学硕士学位论文 第一章引言 周丽( 1 9 9 6 ) 也通过降低m s 中n h 4 n 0 3 的含量来培养卷荚相思。徐位力( 2 0 0 3 ) 用c a 2 上浓度 为常规m s 培养基浓度( 2 5 5g - l 1 ) 的0 5 8 倍来优化马占相思增殖培养基。张月娇( 2 0 0 3 ) 通过降低m s 总含盐量。增加维生素类含量和种类对5 年生厚荚相思茎段进行诱导。此外e r 、 b 5 也用于马占相思、大叶相思的离体培养( 容世清，1 9 9 7 i 颜幕勤，1 9 8 2 ) 。 生长调节剂添加一定范围浓度的生长素和细胞分裂素是相思树离体培养成功的关键。在相 思树中可以单独使用细胞分裂素，6 - b a 是最常使用的细胞分裂素。单独用b a ，或与k t 、z t 结合使用能使黑荆相思的丛生芽增殖( v e n g a d e s a r le ta l ，2 0 0 2 ) 。周丽等( 1 9 9 6 ) 在卷荚相思 的离体培养对用b a 与k t 组合。台湾相思子叶在添加0 5m g l 4 p u 可直接诱导出不定芽( 王 金详等，2 0 0 1 ) 。周传明等( 2 0 0 2 ) 以厚荚相思种子无菌苗为外植体，试验结果表明g a ， 对b a 有增效作用因种子内含有较高浓度的g a 3 ，因此应注意b a 的使用量。但是如果是以 成年树为外植体则在启动培养时就应使用较高浓度的b a 。赖家业( 2 0 0 3 ) 以5 年生的厚荚相 思嫩茎为外植体。用2 0m g l _ 1 b a 来诱导腋芽萌发：在继代时应降 k i b a 浓度，否则增殖的芽 丛密集，芽苗高度低、有效苗减少。该现象也表现在银荆相思上，低浓度的b a ( 0 ，5 1 0m g 屯。) 有利于银荆相思子叶及茎尖的不定芽诱导，高浓度的b a ( 2 0 3 0m g l 。) 则有利于半木质 化带腋芽茎段的萌发( 陈桂芳，2 0 0 4 ) 。周丽华等( 1 9 9 6 ) 也在莞屏1 号相思试验中表示激 素浓度高有利于芽的分化。但不利于芽的伸长，且芽生长不正常。容世清等( 1 9 9 7 ) 对马占 相思组织培养时发现b a 达到一定水平时，出现羽状复叶：低于某一水平时，出现叶状柄， 有“返幼”和“保幼”的作用，单独使用k t 对增殖作用不明显。张月娇( 2 0 0 3 ) 在对厚荚 相思组培育苗试验中也表明不同b a 浓度对有效芽的形成有显著影响，不同k t 浓度对有效芽 的形成影响不显著。但蔡玲等( 2 0 0 3 ) 对5 种不同的相思树离体研究后表明，对于卷荚相思、 大叶相思k t 更有利于芽分化。 细胞分裂素与生长素相结合使用。周传明( 2 0 0 2 ) 以厚荚相思种子萌发的无菌苗为外植 体，试验结果表明1 5m g l - 1 6 - b a 与0 1m g l 1 n a a 结合最适合芽的分化和增殖。张宏伟 ( 1 9 9 5 ) 以1 0i t m o l l - 2 b a 结合0 5p m o l l “i b a 成功诱导腋芽萌发。i a a 也被用于相思树的 研究中，有试验表明i a a 比n a a 更有利于厚荚相思芽的诱导( 蔡玲等，2 0 0 3 ) 。 有人认为n a a 有利于银荆相思生根( 陈桂芳，2 0 0 4 ) ，周丽等( 1 9 9 6 ) 则用2m g l 1 i b a 诱导卷荚相思生根，生根率可达8 5 ；裘珍飞( 2 0 0 2 ) 用4 m g - l - 1 i b a 诱导马占相思生根。 也有人认为1 b a 与n a a 相结合对杂交相思的生根诱导较好( 周丽华等，1 9 9 6 ) ，以n a a ：i b a 为2 ：1 或3 ：l 有利于黑木相思根的诱导( 苏秀城，1 9 9 9 ) ，而张宏伟等( 1 9 9 5 ) 认为n a a ： i b a 以l ：2 或1 ：3 比例较适合大叶相思、马占相思生根，同时也认为生理年龄幼态的芽苗生 根比生理年龄成熟的芽苗容易。 添加物有国外学者将腺嘌呤、l 谷氨酰胺、水解酪蛋白、尿素用于相思树的组织培养中。 腺嘌呤的添加范围在7 8 2 7 1 4u m ，腺嘌呤被认为有刺激细胞生长和促进芽形成的作用。它 为细胞提供育机氮源，可比无机氮源更快的被细胞吸收利用( t h o r n ，1 9 8 1 ) 。k a u r ( 1 9 9 8 ) 和s i n g h ( 1 9 9 3 ) 在几茶和一n i l o t i c a 的不定芽诱导中添加5 0r a g l 。的l 谷氮酰胺可达到理 想的效果。研究表明添加活性炭可防止外植体愈伤化促进芽苗伸长和生根( q u o i r i n ，2 0 0 2 ) ， 国内也有相关的报道表明添加活性炭的培养基可使芽苗伸长2 - 3c m ( 周丽等，1 9 9 6 ) ，容世 清也在培养基中添加活性炭用于生根( 容世清1 9 9 7 ) 。此外也有人在多种相思树培养中添 加核黄素( 蔡玲等，1 9 9 9 ；蔡玲等，2 0 0 3 ) 、椰汁等。 抗氧化荆和吸附剂相思树园单宁含量很高，因此在培养过程中常加一些抗氧化剂和吸附剂 以减少酚类物质的毒害。维生素c 、柠檬酸、p v p 和活性炭曾用于防止相思树外植体褐化培 养中，其中维生素c 在藤金合欢腋芽增殖中防止褐变的效果比柠檬酸、p v p 好( s i n g h ，1 9 9 3 ； k u a r ，1 9 9 8 ) 。赖家业( 2 0 0 3 ) 在厚荚相思预培养中也添加了1 0m g l 维生素c 用于防止褐 变。 3 福建农林大学硕士学位论文第一章引言 1 2 体细胞胚胎发生 木本植物的体细胞胚胎发生在多种植物已经见报道。有学者认为体细胞胚胎发生是以单 细胞为起源的，这与其它以多细胞为起源的如器官发生、离体快繁是不同的( r e i n e r t ，1 9 7 7 ) 。 相思树的体细胞胚胎芨生在国外已见报道，但在国内只见关于大叶相思的报道。 1 2 1 外植体类型 相思树幼嫩的和未成熟的外植体经常被用来诱导胚性愈伤。早期的子叶、未成熟的合子 胚分别用来诱导儿茶、a n i l o t i c a 和马占相思的体胚。v e n g a d e s u n 等( 2 0 0 2 ) 从藤金合欢叶片上 诱导出胚状体，并获得再生植株。用a s e n e g a l 的子叶也可诱导体胚发生( s h a n h a n a , 2 0 0 0 ) 。 张宏伟以大叶相思下胚轴为外植体诱导出胚性愈伤( 张宏伟，1 9 9 7 ) 。 1 2 2 生长调节剂 s k o l m e n 和m a p e s 是最早用相思树的茎尖在添加2 ，4 d 的m s 培养基诱导出愈伤，但未能实 现体胚发生( s k o l m e n ，1 9 7