（作物遗传育种专业论文）粳稻“日本晴”突变体库的创建和部分重要性状的遗传分析.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 突变体是进行功能基因组学研究的重要材料，许多水稻基因现已得到克 隆。本研究利用化学诱交剂甲基磺酸乙酯( e m s ) 进行粳稻品种日本睛 “n i p p o n b a r e ”的突变体诱变。利用实验室水培方式，在4 0 ，1 6 2 个m 2 分离群体 中筛选得到9 8 1 个苗期突交体( 突变频率为2 4 4 ) ，其中以白化突变为最丰 富( 突变频率为1 3 ) ，其次为矮化苗和卷叶突变，突变频率分别为0 2 4 和 0 18 。在根系突变体中，共得到1 1 7 个根突变如长根、短根、无不定根、少 侧根、异常根等不同类型的根突变体，其中以长根变异频率为最高；通过 m 3 鉴定，其中4 1 个根突变体是可遗传的。苗期性状筛选后，利用0 2 5 b a t a s 、 1 2 n a c l 和0 2 5 p e g 6 0 0 0 进行抗除草剂、耐盐和耐旱突变体筛选；在m 2 中 发现5 3 个抗除草剂突变体、4 2 个耐盐突变体和3 3 个耐旱突变体，其突变频率 分别为o 4 3 、o 3 2 和o 2 2 经过验证在m 3 有2 9 个抗除草剂突变体( 株系) 、 1 7 个耐盐突变体和13 个耐旱( 株系) 表现是纯合体，其它突变对抗性有分离 现象。 在大田中，2 0 0 6 年利用m 2 进行突变体筛选的结果表明，地上的植株性 状变异最为丰富，占突变体库的5 6 15 。其中以茎秆变异的突变频率为最高 ( 3 7 6 8 ) ，其次是叶片变异、穗部变异和籽粒变异( 突变频率分别为 3 3 5 0 、1 6 7 5 和12 0 7 ) 。其它一些突变体如根系、抗性、生理变异等 为4 3 8 5 。同时还发现了一些目前尚未报道的双胚苗和白穗等人工诱变产生 的突变体。2 0 0 7 年利用m 3 进行上述突变体的重复鉴定，获得了4 1 2 个变异性 状能够稳定遗传的突变体，其中叶片、茎秆、穗部和籽粒性状等地上植株性 状的突变体占突变体库的5 9 9 5 。 对4 ，0 4 3 份m 3 糙米材料进行了稻米品质性状和品质性状的突变体筛选。 结果筛选到l16 份糙米外观品质性状的突变体( 如垩白大、大胚、大米粒、 小米粒、短圆米粒、长形米粒、糯性米、和红米等) 。同时，利用近红外反 射光谱技术，筛选到4 3 5 份直链淀粉含量、胶稠度、碱消值、蛋白质含量以 及氨基酸的突变体。通过对m 4 糙米外观品质性状的表型重复鉴定，发现7 5 份外观品质性状的突变体能够稳定遗传。在黄化、卷叶、抗除草剂、长根突 变体变异性状的遗传分析中，发现这些性状表现为盂德尔遗传，符合3 ：1 分 离比，属于单基因突变，遗传模式简单，有利于今后突变基因的精细定位及 分离克隆。利用粳稻e t 本睛的黄化突变体与籼稻9 3 1 l 的黄化突变体杂交， 进行黄化突变基因的等位性测定，发现绿色苗与黄色苗的分离比符合9 ：7 分离比，即日本晴的黄化突变基因和9 3 11 黄化突变基因是非等位，而且是 互补关系。 关键词：水稻、突变、诱变、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、日本睛 浙江大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t n o w a d a y s ，r i c ei sm a r k e d l yd i v e r s i f i e df r o mt h ev i e w p o i n to fg e n e t i c s ， r i c em u t a n th a sb e c o m ep r e r e q u i s i t ef o rm o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g y a sw e l la s f u n c t i o n a lg e n o m i c sr e s e a r c h ，a n dm a n yg e n e sh a v eb e e ni s o l a t e df r o md i f f e r e n t m u t a n t si nr i c e i np r e s e n ts t u d y ，t h es e e d so f j a p o n i c av a r i e t y ( o r y z as a t i v al s s p j a p o n i c a ) n i p p o n b a r ew e r et r e a t e db ye t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e ( e m s ) i n o r d e rt oc o n s t r u c tt h em u t a n tl i b r a r y f r o m4 0 ，16 2m es e e d l i n g s ，t o t a lo f9 81 m u t a n t sw e r es c r e e n e dw i t ht h em u t a n t i n d u c e df r e q u e n c yo f2 4 4 ，i nw h i c h t h ea l b i n ow a sh i g h e s tf r e q u e n c y ( 1 3 ) ，f o l l o w e db yt h ed w a r fa n dr o l l e dl e a f ( 0 2 4 a n d0 18 ，r e s p e c t i v e l y ) b yu s i n gh y d r o p o n i c sm e t h o d ，w h o l er o o t s y s t e mc o u l db eo b s e r v e dc l e a r l yf o rs c r e e n i n gr o o tm u t a n t s a b o u t11 7r o o t m u t a n t sc o m p r i s i n go fl o n gr o o t ，s h o r tr o o t ，l e s sa d v e n t i t i o u sr o o t ，l e s sl a t e r a l r o o ta n da b n o r m a lr o o tw a si d e n t i f i e d ；b u to n l y41r o o tm u t a n t sw e r ef o u n d s t a b l ei ni n h e r i t a n c ea f t e rm 3v a l i d a t i o n a f t e rm o r p h o l o g i c a lm u t a n t sw e r ep i c k e d u p t h er e m a i n i n gs e e d l i n g s w e r e s p r a y e dw i t h0 2 5 b a s t a ( h e r b i c i d e s ) s o l u t i o no rt r e a t e dw i t h1 2 n a c is o l u t i o no rp l a c e di n2 5 p e g6 0 0 0 s o l u t i o nf o rt e s t i n ga b i l i t yo fh e r b i c i d er e s i s t a n c e ，s a l tt o l e r a n c ea n dd r o u g h t t o l e r a n c e r e s p e c t i v e l y f i f t y t h r e eh e r b i c i d er e s i s t a n c em u t a n t s ，4 2s a l t t o l e r a n c em u t a n t sa n d3 3d r o u g h tt o l e r a n c eo n e sw e r ei d e n t i f i e dw i t hf r e q u e n c y o f0 4 3 ，0 3 2a n d0 2 2r e s p e c t i v e l y b yi n s p e c t i o ni nm 3 ，o n l y2 9h e r b i c i d e r e s i s t a n c em u t a n t s ，17s a l tt o l e r a n c em u t a n t sa n d13d r o u g h tt o l e r a n c eo n e s c o u l dp r o p a g a t et ot h e i ro f f s p r i n g sw i t h o u ts e g r e g a t i o n i n2 0 0 6 ，m u t a n t so fm o r p h o l o g i c a lt r a i t s ，a f t e rs c r e e n i n gi nm1 a n dt r a n s f e r t ot h ef i e l dw e r ef o u n dt oo c c u p y5 6 15 o fm u t a n tl i b r a r yi nm 2 a m o n gt h e m ， c u l ma n dt i l l e r i n gt r a i tm u t a n tw a sm o s ta b u n d a n tw i t hf r e q u e n c yo f37 6 8 ， f o l l o w e db yl e a f , p a n i c l ea n ds p i k e l e tm u t a n t sw i t hf r e q u e n c yo f3 3 5 ，1 6 7 5 a n d12 0 7 ，r e s p e c t i v e l y m u t a n t sf o rr o o tt r a i t s ，a b i o t i cs t r e s sr e s i s t a n c ea n d p h y s i o l o g i c a lt r a i t so c c u p i e dt h er e m a i n i n g4 3 8 5 b e s i d e s ，p r e s e n ts t u d ya l s o i d e n t i f i e ds o m es p e c i a lm u t a n t ss u c ha sp o l y e m b r y o n i cm u t a n t sa n dw h i t e p a n i c l em u t a n t sa l s ow e r ec a p t u r e d ，a l b e i tw i t hl o wf r e q u e n c ya n dc o u l db e p r o p a g a t e ds t a b l yt on e x tg e n e r a t i o n m 3v a l i d a t i o nc a r r i e do u ti n2 0 0 7r e v e a l e d t h a td i f f e r e n tm u t a n t s ，i n c l u d i n gl e a f , r o o t ，p l a n th e i g h t ，e u l m ，p a n i c l e ，s p i k e l e t ， f e r t i l i t y a n dh e a d i n gt i m ec o u l db es t a b l yi n h e r i t e df r o mg e n e r a t i o nt o l l 浙江大学硕士学位论文 摘要 g e n e r a t i o n b ys e l e c t i n gt h et y p i c a la n ds t a b l em u t a n t s ，al i b r a r yo f412 e m s m u t a g e n i z e dm u t a n t s ，w h i c hw e r em o s t l ys t a b l ei ni n h e r i t a n c e ，w a s c o n s t r u c t e di nm 3 a n dm u t a n t so fm o r p h o l o g i c a lt r a i t s ( c o n s i s t i n go fl e a f , c u l m a n dt i l l e r i n g ，p a n i c l ea n ds p i k e l e tt r a i t s ) s t i l lo c c u p i e dh i g h e s tf r e q u e n c yo f 5 9 9 5 o fm u t a n tl i b r a r y f r o m4 ，0 4 3b r o w nr i c em a t e r i a l s ，ap o o lo fg r a i nq u a l i t ym u t a n t s ( i n c l u d i n g b r o w nr i c ea p p e a r a n c ea n dr i c eq u a l i t ym u t a n t s ) w a sc o n d u c t e d 116m u t a n t sf o r b r o w nr i c ea p p e a r a n c e ( i n c l u d i n gl a r g ec h a l k i n e s s ，b i ge m b r y o ，b r o a dg r a i n ， s m a l lg r a i n ，r o u n ds h a p e dg r a i n ，s l e n d e r ，g l u t i n o u sr i c e ，r e dc o l o r e dr i c e ) n e a r i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( n i r s ) ，w h i c hh a ss e v e r a lw e l l k n o w na d v a n t a g e s ，w a s u s e df o r s c r e e n i n gr i c eq u a l i t ym u t a n t s a n d4 35n u t r i e n tc h a r a c t e r i s t i c s ( i n c l u d i n ga m y l o s ec o n t e n t ，g e lc o n s i s t e n c y ，a l k a l is p r e a dv a l u e ，p r o t e i nc o n t e n t a n da m i n oa c i d s ) w e r ea l s oc l a s s i f i e di nm 3 v a l i d a t i o ni nm 4s h o w e dt h a ta b o u t 75m u t a n t sb r o w nr i c ea p p e a r a n c ew h i c hw e r es c r e e n e di nm 3 w e r es t a b l ei n i n h e r i t a n c e ( h o m o z y g o u s ) s o m et y p i c a l m u t a n t s ( s u c h a s g r e e ny e l l o w ，r o l l e dl e a f , h e r b i c i d e r e s i s t a n c e ，l o n gr o o t ) w e r ec h o s e nt om a k eh y b r i d i z a t i o nw i t hw i l dt y p e g e n e t i ca n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a t ，s e g r e g a t i o ni nf 2o ft h e s em u t a n t st a l l i e d w i t h3 1r a t i oo fm e n d e l i a ni n h e r i t a n c ef o rs i n g l eg e n ec o n t r o l l e dt r a i t s b y m a k i n ga ni n t e s u b s p e c i f i cc r o s s i n gb e t w e e ng r e e ny e l l o wm u t a n to fn i p p o n b a r e a n dg r e e ny e l l o wm u t a n to f9 3 - 11 ，s e g r e g a t i o ni nf 2w h i c hs u i t e dr a t i oo f9 ：7 ， r e v e a l e dt h a tt w om u t a n t sw e r ec o n t r o l l e db yt w on o n a l l e l i cg e n e st h a ti n t e r a c t e o m p l e m e n t a r i l y t h e s ei n f o r m a t i o n sm i g h tb ee s s e n t i a lt oe l u c i d a t et h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fr i c eg e n e sa n dp o s s i b l yf a c i l i t a t eg e n e t i ca n a l y s i sa n d p o s i t i o n a lc l o n i n g k e yw o r d s ：r i c e ，m u t a n t s ，m u t a g e n e s i s ，e t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e ( e m s ) ， n i p p o n b a r e i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签年月fg 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸姿盘堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学 学位论文作者签 签字日期：2 础年6 月lg 同 ) 签名：悫 矿、 签字日期：卵沙年多月瞩y 一。 致谢 光阴似箭，日月如梭，转眼两年的研究生生活已经进了尾声。论文完成 之际，首先向帮助过我、关心与支持过我的各位领导、老师和同学表示衷心 的感谢! 本论丈是农业与生物技术学院农学系石春海教授的悉心指导下完成的。 石老师严谨求实的治学态度、渊博的知识、务实的工作作风、忘我的奉献精 神和对学生在科研上的指导和启示都令我受益很多、终身难忘。石老师从论 文的选题、技术路线的设计和实验操作方法的训练等方面对我进行了全面、 详细和耐心地指导。尤其在为人处世方面，石老师经常言传身教、严格要求， 对我在中国留学期间的个人生活给予了很多理解和关照，在此我向石老师表 示深深的感谢! 同时衷心感谢吴建国副教授在试验过程中和稻米品质分析等方面给予了 ， 很多具体的指导和帮助! 特别感谢祝水金教授、王学德教授、洪彩霞实验师 等老师的关心和指导! 感谢张志、郑希、涂进东、石云、李文强、李云侠、穆拉里、周伟辉、 张斌、张莉等同门师兄弟( 姐妹) 在突变体库筛选和分析等方面提供的实验 协助以及对我学习、试验和生活上的关心与照顾同时试验工作还得到了农 学系和农场领导以及水稻队工人的大力支持，在此一并表示衷心的感谢! 感谢越南政府出国留学奖学金( 3 2 2 计划v o s p ) 的资助，越南教育部以 及越南农科院领导的关怀和指导。 特别感谢我的妻子阮氏兰( n g u y e nt h il a n ) 、父母和弟弟们，他们给予 了我学习上的理解和支持，可爱的女儿也使我在工作和学习中能够感到更加 轻松，家人的关心使我顺利完成学业。 在此论文顺利完成之际，对以上所有的领导、老师、同事、同学、朋友 和亲人一并表示诚挚感谢! 今后的人生之路，我会继续努力前行，用实际行 动向帮助过我的人们献上一份最好的礼物。同时，也真诚的祝愿我们课题组 能有一个更加辉煌灿烂的明天! 阮伯胜 ( n g u y e nb at h a n g ) 2 0 0 8 年5 月10 日 浙江大学硕士学位论文前言 1 前言 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米 为主食( s a s a k i 和b u r r ，2 0 0 0 ) 。稻米占目前人们食物来源的6 0 左右，可 提供2 0 左右的能量和4 0 左右的蛋白质( 肖层林，19 9 0 ) 。因为水稻是禾 本科作物中基因组最小的物种，禾本科植物基因组间又存在同线性，而且水 稻遗传转化相对容易，所以水稻已成为禾本科作物分子生物学研究的理想模 式植物( m o o r e 等，l9 9 5 ) 。随着水稻基因组测序的顺利完成( i r g sv r o j e c t ， 2 0 0 5 ) ，水稻作为进行功能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 研究的模式作物 而发挥着越来越大的作用。功能基因组学主要研究生物有机体内的不同基因 组结构和功能，基因表达调控、基因与环境之间相互作用( 包括基因与基因 之间、基因与其它序列之间、基因与蛋白质之间) 等，并可能通过它们在染 色体上的位置进行预测( 赵寿元等，2 0 0 1 ) 。虽然以往的水稻遗传学研究曾 创造了丰富的突交材料，使水稻经典基因连锁图的构建得以逐步充实，但这 些突变体一般均产生于不同的遗传背景，进行相互比较和开展系统研究有较 大的难度，且需要较长的时间。因此获取大量具有重要作用价值的水稻突变 体可以加快水稻基因的发掘速度，具有促进功能基因组学研究和加快水稻新 品种选育的双重作用。 诱交材料的选择是构建突变体库的关键之一为了更加直接有效利用已 报道的水稻全基因组序列的成果，利用已测序的水稻品种进行突变体筛选是 一种比较好的办法，以开展遗传育种及基因组学研究( 朱旭东等，2 0 0 3 ； s a l l a u d 等，2 0 0 4 ；z h a n g 等，2 0 0 6 ；叶俊等，2 0 0 6 ；m i y a o 等，2 0 0 7 ) 。 用于人工诱导突变体的遗传突变方法主要有辐射诱变等物理方法、甲基 磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e ，e m s ) 诱变等化学方法、转座子或t - d n a 插入等分子生物学等方法( a l o n s o 等，2 0 0 3 ) 。目前通过t - d n a 插入的方式 已经获得了18 ，3 5 8 个独立的水稻转基因株系，筛选出许多可见突变类型 ( j e o n 等，2 0 0 0 ) 。水稻内源逆转座子t o s l7 在组培过程中十分活跃，可以 导致高频率的突变，为功能基因组研究提供了新的研究手段( h i r o c h i k a 等， 1 9 9 6 ；h i r o c h i k a ，2 0 0 1 ) 。利用水稻逆转座子t o s l 7 已经获得3 2 ，0 0 0 个插入 系，有8 ，6 0 0 个以上的独立插入位点的旁临序列也已被确定，目前利用t o s l 7 已经分离到一些重要的基因( t a k a n o 等，2 0 0 1 ；a g r a w a l 等，2 0 0 1 ) 。同时， 转座子标签也是分离水稻新基因的重要工具，已经获得6 ，0 0 0 个彳c 插入的 突变系( e n o k i 等，l9 9 9 ) 。但是，插入突变本身也存在缺点，如稳定性不 够、可见突变表型较少、存在突变“热点”、很多突变表型是由组培过程所引 浙江大学硕士学位论文 前言 起等，在一定程度上限制了其应用( j e o n 和a n ，2 0 0 1 ；h i r o c h i k a ，2 0 0 1 ) 而理化诱交则可以在一定程度上克服这些缺点，并且理化诱变具有技术条件 较为简便、突变效率高等优点，容易在短时间内获得具有较大规模的突变体 库( b o u c h e z 和h 6 f t e ，1 9 9 8 ) ，如用快中子、t 射线、e m s 等物理化学法在 水稻中已经建立的一些突变体库( l e u n g 等，2 0 0 1 ；f i s c h e r 等，2 0 0 0 ；w u 等，2 0 0 5 ；叶俊等，2 0 0 6 ；s u z u k i 等，2 0 0 8 ) 因此，利用理化诱变的方式 构建突交体库具有重要意义，有利于推动水稻功能基因组的研究但很少发 现利用粳稻日本睛( 已经测序完成) 为材料进行突变体研究。 随着人们生活水平的提高，消费者对稻米品质的要求越来越高。稻米市 场面临的国际竞争也日益加剧，需要实现稻米品质改良的突破，在高产的基 础上培育品质更优的水稻品种可以更好地满足市场要求和消费者的需求。但 是，目前国内外报道的突变群体多集中在植株表型性状和生物及非生物抗性 筛选上。由于品质性状鉴定上存在的难度，在同一遗传背景下大规模筛选水 稻品质突变体的研究尚未见报道。 粳稻品种“日本晴”的全基因组测序已于2 0 0 5 年完成( i r g s p ，2 0 0 5 ) ， 是水稻基因功能研究的模式材料。本试验针对上述存在的问题，应用高效化 学诱变剂e m s 处理粳稻品种日本睛( n i p p o n b a r e ) 种子，在m 2 分离群体中 筛选，进而构建同一遗传背景的植株性状和品质性状突变体库，希望能为今 后功能基因组学研究提供更多的基础材料。同时对部分突变体进行农艺性状 的遗传分析，以了解突变体变异的遗传机制，为今后进一步的利用打下一个 良好的基础。 2 浙江大学硕士学位论文文献综述 2 文献综述 水稻是人类最重要的粮食作物之一。随着水稻基因组测序的顺利完成，水稻作 为进行功能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 研究的模式作物而发挥着越来越大的 作用。已经形成的一些基因功能鉴定方法中，包括了基因表达系列分析技术 ( s a g e ) 、同源序列分析、d a n 芯片、微阵列、蛋白质芯片等( 王景雪等，2 0 0 4 ) ， 其最直接最有效的方法就是构建饱和的基因突变群体，可以通过突变体分析鉴定基 因功能( 江树业，2 0 0 3 ) 。 突变体( m u t a n t ) 是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的 材料。不论m e n d e l 的分离规律和自由组合规律以及m o r g a n 的连锁规律的发现，还 是当今功能基因组学所取得的一些成果，它们的研究都是建立在大量不同类型突 变体的基础之上。突变体不仅可以自发突变产生，而且可以通过理化等因素诱发产 生，突变能够被诱发是2 0 世纪遗传学史上最重要的发现之一，作为诱变现象的发 现者，m o r g a n 的学生m u l l e r 在1 9 4 6 年为此而获得诺贝尔生理学或医学奖。 突变体库( m u t a n tl i b r a r y ) 的创建是基因功能的第一步，突变体库是由某种方 法产生的，包含各种不同基因突变群体。从产生突变体的方式上，可分为自发突变、 物理化学诱变、d n a 插入突变体；从遗传背景上可以分为普通突变体、近等基因系 突变体和等基因系突变体；从引起突变的分子机制上可分为功能丧失的突变体库和 功能获得性突变体( 钱前和程式华，2 0 0 6 ) 。为获得进行功能基因组学研究的大量 突变体，全球加快了水稻突变体的创建步伐。 2 1 创建水稻突变体库的策略和意义 2 0 0 2 年1 2 月，国际水稻基因组测序计划( i n t e m a t i o n a lr i c eg e n o m es e q u e n c e p r o j e c t ，i r g s p ) 宣布完成以p a c b a c 克隆为基础的籼稻9 3 1 1 和粳稻品种日本 晴的全基因组测序以来，水稻突变体库的创建快速发展。到2 0 0 4 年底韩国已经获 得了有3 万个t - d n a 插入突变体，日本s h i m a m o t o 实验室利用a c d s 转座子标签 已创造水稻突变体6 , 0 0 0 多个，中国有t d n a 插入突变群体5 万个株系以上，物 理辐射突变体约2 万株，e m s 化学诱变突变体约2 万株。2 0 0 5 年6 月，g r a m e n e 报道了1 , 4 8 8 个水稻突变体，o r y z a b a s e 网站公布了月1 , 6 9 8 个水稻突变体和基因( 含 数量性状基因) 。这些丰富的突交体材料，为大规模发掘水稻基因和研究基因功能 提供了必要的条件，已用于水稻基因克隆。迄今，通过图位克隆的方法克隆到水稻 基因达4 0 多个，其中包括中国克隆的m o c l 、b c l x a 2 6 和a l k 等多个基因。但是 大部分水稻基因尚未克隆( 郭龙彪等，2 0 0 6 ；朱克明等，2 0 0 6 ) 。 浙江大学硕士学位论文 文献综述 2 1 1 获得水稻突变体的途径 获得水稻突变体的途径很多，除了自发突变以外，诱发突变也是获得突变体的 重要途径，诱变( m u t a g e n e s i s ) 是诱导遗传物质而产生各种变化并可遗传下去的过 程。 2 111 自发突变体库的创建 自发突变( s p o n t e n e o u sm u t a t i o n ) 指在自然条件下发生的突变，不仅是生物变 异的重要来源，也是自然进化的基础2 0 世纪以来，水稻产量的每次飞越都与自发 突变体的发现密切相关，水稻的半矮秆基因s d l 和野败型细胞质雄性不育基因都是 来源于自发突变体，而光( 温) 敏核不育株的发现为采用两系法利用水稻亚种间的 杂种优势提供了契机( 钱前和程式华，2 0 0 6 ) 。 然而，自发突变的频率很低，在高等生物中约为1 0 一1 0 。各种自发突变体是 在长期的自然选择和人工选择过程中积累起来的，各突变体的遗传背景非常复杂， 给研究造成很大的困难，加之许多自发突变体由于表型无法鉴定，很难进行系统收 集研究而丢失。从自然条件下发现突变体到突变体基因的克隆常常需要经历一个漫 长的过程，涉及到与同一亲本进行多代回交，大量系统的遗传学分析和突变基因的 精细定位，才能分离到突变基因。例如从发现水稻半矮秆突变体到2 0 0 2 年利用图 位克隆的方法分离到半矮秆基因，经历了半个多世纪。 2 1 1 2 理化诱变突变体库的创建 用物理、化学方法可快速获得较广的突变谱及稳定的遗传变异，可导致多位点 的变异，比较容易得到饱和突变体库，且具随机突变优点，突变率可达3 左右( 郭 龙彪等，2 0 0 6 ) 。 2 1 1 2 1 物理诱变在水稻突变库构建 理化诱变是获得突变体有效的诱变技术，可以大大提高突变的频率，点突变 ( p o i n t m u t a t i o n ) 是理化诱变的主要特点。物理诱变包括：x 射线、丫射线、快中子、 u v 及太空诱变等；其中快中子造成的缺失诱变相对较多。 自从s t a n d l e r 于1 9 2 8 年首次发现并证明x 射线和镭对禾谷类作物存在诱变效应以 来，辐射诱变已越来越多应用于农作物变异植株的筛选上( “等，2 0 0 2 ) 。国际水稻 所利用物理诱变的方法处理水稻品种i r 6 4 后得到一些突变材料，其形态突变频率为 6 3 4 ( l e u n g 等，2 0 0 1 ) 。中国水稻研究所朱旭东等( 2 0 0 3 ) 利用3 0 0 g y 和3 5 0 g y6 0 c o 丫射线处理粳稻“中花1 1 ”也获得了不同类型的农艺性状突变体，其中包括叶片性状 ( 叶色、叶斑、叶形突变等) 、茎秆性状( 茎色、茎斑、茎形突变等) 、穗部性状( 穗 色，穗形、粒形突变等) 、生理性状( 熟期突变、不育突变等) 的变化等，群体突变 频率为5 1 。利用物理诱变构建突变群体，可进一步进行相关基因功能的研究。 浙江大学硕士学位论文 文献综述 快中子是植物中相当有效的物理诱变剂，是获得缺失突变体的重要手段，利用 d e l e t e a g e n e 系统可对此类缺失突变体进行有效的检测( l i 等，2 0 0 2 ) l i 等( 2 0 0 1 ) 利用此方法对2 4 ，6 6 0 个水稻快中子突变体，在5 个基因位点进行筛选，结果筛选出1 个基因位点的缺失突变体充分说明了快中子诱变和d e l e t e a g e n e 系, 统基因检测中的 可行性。利用d e l e t e a g e n e , 系统用于鉴定小于l k b 基因和串联同源基因( t a n d e ma r r a y s ) 功能方面有其它检测方法没有的优势( l i 等，2 0 0 2 ) 。但是如果突变体中缺失的片段 偏大，如缺失片段涵盖多个基因或基因簇( g e n ec l u s t e r ) ，一个突变体同时发生多个 位点的缺失，缺失发生在内含子中，会增加突变基因分离的难度。 2 112 2 化学诱变构建水稻突变群体 化学诱变剂的种类很多，可分为4 类：( 1 ) 碱基类似物及有关的化合物，如5 溴 尿嘧啶、5 溴去氧尿核苷、2 氨基嘌呤和8 乙氧基咖啡碱；( 2 ) 抗生素，如重氮丝氨 酸，丝裂霉素c 和链霉黑素；( 3 ) 烷化剂，如甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e ， e m s ) 、n 甲基n 亚硝基脲( m e t h y ln i t r o s o u r e a ，m n u ) 烯亚胺，亚硝基乙基尿烷 和亚硝基乙基尿；( 4 ) 其他种类的诱变剂，如亚硝酸和吖啶。最常用的e m s 化学诱 变和烷化剂等化学诱变剂可直接作用于d n a ，改变模板的性质或干扰复制，使错误 的碱基插入而产生突变水稻脆秆b c l 突变体、无趋光陛b c t l 突变体、无冠状根c r l l 和c r l 2 突变体都是通过理化诱变的途径获得的( l i 等，2 0 0 3 b ；h a g a 等，2 0 0 5 ；i n u k m 等，2 0 0 5 ) 。 化学诱变剂甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e ，e m s ) 是烷化剂的一种，分 子式c h 3 s 0 2 0 c 2 h 5 ，无色液体，分子量1 2 4 ，水中溶解度为8 。烷化剂通常带有1 个或多个活性烷基，此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去，使碱基许多位 置上增加了烷基，从而在多方面改变氢键的能力。e m s 被证明是最为有效而且负面 影响小的诱变剂。e m s 是一种高效烷化剂，特点是由于所带的活性烷基很不稳定， 能够转移到其它分子较高电子密度的位置上，从而使d n a 中的碱基容易发生烷基化 作用。e m s 诱变的烷基化位点主要在鸟嘌呤( g u a n i n e ，g ) 的n - 7 位上，由于g 上 n 7 的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团能产生两种效应：一是促进第一位 氨基上氢解离，使g 不再与c 配对而与t 配对，从而造成g ：c 到a ：t 转换( 图l a ) ； 二是n 7 成为季铵基团后减弱了n 9 位上的n 糖苷键，而产生去嘌呤作用，大部分无 嘌呤位点可以在复制前被修复，但有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可 以插入任何一个碱基，经过第二轮复制以后，原来的g ：c 对可能变为任何碱基对 g ：c 、c ：g 、a ：t 、t ：a ，既有转换又有颠换( 图l b ) ( 张铭堂，1 9 9 6 ；祝 丽英等，2 0 0 1 ) 。b u m s 等( 1 9 8 6 ) 研究e m s 诱变的1 8 4 个大肠杆菌突变都是单个碱 基对改变时，发现其中1 8 3 个由g ：c 变为a ：t ；l e b k o w s k i 等( 1 9 8 6 ) 研究表明 浙江大学硕士学位论文 文献综述 e m s 诱导的人类5 4 个突变中有5 3 个也是由g ：c 变为a ：t ；g r e e n e( 2 0 0 3 ) 统 计经e m s 诱交拟南芥的点突变体率超过9 9 ，与其它理化诱交的方法相比，e m s 更 容易获得显性突变( d o m i n a n t m u t a t i o n ) 。此外，e m s 也可与核苷结构的磷酸反应， 形成脂类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失( 图l e ) ： g l 烷基化 c g i t a l t a n - 7 烷基化鸟嘌呤由于n 1 位上h 的电离而与胸腺嘧啶配对，从而导致g ：c a ：t 转 换 反n - 7a l k y l a t i o no f g u a n i n eb yn - 1i o n i z a t i o no f t h ehw i t ht h y m i n ep a i r i n g , l e a d i n gt og ：c - a tc o n v e r s i o n g 烷基化 g l 1 c c i c 明：g i,a j 词t 橱g 转换 b ：n - 7 烷基化鸟嘌呤通过去嘌呤作用导致转换和颠换 b ：c o n v e r s i o n 觚dt r a n s v e r s i o mb y n - 7a l k y l a t i o no f g u a n i n et op u i i n e 颠换 烷化剂+ 核苷酸的磷酸分子脂类 l 切 l 断 核苷酸( 磷酸二糖) _ 染色体缺失 - c ：烷化剂诱导染色体缺失模式 c ：m o d eo f a l k y l a t i n ga g e n ti n d u c e dc h r o m o s o m ed e l e t i o n 图1 化学诱变剂e m s 诱变机制( 祝丽英等，2 0 0 1 ) f i g 1m u t a g e n e s i sr e g u l a t i o no f c h e m i c a la g e n te m s ( z h ue ta 1 ，2 0 01 ) 6 浙江大学硕士学位论文文献综述 2 112 3 点突变的检测方法： 点突变是基因功能的有效手段，根据点突变在基因组中的位点，可以进行突变 基因准确定位。以前由于试验手段的局限和信息量的不足，点突变检测难度大，使 通过理化诱变，特别是e m s 诱变方法获得的突变体在功能基因组学的应用上受到限 制。围绕如何有效检测点突变位点，提高突变基因克隆效率，研究人员进行了大量 探索，取得了许多可借鉴的经验。p e t e r 等( 2 0 0 4 ) 利用a f l p 分子标记对拟南芥进行 整个基因组的定位，并借助生物信息学，定位到一个影响拟南芥丁叶型的侯选位点； h a y a s h i 等( 2 0 0 4 ) 借助单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 分 子标记，成功地分离了位于尸拓位点的水稻抗病基因并进行了功能分析。m c c a u u m 等 ( 2 0 0 0 a ，b ) 发明了一种以s n p 为基础可用于大规模直接筛选点突变的方法t i l l i n g ( t a r g e t i n gi n d u c e dl o c a ll e s i o n si ng e n o m e s ) 而越来越受到研究人员的重视。t i l l i n g 技术主要利用从新鲜芹菜茎秆中提取的一种核酸内切酶c e l l ( c e l e r y l ) 特异切割错 配双链的原理设计而成的，是从d n a 序列出发利用反向遗传学直接从基因组中探测 出点突变发生的位置，再根据表型对基因功能进行研究。这种检测点突变的方法与 d h p l c ( d e n a t u r i n gh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 检测和d n a 芯片技术相 结合，极大提高点突变的检测效率( h t t p ：t i l l i n g f h c r c o r g ：9 3 6 6 ) 。利用这个方法已 经成功