（植物病理学专业论文）油菜黑斑病病原学及防治技术研究.pdf

l i l l ll ii i iiiiii i ii iiii y 17 9 9 9 3 8 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 i 研究生签名：缳八歹鲁 时间：如加年多月步日 学位论黼张孙形导懒：名洲 签名日期矽年移月歹日 签名日期：办伽年石月厂日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 目录 摘要i a b s t r a c t 第一章文献综述1 1 1 十字花科蔬菜黑斑病的发生和危害1 1 2 十字花科蔬菜黑斑病病原菌种群l l - 3 十字花科蔬菜黑斑病病原菌的分类鉴定3 1 3 1 根据形态结构进行分类鉴定3 1 - 3 2 根据同工酶与酶联免疫分析的分类鉴定一3 1 3 - 3 基于d n a 水平的分类鉴定4 1 4 十字花科蔬菜黑斑病菌的生物学特性及侵染机理研究4 1 4 1 十字花科蔬菜黑斑病病原菌生物学特性研究4 1 4 2 十字花科蔬菜黑斑病毒素的研究进展5 1 4 3 十字花科蔬菜对黑斑病病菌侵染的生理生化抗性机制7 1 5 十字花科蔬菜黑斑病的防治7 1 5 1 品种抗性鉴定及其利用8 1 5 2 农业防治8 1 5 3 种子处理9 1 5 4 化学防治9 1 5 5 生物防治l o 1 5 6 植物抗菌活性物质1 0 1 6 研究的目的和意义1 1 第二章油菜黑斑病病原菌的分离及鉴定1 3 2 1 材料与方法。1 3 2 1 1 油菜黑斑病病组织的采集、菌株的分离培养与纯化1 3 2 1 1 1 病组织的采集及病原菌的分离1 3 2 1 1 2 单孢分离纯化1 4 2 2 病原菌致病性测定1 4 2 2 1 菌丝块接种1 4 2 2 2 分生孢子悬浮液接种1 4 2 2 3 病原菌的再分离1 5 2 3 病原菌的形态学鉴定1 5 2 - 3 1 链格孢种的鉴定依据1 5 2 3 2 菌落形态和分生孢子特征观察1 5 2 3 3 产孢表型观察：- 1 5 2 4r d n a i t s 分子鉴定1 6 2 4 1 基因组d n a 的提取1 6 2 4 2 弓i 物1 6 2 4 3p c r 反应条件1 6 2 4 4 序列分析l7 2 2 结果与分析1 7 2 2 1 病原菌的分离1 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 2 2 致病性测定1 8 2 2 2 1 菌丝块接种1 8 2 2 2 2 分生孢子接种1 9 2 2 3 病原菌形态观察2 0 2 2 3 1 菌株x t - 1 培养性状。2 0 2 2 3 2 产孢表型观察2 l 2 2 3 3 分生孢子形态特征2 l 2 2 4i t s 区的p c r 扩增与测序2 2 2 - 3 结论与讨论2 3 第三章油菜黑斑病病菌生物学特性的研究2 5 3 1 材料与方法。2 5 3 1 1 不同菌株致病力鉴定2 5 3 1 1 1 植物材料2 5 3 1 2 2 供试菌株2 5 3 1 2 3 接种方法及病情调查2 5 3 1 2 不同菌株的生物学特性2 7 3 1 2 1 光照对病原菌菌丝生长的影响2 7 3 1 2 2 温度对病原菌菌丝生长的影响2 8 3 1 2 3 不同p h 值对菌丝生长的影响2 8 3 1 2 4 不同碳源对菌丝生长的影响2 8 3 1 2 5 不同氮源对菌丝生长的影响2 8 3 1 2 6 菌丝体和分生孢子致死温度测定2 9 3 2 结果与分析2 9 3 2 。l 不同菌株致病力比较2 9 3 2 2 生物学特性研究3 0 3 。2 2 1 光照对病原菌菌丝生长的影响- 3 0 3 2 2 2 温度对病原菌菌丝生长的影响3l 3 2 2 3 不同p h 对病原菌菌丝生长的影响3 2 3 2 2 4 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响3 2 3 2 2 5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响3 3 3 2 2 6 菌丝体和分生孢子致死温度的测定3 4 3 3 结果与讨论3 5 第四章油菜黑斑病防治技术研究3 7 4 1 材料与方法3 7 4 1 1 品种抗性鉴定3 7 4 1 1 1 供试材料与菌株3 7 4 1 1 2 油菜的培育及分生孢子液的配置- 3 7 4 1 1 3 接种鉴定与病情调查3 7 4 1 2 室内药剂筛选3 8 4 1 2 1 供试药剂3 8 4 1 2 2 供试药剂对病原菌x t - 1 菌株的室内毒力测定一3 9 4 1 2 3 数据分析4 0 4 i 3 盆栽药剂防治研究4 0 4 1 3 1 供试材料与菌株4 0 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 4 1 3 2 供试药剂及浓度4 0 4 1 3 3 试验设计及调查方法4 1 4 2 结果与分析4 1 4 2 1 抗性品种筛选4 1 4 2 2 室内药剂筛选4 5 4 2 3 盆栽药剂防治试验4 6 4 3 结论与讨论4 7 参考文献。4 9 至贮谢5 7 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 摘要 油菜是我国重要的油料作物，具有较高的经济价值。近几年，在湖北省油 菜产区荆门市、孝感市、黄冈市、武穴市和仙桃市发生了较为严重的油菜黑斑 病，直接影响了当地农民的经济效益。本实验通过形态学和分子生物学方法将 湖北省油菜黑斑病病原菌鉴定为a l t e r n a r i ab r a s s i c i c o l a 。在此基础上，研究了不 同地理来源的菌株致病力差异以及不同致病力菌株的生物学特性，筛选抗病品 种并探讨了该病的药剂防治技术。主要研究结果如下： 从湖北省荆门市、孝感市、黄冈市、武穴市和仙桃市油菜种植地采集油菜 黑斑病典型的病样标本，通过常规组织分离法得到a 和b 两种链格孢属真菌 ( a l t e r n a r i as p ) ，它们的分离频率分别为7 3 5 和9 2 6 5 。用两种类型菌株的 菌丝块和分生孢子液接种新鲜健康的油菜叶片和荚果。结果表明，a 种类型菌 株的菌丝块和分生孢子液接种2 d 后，即出现黑色坏死斑点；b 种类型的菌株不 致病。发病组织上再次分离得到的病原菌与接种的病原菌形态一致，表明a 种 类型菌株是湖北省油菜黑斑病病原菌。形态学观察结果表明，病原菌在p d a 培 养基上菌落初为白色，3 d 后茵落变成黑色煤烟状，质地紧密。用滤纸+ p c a 培 养基诱导产孢，培养5 天的孢子链链长常超过1 0 个分生孢子，在单根分生孢子 梗上形成小树状分枝的分生孢子链。在p c a 培养基上2 5 黑暗条件下培养7 天后，成熟分生孢子褐色，卵形，近椭圆形或倒棒状，具有1 - 5 个横膈膜和0 2 个纵、斜隔膜，分隔处明显隘缩；孢身长2 2 0 6 - - - - - 6 2 0 5 x 1 3 7 9 2 0 6 3 9 i n 。喙 一般不发达，多为单细胞假喙，淡褐色。根据s i m m o n s 和张天宇描述的链格孢 种的形态特征，将该病菌鉴定为a l t e r n a r i ab r a s s i c i c o l a 。该病原菌的r d n a i t s 序列与a b r a s s i c i c o i a 的同源性达到1 0 0 。根据形态学和r d n a i t s 序列分析 结果，确定该病原菌为a b r a s s i c i c o l a 。 从湖北省油菜产区采集的油菜黑斑病病样进行组织分离共得到2 3 个致病 性菌株。对来自不同地理来源的2 3 个菌株进行致病性测定，发现2 3 个菌株存 在致病性差异。仙桃市采集的菌株致病性最强，来自黄冈市采集的菌株致病性 最弱。选择x t 1 、w x 1 和h g 5 三个致病性有差异的菌株的生物学特性研究 结果表明：菌丝在5 3 5 的条件下均可生长，2 5 是最适宜的温度。菌丝在 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 p h 4 0 11 0 范围内的p d b 中均可生长，最适p h 值为p h 6 0 - 7 0 。在c z a p e k 液 体培养基中培养，病菌可以利用多种碳源和氮源，在无碳或无氮条件下均可生 长；葡萄糖和蛋白胨是该病菌最适的碳源和氮源。茵丝体和分生孢子的致死温 度分别为5 5 ，1 0 m i n 和6 0 ，1 0 m i n 。 在油菜品种进行抗病性评价中，离体叶片接种结果表明：用致病力强的x t - 1 菌株的分生孢子液接种，8 份表现为抗病，3 2 份表现为中抗，2 8 份表现为感病； 用致病力中等的w x 一1 菌株的分生孢子液接种，2 3 份表现为抗病，3 6 份表现为 中抗，9 份表现为感病；用致病力弱的h g 一5 的分生孢子液接种，5 3 份表现为抗 病，1 5 份表现为中抗。大田荚果接种结果表明：用致病力强的x t - 1 菌株的分 生孢子液接种，7 份表现为抗病，3 5 份表现为中抗，2 6 份表现为感病；用致病 力中等的w x 一1 菌株的分生孢子液接种2 9 份表现为抗病，3 2 份表现为中抗，7 份表现为感病：用致病力弱的h g 一5 的分生孢子液接种，5 7 份表现为抗病，1 1 份表现为中抗。6 8 份油菜材料中没有发现对油菜黑斑病免疫和高抗的品种。 室内药剂筛选试验结果表明，苯甲丙环唑等1 1 种供试药剂在设置的不同浓 度下对菌株x t 1 的菌丝生长均表现一定的抑制作用，其中3 0 苯甲丙环唑和 1 0 的苯醚甲环唑的抑菌效果最好，e c s o 分别为0 1 0 8 1 3 i t g m l ，0 6 4 8 6 3 i g m l ， 其次是1 6 松脂酸铜、3 0 恶霉灵水剂和5 井冈霉素a 可溶性粉剂，最差的 是7 5 百菌清可湿性粉剂，e c s o 为2 6 8 4 6 0 5 0 i i g m l 。2 0 0 9 年盆栽药剂防病试验 结果表明：3 0 苯甲丙环唑和1 0 的苯醚甲环唑的防病效果最好，对叶片黑斑 病的防效分别为7 3 0 8 和6 9 2 3 ，5 井冈霉素a 可溶性粉剂的防病效果最差， 防效为3 8 4 6 。 关键词：油菜黑斑病；芸薹生链格孢；病原鉴定：致病力；生物学特性；品 种抗性鉴定；药剂防治 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 a b s t r a c t r a p e s e e di sa l li m p o r t a n to i lc r o p sw i t hh i g he c o n o m i cv a l u e i nr e c e n ty e a r s ， b l a c ks p o to fb r a s s i c ap l a n t sh a sb e e nf o u n dt ob ead e s t r u c t i v ed i s e a s ei nj i n g r n e n ， x i a o g a n ，h u a n g g a n g ，w u x u ea n dx i a n t a oi nh u b e ip r o v i n c e ，w h e r et h i sp l a n ti s e x t e n s i v e l yc u l t i v a t e d t h eo u t b r e a ko ft h i sd i s e a s ea f f e c t e dt h ee c o n o m i cb e n e f i t so f l o c a lf a r m e r s i np r i m a r yw o r k , t h ec a u s a la g e n to fr a p e s e e db l a c ks p o ti nh u b e i p r o v i n c ew a si d e n t i f i e da sa l t e r n a r i ab r a s s i c i c o l a f r o mc u l t u r a la n dm o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，a n ds u b s e q u e n ta n a l y s i so ft h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e rr e g i o no fr i b o s o m a l d n a a n dt h e n ，t h ep a t h o g e n i c i t yo fd i f f e r e n ts t r a i n s ，t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t h ep a t h o g e n ，t h ei d e n t i f i c a t i o no fc u l t i v a r sr e s i s t a n c ea n dt h ec h e m i c a lc o n t r o lo f t h i sd i s e a s ew e r ea l s os t u d i e di nt h i sp a p e r t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t sw e r el i s t e da s f o l l o w s ： t h et w ot y p e so f a l t e r n a r i as p ，aa n dbw e r ei s o l a t e df r o md i s e a s e ds a m p l e so f r a p e s e e di nh u b e ip r o v i n c ea n dt h e i s o l a t i o nf r e q u e n c yw a s7 3 5 ，9 2 6 5 ， r e s p e c t i v e l y p a t h o g e n i c i t yw a st e s t e db yi n o c u l a t i n gm y c e l i a lp l u g sa n dc o n i d i a s u s p e n s i o no f t h et w ot y p e so fa l t e r n a r i as p o n t ol e a v e sa n dp o d si nv i t r o i tt u r n e d o u tt y p ebc a nn o tc a u s ea n ys y m p t o m ；t w od a y sa f t e ri n o c u l a t i n gm y c e l i a lp l u g s a n dc o n i d i as u s p e n s i o no ft y p ea ，b l a c ks p o t sa p p e a r e do ni n o c u l a t e dl e a v e sa n d p o d s b yr e i s o l a t i n gt h es a m ea g e n tf r o md i s e a s e ds a m p l e s ，k o c h sp o s t u l a t e sw e r e f u l f i l l e d t h es e c o n da l t e m a r i as p w a sd e t e r m i n e dt ob et h ep a t h o g e no fr a p e s e e d b l a c ks p o ti nh u b e ip r o v i n c e a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，t h ep a t h o g e n w a sc u l t u r e do np o t a t od e x t r o s ea g a r 口d a ) w h i t ec o l o n i e sw e r eg i v e ni n i t i a l l y , t h e nt h ec o l o n i e st u m e db r o w nt ob l a c k , a n dv e r yt e n s e s p o r u l a t i o nw a si n d u c e do n c u tf i l t e rp a p e rf o l l o w i n gz h a n g t i a n y u w i t ht h ef i l t e rp a p e r + p c a i n d u c i n gc o n i d i a ， t h ec h a i nu s u a l l yh a dm o r et h a n10c o n i d i aa f t e rc u l t u r e df o r5d a y s s m a l l a r b o r i z a t i o nb r a n c h e dc o n i d i ac h a i nw a sf o r m e do nas i n g l ec o n i d i as t e m m a t u r e c o n i d i aw e r e b r o w n ， o v a t eo ri n v e r t e dr o d e a c hc o n i d i u mw a s 2 2 0 6 - 6 2 0 5 x 1 3 7 9 - 2 0 6 3 x m ，w i t h1 - 5 呦s v e r s ea n d0 - 2l o n g i t u d i n a lo ro b l i q u e i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 s e p i a w ed e n t i f i e dt h ep a t h o g e na sa l t e r n a r i ab r a s s i c i c o l ab a s e do nt h ed e s c r i p t i o n s b ys i m m o n sa n dz h a n g w eo b t a i n e dt h es e q u e n c e so fr d n a i t sa n dm a d e c o m p a r i s o n sw i t hg e n b a n ks h o w e d10 0 s i m i l a r i t yw i t ha l t e r n a r i ab r a s s i c i c o l a t w e n t y t h r e es t r a i n sw e r eo b t a i n e db yi s o l a t i n gs a m p l e sf r o md i f f e r e n ta r e a si n h u b e ip r o v i n c e p a t h o g e n i c i t yt e s ts h o w e dt h a tt h es t r a i n sh a dp a t h o g e n i c i t y d i f f e r e n t i a t i o n 1 1 1 es t r o n g e s tv i r u l e n ts t r a i n sc a m ef r o mx i a n t a o ，t h ew e a k e s tf r o m h u a n g g a n g 。b ys t u d y i n gt h r e es t r a i n sx t - l ，w x la n dh g 一5 ，i ti n d i c a t e dt h a t 5 - 3 5 cw a st h er a n g eo ft e m p e r a t u r ef o rm y c e l i a lg r o w t h ，2 5 。cw a st h eo p t i m a l t e m p e r a t u r e t h ep h v a l u er a n g ef o rt h em y c e l i a lg r o w t hw a sp 84 0 一l1 0 ，w i t ht h e o p t i m a lp h6 0 - 7 0 i nc z a p e kl i q u i dm e d i u m ，g l u c o s ea n dp e p t o n ew e r et h em o s t f a v o r a b l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sf o rm y c e l i a lg r o w t h t h em y c e l i a ll e t h a l t e m p e r a t u r ew a s5 5 ，1 0 r a i nw h i l ec o n i d i a6 0 。c ，l o m i n c o m p a r i s o ne x p e r i m e n t0 1 1s i x t y - e i g h tr a p e s e e dc u l t i v a r si nf i e l dt r i a li n d i c a t e d t h e r ew a sn oi m m u n eo rh i g h - r e s i s t a n tc u l t i v a r i nt h ea s s a yo fi n h i b i t i o no fm y c e l i a g r o w t ho fa b r a s s i c i c o l ab ye l e v e nf u n g i c i d e so np d am e d i u m ，t h ei n h i b i t i n g e f f e c t so f10 d i f e n o e o n a z o l ea n d3 0 b e n z a l d e h y d ep r o p i c o n a z o l ew e r et h e h i g h e s t t h e i r5 0 e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n ( e c s o ) v a l u e sw e r el e s s t h a nlp g m 1 p o t t e dp l a n te x p e r i m e n tf o rc h e m i c a lc o n t r o li n2 0 0 9s h o w e dt h a tt h es i g n i f i c a n t e f f e c tw a so b s e r v e dw i t h3 0 b e n z a l d e h y d ep r o p i c o n a z o l ee c ，t h ew o r s te f f e c t o b s e r v e dw i t h5 j i n g g a n g r n y c i n k e yw o r d s ：r a p e s e e d b l a c ks p o t ；a l t e r n a r i a b r a s s i c i c o l a ；i d e n t i f i c a t i o n ； p a t h o g e n i c i t y ；b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c ；r e s i s t a n tc u l t i v a r ；f u n g i c i d e sc o n t r o l 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 第一章文献综述 1 1 十字花科蔬菜黑斑病的发生和危害 十字花科蔬菜黑斑病是一种世界性的重要病害，黑斑病对十字花科蔬菜的 危害仅次于软腐病、霜霉病和病毒病3 大病害( 崔迪等，2 0 0 5 ) 。它是由芸薹 链格孢 a l t e r n a r i ab r a s s i c a e ( b e r k ) s a c c ，芸薹生链格孢口b r a s s i c i l o l a ( s c h w ) w i l t l 和萝卜链格孢0 r a p h a n ig r o v e se ts k o l o k o ) 弓 起的( d e g e n h a r d te t a 1 ， 1 9 8 2 ) 。它最早于1 8 3 6 年在甘蓝上发现。在我国北方地区主要由似b r a s s i c a e ) 引起，南方地区主要由芸薹生链格孢阻b r a s s i c i c o l a ) 引起( 王风敏等，2 0 0 7 ) 。 十字花科蔬菜黑斑病能为害十字花科蔬菜植株的叶片、叶柄、花梗及种荚等部 位。 十字花科蔬菜黑斑病病原菌早在1 9 1 9 年于广东省的甘蓝上发现，1 9 3 4 年开始 有为害大白菜的记载，该病在我国十字花科蔬菜上的严重发生是从2 0 世纪7 0 年代 末开始的，受害较为严重的地区有：吉林省、河北省、兰州市、北京市、武汉市、 云南省、贵州省等地部分地区( 李柱刚等，2 0 0 0 ) 。陕西省十字花科黑斑病病原 菌以a b r a s s i c a e 和a b r a s s i c i c o l a 为主，两种病原菌引起的病害分别占4 8 1 4 和 3 4 8 2 ( 刘焕然等，1 9 9 2 ) 。1 9 9 8 年，浙江金华市花椰菜黑斑病有零星发生，而 1 9 9 9 年的1 0 , - - - 1 1 月发病的面积达到6 0 左右，发病较重的田块病株率高达1 0 0 ( 陈菊芳，2 0 0 1 ) 。贵州威宁高海拔地区种植的反季节白菜随着种植面积的扩大， 黑斑病的发生危害也逐年加重，严重影响产量和质量( 李德友，2 0 0 6 ) 。2 0 0 8 年，江西抚州市发生严重的油菜黑斑病，严重影响了油菜籽的质量和产油量( 陈 学华，2 0 0 8 ) 。2 0 0 9 年，甘肃省发生严重的花椰菜黑斑病( 王春明等，2 0 0 9 ) 。 此外，该病害在其他十字花科蔬菜上的发生也相应地有所加重，在紫菜薹、芥菜、 芥篮、甘蓝和萝卜上都有严重发生的记录。 1 2 十字花科蔬菜黑斑病病原菌种群 在不同的地区、季节和菜种上发生的十字花科黑斑病往往由不同的病原菌引 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 起。其中较常见的有芸薹链格孢“b r a s s i c a e ) 、芸薹生链格孢b r a s s i c i c o l a ) 和萝 卜链格孢( 么r a p h a n i ) 。 芸薹链格孢菌落径向生长变化在2 0 0 8 1 0 m m 之间，呈奶油状，颜色为浅褐 至深褐色，扁平，有绒毛状( d h i r a je ta 1 ，1 9 9 4 ) 。分生孢子梗单生或束生，直 立，直或膝状弯曲，淡褐色，分隔，1 2 1 0 1 6 5 5 x 5 5 1 0 o p m 。分生孢子单生， 罕短链生，直或微弯，倒棒状，淡褐色至褐色，具横膈膜6 1 2 个，纵、斜隔膜6 1 2 个，孢身6 4 0 1 5 8 0 x 1 9 5 - 3 8 o i t m 。喙柱状，淡褐色，具分隔，2 3 0 - - - 9 3 o x 6 0 8 0 i i m 。 芸薹生链格孢分生孢子褐色，卵圆、梭形或短棍棒状，培养5 天可形成超过 1 0 个孢子的长链并有小数状分枝，无喙或有假喙，喙长0 1 4 1 t m ，有横隔l 8 个， 纵隔0 5 个。用p d a 培养基培养，初生孢子水滴状，无色，逐渐长成褐色或深褐 色，成熟孢子横隔处有明显缢缩。王风敏等( 2 0 0 7 ) 从陕西省春夏大白菜黑斑病 病样中分离得到的芸薹生链格孢在p d a 培养基上菌落呈黑色煤烟状。 萝卜链格孢分生孢子褐色或黄褐色，有棒状和梭状，喙有o 6 个横隔，孢子 平滑，横隔2 1 0 个，纵隔0 3 个，横隔处有缢缩。孢身5 0 - 一1 3 0 x 1 4 3 0 u m ，喙 长1 4 7 2 3 5 “m ，孢身至喙渐细，孢子一般单生，也有串生。李明远( 1 9 9 3 ) 从包头市麻池乡采集的白菜黑斑病标本上分离得到萝卜链格孢。萝卜链格孢在 p s a 上菌落初为白色，后转为暗灰色；菌丝近无色，有隔，直径约为2 8 i i m ； 分生孢子梗一般单生，少数数生。在p d a 培养基上可形成大量的厚垣孢子，一般 串生，少数单生，近球形，暗黑褐色，表面光滑，直径一般为菌丝的2 4 倍。分 生孢子均为短倒棍棒状，暗褐色，绝大多数有一短喙，喙至孢身宽度变化往往比 较明显，有横隔l 8 个( 平均5 2 个) ，纵隔0 - - 一9 个( 平均3 6 个) ，分隔处往往 有明显的缢缩。孢子大d x 2 7 5 7 6 2 5 x1 2 5 一3 0 0 “m 。 十字花科蔬菜黑斑病病原种类较多，种群组成复杂，而且季节变化大。病原 可以对寄主进行交叉感染( 刘焕然等，1 9 9 2 ) 。t o h y a m a 等( 1 9 9 5 ) 检测十字花 科蔬菜种子带菌过程中，发现检测频率最高的是芸薹生链格孢和萝卜链格孢，没 有发现芸薹链格孢。芸薹链格孢能引起一种重要的窖藏病害。调查表明，在陕西 省冬贮期该菌可占窖藏大白菜上交链孢菌总量的7 7 5 。在北京市，由田间带入 的芸薹链格孢，曾造成“强制通风型窖 中大白菜的烂窖。 2 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 在发病的组织上常常可以分离到细极链格孢，细极链格孢分生孢子梗短，分 枝或不分枝，分生孢子倒棍棒形或长椭圆形，淡褐色至中褐色，通常链生，生成 1 0 个左右的分生孢子链。成熟分生孢子具有4 7 个横隔膜，1 - 4 纵或斜隔膜。细 极链格孢是一种种生腐生菌，对种子与蔬菜无明显危害。 1 3 十字花科蔬菜黑斑病病原菌的分类鉴定 形态学、同工酶分析和分子生物学鉴定是研究微生物的分类所经历的三个阶 段，链格孢属真菌的黑斑病菌的分类鉴定技术也随着不断地发展。链格孢属真菌 在属级水平上特征非常明显，但在种级水平上的准确鉴定存在一定的困难。国内 外专家学者通过不懈的努力，做了大量研究探索明确链格孢种级分类单元，取得 了不少研究成果。 1 3 1 根据形态结构进行分类鉴定 虽然目前分子生物学是真菌分类研究中应用越来越广泛的方法，但多数 d n a 水平的研究结果与传统的形态分类研究结果是一致的，所以形态学特征还 是最容易使用、简单、快捷和经济的分类依据( 席兴文等，2 0 0 9 ) 。链格孢属的 传统分类鉴定主要是在p c a 十滤纸进行产孢表型观察，根据分生孢子的大小、颜 色、喙的有无及特征等进行鉴定的( 张天宇，2 0 0 3 ) 。 李明远( 1 9 9 3 ) 通过对白菜上的三种链格孢和细极链格孢做了比较分析， 并对萝卜链格孢的形态特征、培养性状、病原菌侵染特点和田间危害症状等都 进行了观察，发现鉴定萝卜链格孢需要借助多个性状。数值分类法在链格孢属 的种级鉴定中是一种有效的方法，链格孢属种的内在特征可以在数值分类法中 得以反映( 李多川等，1 9 9 3 ) 。 1 3 2 根据同工酶与酶联免疫分析的分类鉴定 1 9 6 2 年，在脉孢菌的分类鉴定中首次应用了可溶性蛋白凝胶电泳，从此， 可溶性蛋白图谱和同工酶电泳图谱在真菌的分类研究中得到了广泛的应用，成 为一种真菌分类鉴定的有效手段( 陆家云，2 0 0 0 ) 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 陈伟群等( 1 9 9 4 ) 对生于十字花科植物上的3 种链格孢属真菌上的2 1 个菌 株进行同工酶电泳得到的同工酶酶谱资料进行聚类分析，可将相似性水平较高 的2 1 个菌株分为3 大类群，每一类群包含的菌株与形态学的鉴定结果完全一样， 并且各菌株的归类关系与寄主植物、地理来源无关。同工酶凝胶电泳在链格孢 属真菌种级分类中是一个有用的工具，可以将不同菌株鉴定到种级水平。形态 特征明显、分类地位明确的种，如芸薹链格孢和芸薹生链格孢种内各菌株则更 为一致。 1 3 3 基于d n a 水平的分类鉴定 链格孢属种的鉴定传统依赖于形态学鉴定，然而形态学鉴定至少需要一周 的时间，费时费力，而且结果也不是非常可靠。目前，核糖体d n a 序列在链 格孢属种的鉴定中得到广泛应用，是准确性很高的一种分类方法( 刘春来等， 2 0 0 7 ) 。 通过对芸薹链格孢、芸薹生链格孢和萝卜链格孢的r d n a 部分序列进行了 比较分析，发现i t s l 和i t s 2 区存在较多变异，属的水平上的变异主要在i t s 2 ， 而种的水平变异主要在i t s l 上( g l a u d i ae ta l ，1 9 9 5 ) 。s h a r m a 等( 1 9 9 5 ) 用 r a p d 指纹分析同一地区和不同地区的芸薹链格孢株系，发现存在明显的变异。 s h a r m a 等( 1 9 9 8 ) 用r f l p 分析芸薹链格孢、芸薹生链格孢和萝b 链格孢，也发 现它们之间存在显著的差异。c l i v e 等( 2 0 0 2 ) 用r f l p 分析1 8 株芸薹生链格 孢，5 株链格孢和l 株黑麦喙孢，发现a f l p 是一种鉴定芸薹生链格孢的有效 手段。当十字花科蔬菜种子被芸薹链格孢感染时，用r e a l - t i m ep c r 不但可以简 便有效的检测出病菌，还可以定量分析( t h o m a se ta l ，2 0 0 4 ) 。j a s a l a v i c h 等( 1 9 9 5 ) 用i t s 区域和5 8 s 基因区分出了十字花科蔬菜上芸薹链格孢、芸薹生链格孢、 萝卜链格孢和侵染链格孢这四个种。 1 4 十字花科蔬菜黑斑病菌的生物学特性及侵染机理研究 1 4 1 十字花科蔬菜黑斑病病原菌生物学特性研究 国内外对十字花科蔬菜黑斑病的病原菌生物学的研究报道比较多，不同种问 4 油菜黑斑病病原学及防治技术研究 的生物学特性存在一定的差异。研究并了解十字花科蔬菜黑斑病菌的生物学特 性，可以为病害的综合防治提供理论依据。 肖长坤等( 2 0 0 4 ) 选用来自国内外的白菜黑斑病菌三个种a b r a s s i c i c o l a ， a b r a s s i c a e 和a r a p h a n i 为研究材料，对比研究了白菜黑斑病菌国内外不同菌株基 本培养性状，结果表明：菌落颜色和菌落直径在白菜黑斑病菌三个种之间差异明 显且比较稳定，可以作为区分这三个种的辅助依据。 十字花科蔬菜黑斑病国内外不同菌株菌丝体生长最适温度变异不显著，一般 为2 0 - 2 5 c 之间( k h a t u ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。芸薹生链格孢菌在c z a p e k 6 种碳源上的菌 落直径均小于基础培养基上的菌落直径，是其培养特征的显著特点。链格孢属真 菌不同种之间在碳源培养基上的培养特征差异较大，但应用于分类鉴定仍需做大 量的研究工作( 胡勤星等，2 0 0 9 ) 。 不同光照处理对芸薹生链格孢菌丝生长的影响不大，但对芸薹链格孢菌丝生 长的影响存在显著性差异( 阎淑娟等，1 9 9 8 ) 。较高的温度，偏酸( p h 4 0 - 6 0 ) 的环境，光照下振荡培养有利于芸薹链格孢菌丝的生长( 樊慕贞等，1 9 9 5 ) 。 1 4 2 十字花科蔬菜黑斑病毒素的研究进展 链格孢属真菌可产生7 0 多种有毒代谢产物一链格孢毒素，这些毒素是其作用 于植物的主要致病因子，通过毒素的作用不仅使植物产生症状，造成危害，而且 人和动物摄入被链格孢毒素污染的食品及饲料后还可导致急性或慢性中毒，某些 链格孢毒素还有致畸、致癌、致突变作用( 李凤琴，2 0 0 1 ) 。根据致病毒素对寄 主植物的种或栽培品种是否具有特异生理活性和高度专化性作用位点，分为寄主 选择性毒素( h o s ts p e c i f i ct o x i n s ) 和非寄主选择性毒素( n o n h o s