（植物学专业论文）负压空化法高效提取虾青素的研究.pdf

摘要 摘要 本文主要研究了使用负压空化法从法夫酵母中提取虾青素的工艺。该工艺包括虾青 素的高效提取和纯化。 实验研究了烘干处理对法夫酵母中虾青素含量的影响，使用法夫酵母鲜物料作为提 取材料，证明了鲜法提取的创新性和实用性。还研究了负压空化法的各项工艺条件对新 鲜法夫酵母中虾青素提取效果的影响，确定了负压空化法提取的小试最佳工艺参数，提 取溶剂为浓度8 0 的乙醇溶液、提取时间为3 5 m i n 、料液比为1 ：2 0 、通气量为 o 2 m 3 l l 。并且进行了中间放大实验，将中试通气量确定为2 m 3 l l ，提取效果与小试相 当。同时将负压空化法与常用破壁提取方法的提取效果和效率进行了比较，综合结果证 明负压空化法优越于其他方法，具有高效性和节能性，是一种能够适应工业生产的新型 提取方法。 对负压空化法提取前后法夫酵母细胞的形态进行了显微观察，得到了显微照片，结 果表明提取后的绝大多数法夫酵母细胞并没有破碎，而且周围包围许多红色的点状物 质。分析是因为在空化提取的过程中，气泡作用于网状结构的细胞壁及膜，将其通透性 增加，以脂肪滴的形式存在的虾青素从细胞中被抽提了出来，围绕在细胞周围的结果。 同时还对提取的作用机制进行了理论研究，得出了气泡对细胞的作用模式。 通过硅胶柱层析和重结晶的小试以及中间试验，建立了一套虾青素的分离纯化工艺 路线。虾青素成品的纯度达到9 2 ，收率为7 4 6 ，最后的得率为万分之四点五。 关键词法夫酵母；虾青素；负压空化法；提取；纯化 东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee x t r a c t i o no fn a t u r a la s t a x a n t h i nf t o m 尸死c 列孵口砌d d 咖口w a ss t u d i e d t h ep r o c e s s i n c l u d e sh i g h e f ：i e c t i v ee x t r a c t i 6 na n dp u r i f i c a t i o n t h ec o n t e n tc h a n g e0 fa s t a x a n t h i na f t e rd r y i n gw a ss t u d i e d t h ef t e s hm a t e r i a lw a su s e d j ne x t r a c t i o n ，a n di ti san e wk j n do fe x t r a c t i o nm a t e r j a l t h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo f a s t a x a n t h i nw i t ht h ev a c u u mc a v i t a t i o nw a sd i s c u s s e di n t h i sa r t i c l e t h ei n n u e n c e s0 f e x t r a c t i o ns o l v e n t ，c o n c e n t r a t i o no fs o l v e n t ，t i m ea n dv e n t i l a t i o no ne x t r a c t i n gr a t i o sw e r e e x p l o r e d ，a n dt h eb e s te x t r a c t i o np a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e d t h ee x t r a c t i o ns o l v e n ti s 8 0 e t h a n o l ，t h ee x t r a c t i o nt i m ei s3 5m i n u t e sa n dt h ev e n t i l a t i o ni s0 2 m 3 1 1 i nt h em i d d l e e x p e r i m e n tt h ev e n t i l a t i o ni s2 m 3 1 1 t h ee f e c ta n de f f i c i e n c yo ft h ev a c u u mc a v i t a t i o n sw e r e c o m p a r e dw i t ho t h e rc e l l - b r o k e ne x t r a c t i o ni nc o m m o n u s e t h ev a c u u mc a v i t a t i o n se x t r a c t i o n i ss u p e r i o rt oo t h e r sa n di san e we x t r a c t i o nm e t h o df i t t i n gi n d u s t r y t h ec e u s o f 砌c 砺昂口 砌d d d 砂，7 1 l 口 b e f o r ea n da f t e re x t r a c t i o nw e r eo b s e e du s i n g m i c r o s c o p e ，a n dt h ep h o t o so ft h ey e a s tc e u sw e r eo b t a i n e d t h ey e a s tc e n sw e r en o tb r o k e n a f t e re x t r a c t i o na n dt h e r ew e r es o m er e dp a n i c l e sa r o u n dt h e m i nt h ep r o c e s s0 ft h ev a c u u m c a v i t a t i o n s ，a s t a x a n t h i np a s s e dt h r o u g ht h ec e l lw a l l0 w i n gt ot h ea i rb u b b l e s 7 i l l ea c t i o n m e c h a n i s mo fe x t r a c t i o nw a ss t u d i e d ；t h ea c t i o nm o d eo fa i rb u b b l ew a sa b t a i n e d t h ep u r i f i c a t i o no fa s t a x a n t h i nw a ss t u d i e d t h ec o n t e n to fa s t a x a n t h i ni s9 2 ；t h ey i e l d r a t ei s0 4 5 k e y w o r d s砌c 砺厅口砌d d 叻，竹口；a s t a x a n t h i n ；t h ev a c u u mc a v i t a t i o n s ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n i i 1 绪论 1 1 虾青素的研究现状 1 绪论 1 1 1 虾青素的性质 虾青素( a s t a x a n t h i n ) 3 , 3 二羟基4 ，4 二酮基b ，b 胡萝卜素，分子式为c 4 0 h 5 2 0 4 ( 如图1 - 1 ) 【l j ，是一种非维生素a 原的类胡萝卜素，其相对分子量为5 9 6 8 6 ，熔点 2 2 4 ，易氧化且对光敏感，能溶于大多数有机溶剂，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯 仿、丙酮。虾青素的重要性质在于它的抗氧化性，其分子结构中具有比较活泼的电子效 应，极易与自由基反应而清除自由基，被赞誉为“超级维生素e ”和“超级抗氧化剂” 【2 】 o 图1 - 1 虾青素的化学结构式 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo f a s t a x a n t h i n 虾青素广泛存在于鲑鱼、虾、蟹、观赏鱼和鱼卵中，以及植物叶、花和水果中，绝大 多数海产甲壳类动物和鱼类都含有虾青素，但都是通过食物链从海洋微藻、浮游植物和 浮游动物中获得的，这些海产动物通常都是人类的日常膳食，对人体绝对安全【3 j 。虾青 素不仅能使鲑鱼的肉呈桃红色，虾、蟹的壳呈深红色，保证了水产动物具有良好的市场 价值，而且它还是这些动物正常生长和存活所必需的营养物质，作为人类的高级保健食 品、药品和水产动物、家禽、家畜的饲料添加剂市场非常广刚引。 1 1 2 虾青素的抗氧化机理 生物体的光氧化、生理胁迫和正常的免疫系统功能都会产生几种有害的活性氧，如 单线态氧和氧自由基。这些分子含有非配对的电子，具有高度不稳定性，会导致氨基酸 的氧化、蛋白质的降解和d n a 的损伤等多种细胞伤害。氧自由基还会攻击细胞膜上的 不饱和脂肪酸，过度氧化的脂肪酸能通过链式反应产生更多的脂肪酸自由基。过多自由 基的存在打破了生物体自由基与抗氧化剂的平衡，成为导致风湿性关节炎、心脏病、 p a r k i n s o n 氏综合症、a l z h e i m e r 氏综合症、多种癌症和休克的重要原因【5 j 。天然虾青素 具有特殊的分子结构，含有大量的共轭双键，可与脂过氧自由基反应，抑制脂质过氧化 东北林业大学硕士学位论文 的扩展，切断自由基链式反应，具有清除氧自由基的强大能力，体外实验还发现它是单 线态氧的强大淬灭剂，是一种极有效的抗氧化剂【6 】。在雨生红球藻 ( h a e m a t o c o c c u p l u v i s l i s ) 活细胞内，它作为光保护剂和强抗氧化剂，能够淬灭由强光 和过度氧化产生的多种活性氧，防止活性氧对细胞的伤害07 、8 1 。天然虾青素比角黄素 ( c a n t h a x a n t h i n ) 、b 胡萝卜素( b c a r o t e n e ) 和玉米黄素( z e a x a n t h i n ) 能更有效地阻 止不饱和脂肪酸甲酯的过度氧化【9 1 ，其抗氧化活性是维生素e 的5 5 0 倍，是b 胡萝卜 素、玉米黄素、叶黄素( 1 u t e i n ) 和角黄素等类胡萝卜素的1 0 倍。 1 1 3 虾青素的生物活性和生理功能 虾青素具有很强的抗氧化性能和显色作用，动物实验表明它有抑制肿瘤发生、增强 免疫功能等多方面的生物活性和生理功能【1 0 】，因此在功能食品和医药等方面应用广泛 【1 1 】 o 保护皮肤免受光损伤，阻止皮肤的光老化【1 2 1 。 调节血液中的胆固醇含量，预防和抵抗动脉硬化和自由基引起的相关疾病【1 3 , 1 4 j 。 具有抗癌作用，能直接作用于免疫系统，导致肿瘤缩小【1 引，对紫外线引起的皮肤 癌有很好的治疗效果1 1 6 , 1 7 j 。 增强免疫系统功能，可作为免疫增强剂使用【1 8 】。 维护眼睛和中枢神经系统的健康【1 9 】，减少紫外线对机体的伤害【2 0 , 2 1 1 。 强化肌体的能量代谢，使人的肌肉力量和耐受力明显增强1 2 2 1 。 具有抗感染活性，可作抗感染药物的配合剂瞄】。 1 1 4 虾青素的应用 1 1 4 1 作为人类的高级营养保健食品和药品 目前，国际上利用天然虾青素开发人类的高级营养保健食品和药品，其产品定位主 要在强化免疫系统功能、抗癌、保护视网膜免受紫外辐射和光氧化、抗炎、预防血液 l d l - 胆固醇的氧化损伤等方面，最近日本又开发出两种皮肤外用制剂，以及含有虾青 素的抗炎制剂和饮料【2 4 之6 1 ，可用于保护皮肤免受紫外辐射的损伤。虾青素在功能食品和 医药方面具有广泛的应用前景，制成药物可预防氧化性组织损伤，配制保健食品可以预 防自由基所造成的组织损伤与细胞衰老，有益于心脏健康并可预防血管硬化、视网膜黄 斑退化和其它因机能衰老所引起的症状。 1 1 4 2 作为水产养殖业的饲料添加剂 虾青素是一种优良的饲料添加剂，它不仅对动物机体具有着色作用，还能提高动物 的免疫力、促进抗体的产生、抗氧化、消除自由基、促进机体生长、提高繁殖能力【27 j 和 抗病能力【2 8 , 2 9 】。水产养殖业始终是虾青素最大的市场，在商业化的鱼类和甲壳类动物 ( 如鲑鱼、虾、蟹、虹鳟鱼等) 养殖厂，通常在饲料中添加虾青素以补充色素，可极大 提高产品的市场价格【3 0 】。虾青素不仅仅做为水产养殖动物的着色剂，越来越多的证据证 实，虾青素是水产动物必需的维生素，对它们的正常生长和健康养殖、提高存活率和繁 殖率具有极为重要的作用l 。 1 1 4 3 作为蛋禽和家畜工业的饲料添加剂 天然虾青素作为蛋禽和家畜的饲料添加剂，目前的市场容量为1 2 5 亿美金，其需求 还在不断地增长。在家禽饲料中添加虾青素可使鸡蛋蛋黄增加色素含量，这是欧洲消 费者首先考察的参数。在蛋鸡饲料中加入2 9 5 的法夫酵母粉，蛋黄的最大吸收波长从 5 7 1n r n 提高到5 9 3n m ，而加入1 0 8 5 的黄玉米时，仅提高到5 7 5n m 。用添加了虾青素 的饲料喂养的肉禽，皮肤、脚、嚎呈现出金黄色，这些都大大提高了禽蛋、肉的商品价 值。另外，虾青素作为营养物质还可促进家禽的生长和提高产蛋率，而且这种蛋富含虾 青素，非常有利于人体的健康【3 2 , 3 3 】。同时，在孵化初期的3 周内还能促进鸡仔的生长和 饲料利用率、降低鸡仔的死亡率、提高孵化率、抵抗沙门氏菌的感染、延长鸡蛋的货架 期。 1 1 5 虾青素的生产 目前，虾青素的主要生产方式有两种，即化学合成和天然提取。 1 1 5 1 化学合成 化学合成虾青素的主要途径是在1 3 胡萝卜素的两个末端环上分别加上一个羟基和 一个酮基，要经由多步化学和生物催化反应才能完成，工艺较复杂且难控制，所以用这 种方式生产的虾青素成本也比较高。目前，化学合成虾青素的价格为每公斤2 0 0 0 到 2 5 0 0 美元，是蛙鱼饲料着色剂的主要来源。h o f f m a n n l a r o c h ea g 和b a s fa g 两企业 都在以化学合成法生产虾青素，它们生产的商品虾青素是虾青素和许多稳定成分( 包括 动物胶，蔗糖，玉米淀粉，变性淀粉) 的混合物，其中虾青素的含量为5 。合成的产 品抗氧化功能较差【3 5 】，又由于受绿色波的冲击，化学合成品的使用不仅为广大消费者所 警惕【2 1 1 ，而且也更为各国法规所限制，因此，天然虾青素的生产更具有发展潜力。 1 1 5 2 天然提取 天然提取虾青素的主要原料有三种【3 1 】：虾壳及水产下脚料、雨生红藻和法夫酵母。 虾壳及水产下脚料中色素含量较低，而灰份和几丁质的含量较高，因此提取成本较 高，很大程度上限制了它们的应用。 雨生红藻中虾青素的含量很高，可达总色素的6 0 8 0 ，在控制条件下，该藻中 的总胡萝卜素可达干菌体的0 5 2 ，是一种非常重要的天然虾青素资源。在夏威 夷，利用雨生红球藻生产虾青素已经实现了产业化规模生产【3 6 】。但其中8 7 是以酯化状 态存在，某些动物对酯化虾青素的吸收和沉积较差，且藻类的生长条件极其苛刻，对水 质、环境及光的要求很高，大规模生产依然存在难度。 法夫酵母中虾青素的含量较高，占总类胡萝卜素的4 0 - 9 5 ，且繁殖快，生长周 期短，发酵工艺较为成熟，是最有可能实现工业化生产虾青素的优良菌种，但是法夫酵 母的细胞壁坚硬，这给提取工作带来了一定的困难。而且国际市场上高纯度的天然虾青 东北林业大学硕士学位论文 素价格很高，并不能适合人们的需求，这些都是目前生产中急需解决的问题。 1 2 法夫酵母细胞破壁研究的现状和趋势 1 2 1 法夫酵母的生物学特性 法夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 为范菲亚属，是由p h a f f i a 等人在日本及美国阿拉斯 加山区上落叶树的渗出物中首先分离得到的，迄今为止此属只有一种。法夫酵母以卵圆 形单细胞为主，大小3 6l am 5 - - 一1 2um ，也有几个细胞连在一起的，有时细胞呈假 菌丝状【3 7 】。法夫酵母所产的十几种类胡萝b 素中虾青素含量最高，占总类胡萝b 素的 4 0 - 9 5 3 引，但其细胞壁异常坚硬，动物摄入体内后很难消化吸收，而且法夫酵母不 破壁就难以进行虾青素的高效提取，所以，实现虾青素的高效提取首先应该解决破壁问 题。酵母细胞的细胞壁结构复杂( 如图1 2 所示) 1 3 9 】，主要由几丁质、甘露寡糖、糖蛋 白和1 3 葡聚糖组成，它的存在严重影响胞内物质的释放，其细胞破壁对提高酵母利用 率十分重要，是细胞破壁方面的难点之一。 图1 2 法夫酵母细胞表层结构 1 夕r 表层；2 甘露糖蛋白质层 3 裸露的葡萄糖层表面；4 葡萄糖层；5 细胞膜表面 f i g 1 2s u r f a c el a y e rs t r u c t u r eo f p h a f f i ar h o d o z y m ac e l l 1 2 2 法夫酵母中虾青素的合成途径 虾青素是经甲羟戊酸途径合成的一种四萜化合物，甲羟戊酸( m v a ) 是含有5 个碳 原子的异戊二烯单元的第一个前体，而异戊二烯单元是类异戊二烯生物合成的主要单 元。这个途径起源于乙酰c o a 经甲羟戊酸( m v a ) 形成异戊烯焦磷酸( i p p ) ，八个异 戊烯焦磷酸缩合形成无色的类胡萝b 素八氢番茄红素，再经过四步脱氢反应和两步 环化反应形成1 3 一胡萝b 素，最后1 3 胡萝b 素氧化形成虾青素。p 3 4 u ，4 l j 1 绪论 1 2 3 国内外使用的法夫酵母破壁提取方法 目前，虾青素的提取主要是先用各种方法破壁，然后再用有机溶剂提取【4 2 1 。法夫酵 母细胞破壁方面广泛使用的方法主要有三类：化学破壁、物理破壁、生物破壁，图1 3 列出了一些主要方法【3 9 1 。 图1 3 酵母细胞的破壁方法 f i g 1 - 3m e t h o d so fy e a s tc e l lb r o k e n 1 化学破壁：化学破壁法主要是通过一定浓度的酸碱等化学试剂对胞壁进行浸泡处 理，破坏其胞壁组织，以达到细胞壁破碎细胞内容物流出的目的，从而实现对细胞内物 质的提取。此种方法破壁的缺点在于酸碱等化学试剂在破坏胞壁的同时，对细胞内其他 物质尤其是要提取的目标物会产生严重的破坏作用。 2 物理破壁：物理破壁法是使用一定的物理机械手段破碎细胞壁或通过温度瞬间大 幅度变化来实现胞壁破裂，包括液体剪切、固体剪切、超声处理、变温法等。由于物理 法一般作用时间较长且胞壁破碎的程度较轻，对于虾青素这样易氧化的物质来说，物理 法会导致细胞内物质氧化降解，而且细胞碎片存在死角，造成破壁率高而提取率低的结 果。 3 生物破壁：生物破壁主要包括酶解法、自溶法等，是利用蜗牛酶、纤维素酶、半 纤维素酶或复合酶等对胞壁物质( 蛋白及纤维素) 进行酶解，这种方法对细胞内物质刺 激较小，但由于使用酶的成本较高，限制了大规模利用，若回收溶酶以降低成本，则又 增加了分离纯化溶酶的操作。 所以，现在非常需要找到一种高效节能且又适用于大规模生产的新型破壁提取方 法，得以解决法夫酵母的破壁难题，进一步提高虾青素的提取率，满足国际市场的需 求。 东北林业大学硕士学位论文 2 虾青素含量的检测 2 1 实验仪器、材料和试剂 高效液相色谱仪( j a s c o ，1 5 8 0 泵，1 5 7 5 型紫外检测器，v e r s i o n6 1 色谱工作站) ， 虾青素标准品( s i g m a 公司) ，甲醇( 色谱纯，j & kc h e m i c a ll t d ) 、乙腈( 色谱 纯，j & kc h e m i c a ll t d ) 、冰乙酸( 色谱纯，天津瑞金特化工厂) ，四氢呋喃( 分析 纯) 、丙酮( 分析纯，北京化工厂) 。 2 2 实验方法 2 2 1 色谱条件 流动相：甲醇：乙腈：四氢映喃：冰乙酸：4 5 5 ：3 4 ：1 1 ：0 8 ；色谱柱：h i os i lc 1 8 w 色谱柱 ( 4 6 m m x 2 5 0 m m ，5 p m ) ； 流速：1 0 m l j m i n ；进样量：1 叩l ；柱温：2 5 。c ；检测波长： 4 7 6 n m 。 2 2 2 标准曲线的绘制 精密称取虾青素标准品l m g 于1 0 m l 的容量瓶，以丙酮为溶剂超声溶解，定容为标 准溶液。分别精密吸取标准溶液0 1 m l 、0 2 m l 、0 4 m l 、0 8 m l 、l m l 置于l o m l 容量 瓶中，以丙酮为溶剂定容摇匀，分别进样分析。 2 3 结果分析 2 3 1 色谱行为 结果见图2 - 2 。虾青素的保留时间为4 9 1 7 m i n 。 图2 - 2 虾青素的色谱行为 f i g 2 2c h r o m a t o g r a mo fa s t a x a n t h i n 6 2 虾青索含量的检测 2 3 2 线性关系 以紫外吸收峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程，见图2 3 。 娶 旧 磐 擎 督 l 止h 戳 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 20 0 0 40 0 0 60 0 0 80 0 1 虾青素浓度( m g m l ) 图2 - 3 虾青素标准曲线 f i g 2 - 3s t a n d a r dc u r v eo fa s t a x a n t h i n 虾青素的回归方程为：y = 3 e + 0 8 x + 9 9 1 8 3 ，r 2 = o 9 9 9 9 。虾青素在0 0 0 1 - - 一0 o l m g m l 浓度范围内与紫外吸收峰面积有良好的线性关系，浓度与峰面积间的相关性显著。 2 3 3 加样回收率 向虾青素样品中加入一定量的标准品，按2 2 2 方法测定虾青素含量，同时测定样 品本底，每个样品平行进3 针，测得平均回收率为9 8 4 。 东北林业大学硕士学位论文 3 空化提取技术理论的提出与虾青素提取方案的确定 3 1 负压空化提取的理论基石气泡理论 3 1 1 空化的定义及研究现状 一般把液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸汽或气体的空穴( 空 泡) 的形成、发展和溃灭的过程，叫做空化( c a v i t a t i o n ) 1 4 3 4 4 。空泡在随液体流动过程 中，遇到周围压力增大时，体积将急剧缩小或溃灭。由于空泡溃灭过程发生于瞬间( 微 秒级) ，因而在局部产生极高的瞬时压强，当溃灭发生在固体表面附近时，流体中不断 溃灭的空泡所产生的极高压强的反复作用，破坏固体表面，这种现象称为空蚀1 4 5 , 4 6 j ，又 称气蚀。 对空化和空蚀现象的认识和研究可追溯到上一世纪。早在1 7 5 3 年，e u l e r 就注意 到，水管中某处的压强若降低到负值时，水即自管壁分离，而在该处形成一个真空空 间。1 8 3 9 年b e s a n t 及1 8 7 3 年r e y n o l d s 开始在实验室对空化进行研究。1 9 1 7 年 r a y l e i g h 比较系统地提出了空化理论，建立了描述自由空泡运动的方程。在此基础上， p l e s s e t 进一步研究， 得到了著名的r a y l e i g h p l e s s e t 方程，形成了空泡动力学的基础机 理因素。刘小兵和程良骏在总结前人工作的基础上，从理论上较全面地分析了空泡在任 意流场中的受力和影响较全面地分析了空泡在任意流场中的受力和影响因素，建立了空 泡在任意流场中运动的三维控制微分方程【4 7 , 4 8 】。随着高速摄影技术的快速发展，黄继汤 等人摄取了具有不同表面张力的液体中由电火花放电引起的空泡直径变化过程，让我们 看到了在不同液体中空泡的膨胀、收缩过程【4 9 。 3 1 2 负压空化法的作用机制 当连续地把气体释放进液相或固液两相中去，由于气流在外力( 正压、负压) 作用 下与液相或液固两相相互冲撞，以及气一液两相或气液固三相交界面处表面张力之间的 不平衡因素，气泡上升并带动液体形成主要是向上的流动，气流破碎成气泡，液相破碎 成液泡，形成气液两相或气固液三相的混沌体系。体系中有效物质在气泡的空化空蚀效 应、湍动效应、混旋及界面效应的作用下进行相间的快速传递，形成动态的强化传质体 系，这一传质过程命名为空化混旋萃取。采用负压手段产生气流形成气泡，在气液固三 相中强化传质的方法叫负压空化法。 空化气泡的形成与气速有关。当进入固液或液液体系内的操作气速较低时，颗粒尚 未被流化，气体由颗粒缝隙溢出，气体的通过只能使颗粒的空隙率发生变化，不形成气 泡。达临界流化状态以后，细颗粒开始形成良好的散式流态化，且体系膨胀明显；高速 时形成气泡，且随着气速的增大，气泡的数量和尺寸迅速膨胀，体系就会形成气泡相和 3 空化提取技术理论的提出与虫f 青素提取方案的确定 乳化相。当关掉气阀或卸掉负压至常压时，体系内的混旋状态消失，气泡相迅速溃灭， 乳化相亦随之消逝。气泡在进行上下运动中由于液体压力和负压的综合作用，小气泡随 着压力梯度的瞬间变化而发生巨大变化，在气固液三相相际间进行传质，这种传质过 程在气流的推动下反复进行。我们可以利用气泡产生的巨大能量，将法夫酵母细胞破 碎，达到胞内物质释放的目的，从而实现虾青素的高效提取；或者将酵母细胞表面膜和 壁的通透性加大，使提取溶剂能够瞬间进入，将酵母细胞内部物质抽提出来，从而一步 实现虾青素的高效提取。 3 2 烘干处理对法夫酵母中虾青素含量的影响 3 2 1 实验仪器、材料和试剂+ 法夫酵母发酵液( 由浙江海正药业股份有限公司提供) ，烘箱，高效液相色谱仪 ( j a s c o ，1 5 8 0 泵，1 5 7 5 型紫外检测器，v e r s i o n6 1 色谱工作站) ，液氮，研钵，超声 机，乙醇( 哈尔滨新春化工厂) 。 3 2 2 实验方法 量取法夫酵母发酵液6 份，每份5 m l ，其中3 份放入烘箱，8 0 烘干直至恒重，称 重记录数据。将3 份法夫酵母发酵液与3 份法夫酵母烘干物料分别置于研钵中，液氮快 速研磨至粉末状，然后迅速使用5 0 m l 乙醇溶液进行超声提取，重复提取5 次，合并提 取溶液，减压浓缩至干，分别使用乙醇溶液溶解定容至5 0 m l ，取样1 2 0 0 0 r m i n 离心， h p l c 检测。 3 2 3 结果分析 表3 - 1 烘干处理对法夫酵母的影响 t a b l e3 - 1e f f e c tt op h a 历ar h o d o z y m aa f t e rd r y i n g 重量儋 烘干耗时l l 虾青素含量g 1 0 84 55 8 2 1 干物料 o 9 71 0 14 5 4 55 6 6 95 7 2 o 9 84 5 5 6 7 1 4 7 40 7 0 0 5 鲜物料 5 0 24 900 7 0 9 27 0 3 6 4 9 407 0 】 目前，在工业生产虾青素的过程中，要先将法夫酵母发酵液首先进行烘干处理，采 用干酵母粉作为提取原料，根据表3 - 1 的结果可知，鲜物料的平均含水率为7 9 4 ，烘 干用时为4 5 h ，干物料中虾青素的含量比鲜物料下降了1 8 7 。 东北林业大学硕士学位论文 分析原因为，在烘干处理过程中，高温将细胞内外的水分带走的同时，影响了法夫 酵母细胞内虾青素的含量，造成其空间构造变化，降解成为其它物质。长时间的高温在 提取前便造成了一部分虾青素的损失，繁化了操作工序，浪费了能源，而且，在烘干的 过程中细胞壁变硬，弹性减弱，这将会给下一步的空化提取带来一定的困难，可能会造 成提取效果的降低。所以在负压空化法提取虾青素的实验中，选择新鲜的法夫酵母作为 提取材料。 法夫酵母鲜活物料是一种环保节能的新型提取材料，使用鲜物料直接进行虾青素的 提取，能够省略物料烘干的过程，并且避免这一过程中高温对虾青素的破坏，极大的节 省实验时间和成本。 3 3 运用负压空化法提取虾青素参数的选择 3 3 1 负压空化法小试最佳工艺参数的确定 3 3 1 1 实验仪器、材料和试剂 法夫酵母发酵液( 由浙江海正药业股份有限公司提供，经测定含水率为7 9 4 ) ， 自制空化柱( 如图3 1 ，内径为4 c m ，上端连接空气流量计和真空泵，下端配有法兰控 制空气进量) ，真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ，空气流量计( 上海) ，高效液相色 谱仪( j a s c o ，1 5 8 0 泵，1 5 7 5 型紫外检测器，v e r s i o n6 1 色谱工作站) ，离心机( 宁波新 芝科器研究所) ，甲醇( 北京化工厂) ，乙醇( 哈尔滨新春化工厂) ，丙酮( 北京化工 厂) ，二氯甲烷( 天津瑞金特化工厂) 。 图3 - 1 小试空化装置 f i g 3 1v a c u u mc a v i t a t i o n se q u i p m e n t 3 空化提取技术理论的提出与虾青素提取方案的确定 3 3 1 2 实验方法 提取溶剂对虾青素提取率的影响 量取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷各l o o m l ，分别与l o m l 法夫酵母发酵液混合， 置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为3 0 m i n ，通气量为0 2 0 m 3 h ，分别取样，样 品经1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 后采用h p l c 检测虾青素的含量。 乙醇浓度对虾青素提取效果的影响 量取5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 的乙醇溶液各1 0 0 m l ，分别与1 0 m l 法 夫酵母发酵液混合，置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为3 0 m i n ，通气量为 0 2 0 m 3 h ，分别取样，样品经1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 后采用h p l c 检测虾青素的含量。 提取时间对虾青素提取率的影响 量取1 0 m l 法夫酵母发酵液，与1 0 0 m 璐o 的乙醇溶液混合，置于空化柱中，进行 负压空化提取，时间为1h ，通气量为0 2 0 m 3 h ，每间隔5 m i n 取样，样品经1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 后采用h p l c 检测虾青素的含量。 料液比对虾青素提取效果的影响 量取3 份1 0 m l 法夫酵母发酵液，分别用8 0 乙醇溶液提取3 次( 料液比分别为 1 ：1 0 、1 ：2 0 、1 ：3 0 ) 进行对比实验，通气量为0 2 0 m 3 h ，时间为3 0 m i n ，收集提取液，浓 缩至干，分别用1 0 0 m l 乙醇溶解，取样，样品经1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 后采用h p l c 检 测虾青素的含量。 通气量对虾青素提取效果的影响 量取5 份1 0 m l 法夫酵母发酵液，分别与1 0 0 m l 8 0 乙醇溶液混合，置于空化柱 中，进行负压空化提取，时间为3 0 m i n ，选择通气量0 1 0m 3 h 、0 1 5m 3 h 、0 2 0m 3 h 、 o 2 5m 3 h 、0 3 0m 3 h 进行对比实验，分别取样，样品经1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 后采用 h p l c 检测虾青素的含量。 3 3 1 3 结果分析 提取溶剂的选择对虾青素提取效果的影响 1 。r ，_ ，t ， ，t ， - ，_ ，t t t ， t t1 ， tt，1 甲醇乙醇丙酮二氯甲烷 提取溶剂 图3 2 不同提取溶剂对虾青素提取效果的影响 f i g 3 - 2e f f e c to fe x t r a c t i o nu s i n gd i f f e r e n ts o l v e n t s 0 o o o 0 0 o o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o o 0 0 o o o 0 o 2 o 8 6 4 2 0 9 9 8 8 8 8 8 鼷衄磐娶督武畿 东北林业大学硕士学位论文 在提取工艺中，应选择对目标提取物溶解度高、价格便宜、毒性低且易回收的提取 溶剂，又由于负压空化提取法特有的特点，在提取的过程中溶剂在空化柱内会剧烈的混 旋，负压作用下的气流将带走一部分溶剂，提取溶剂的挥发性较强会导致过多的溶剂进 入空气之中，造成环境污染，所以应该首选挥发性弱的提取溶剂。目前，虾青素提取中 常用的溶剂有二氯甲烷、丙酮、甲醇和乙醇。二氯甲烷的毒性大，挥发性强，且与鲜物 料无法互溶，出现提取溶剂与提取物分层的现象，给物料的装投和处理带来极大的不 便；丙酮的提取效果较好，但其挥发性较强，毒性也较大，在物料的提取、溶剂的回收 过程中，却将会对环境造成大量的污染，而且还会繁化操作人员的安全防护和产品的后 处理等工作程序；甲醇和乙醇的效果相当，我们选择毒性较低的乙醇作为虾青素的提取 溶剂。 乙醇浓度对虾青素提取效果的影响 1 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 释8 0 0 0 0 0 喧7 0 0 0 0 0 鹫6 0 0 0 0 0 擎5 0 0 0 0 0 螫4 0 0 0 0 0 武3 0 0 0 0 0 涨2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 o 5 06 07 08 09 01 0 0 乙醇浓度( ) 图3 3 乙醇浓度对虾青素提取效果的影响 f i g 3 3e f f e c to fe x t r a c t i o nu s i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ne t h a n o l 不同浓度乙醇溶液的提取效果如图3 3 所示，乙醇浓度越高提取效果越好，这是因 为在气泡传质的过程中，提取溶剂借助气泡溃灭或收缩时产生的巨大能量，可以透过细 胞壁与提取的目标物充分接触，而虾青素不溶于水，当乙醇中含水后，虾青素在提取溶 剂中的溶解度降低，与虾青素脂肪粒接触时，无水乙醇可以最大限度的溶解虾青素，使 提取更充分，但是由于工业化生产的特殊要求，提取溶剂的浓度不宜过高，否则将会提 高成本，并且给下一步溶剂回收的再利用造成一定的难度。所以我们选择浓度为8 0 的 乙醇溶液作为提取溶剂，在保证提取效果的前提下，最大限度的降低了成本，符合工业 生产的要求。 提取时间对虾青素提取效果的影响 3 空化提取技术理论的提出与虾青素提取方案的确定 06 0 图3 4 提取时间对虾青索提取效果的影响 f i g 3 - 4e f f e c to fe x t r a c t i o nt i m e 由图3 4 可知，随着提取时间的增加，虾青素的提取率成上升趋势，在3 5 m i n 时上 升至最高，之后曲线成下降趋势。虽然空化现象可以产生巨大的能量，但是由于空化柱 内酵母细胞的数量也很大，想要使提取效果完全，就要使每一个细胞都受到气泡的冲 击，而且还要使每一个细胞内的虾青素都被抽提出来，这样，就需要一定的提取时间来 使气泡多次作用到每一个细胞。虾青素的不稳定性又决定了提取时间不宜过长，所以 在提取3 5 m i n 后提取溶液中虾青素的含量才会降低，由此确定负压空化法提取虾青素的 最佳时间为3 5 m i n 。 料液比对虾青素提取效果的影响 1 4 0 0 0 0 0 聚1 2 0 0 0 0 0 旧1 0 0 0 0 0 0 塞8 0 0 0 0 0 蕾6 0 0 0 0 0 畚4 0 0 0 0 0 粼2 0 0 0 0 0 0 蓁冀雾 1 ：1 01 ：2 01 ：3 0 料液比 图3 - 5 料液比对虾青素提取效果的影响 f i g 3 5e f f e c to fe x t r a c t i o nu s i n gd i f f e r e n tr a t i o so fm a t e r i a l 。a n dl i q u i d 本实验考察的料液比为物料与提取溶剂的体积比。由图3 5 可以看出料液比对虾青 素的提取有显著影响，料液比1 ：1 0 的提取效果最差，较料液比1 ：2 0 提取率低3 2 3 ， 分析原因为料液比过小，料液过分粘稠，空化的效果受到影响，造成了虾青素的提取不 完全；料液比1 ：2 0 与料液比1 ：3 0 的提取效果相当，但提取的料液比过大，溶剂使用量 过多，后期固液分离及溶剂回收负载过重，将会延长生产周期，加大成本。因此，选择 最佳料液比为1 ：2 0 。 通气量对虾青素提取效果的影响 0 o o o o o 0 0 0 0 0 0 o 0 o 0 o 0 o 0 0 o o o 5 0 5 0 5 0 7 7 6 6 5 5 娶旧磐擎督畚畿 东北林业大学硕士学位论文 1 2 0 0 0 0 0 港1 0 0 0 0 0 0 喾8 0 0 0 0 0 蟠 督6 0 0 0 0 0 萎4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 o 1o 1 50 20 2 50 3 通气量( m 3 h ) 图3 - 6 通气量对虾青素提取效果的影响 f i g 3 6e f f e c to fe x t r a c t i o nu s i n gd i f f e r e n tv e n t i l a t i o n s 通气量的选择要适中，不宜过大或过小，当通气量较低时，液相中气含率较小，气 泡数量产生较少，气液混旋效果较差，传质表面减少，影响液相与固相间的传质效率； 当通气量过大时，传质体系中含气量增加，但空化所需的临界压力减小，同时小气泡的 数量减少，空化效果较差，导致传质率降低。由图3 6 的结果可以知道，最佳通气量为 o 2m 3 h 。 3 3 1 4 小结 虾青素的小试提取的最佳工艺参数为： 提取溶剂为8 0 乙醇溶液 提取时间为3 5 m i n 料液比为1 ：2 0 通气量为0 2 0 m 3 h 3 3 2 负压空化法提取虾青素的中间试验 中试的物料投放量要大幅度增加，相应的提取溶剂的使用量也要增加，这样所需要 的空化提取装置也要相应放大。在中间试验中，空化柱的内径放大为3 0 c m ，所以，每 小时的通气量也要做出一定的调整后进行重新筛选。 3 3 2 1 实验仪器、材料和试剂 法夫酵母发酵液( 由浙江海正药业股份有限公司提供，经测定含水率为7 9 4 ) ， 自制空化装置( 如图3 7 ，内径为3 0 c m ) ，空气流量计( 上海) ，高效液相色谱仪 ( j a s c o ，1 5 8 0 泵，1 5 7 5 型紫外检测器，v e r s i o n6 1 色谱工作站) ，离心机( 宁波新芝科 器研究所) ，乙醇( 哈尔滨新春化工厂) 。 3 空化提取技术理论的提出与虾青素提取方案的确定 5 图3 7 中试空化装置 1 真空泵2 真空表3 放气阀4 空气流量计 5 空化柱体6 进料阀 f i g 3 - 7v a c u u mc a v i t a t i o n se q u i p m e n to fm i d d l ee x p e r i m e n t 3 3 2 2 提取的中间试验方法 量取法夫酵母鲜活物料1 l ，加入提取溶剂8 0 乙醇溶液，投入负压空化提取装置 中进行提取，通气量分别取1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 m 3 h ，提取时间为3 5 m i n ，重复提 取3 次，料液体积比1 ：2 0 ，收集提取液，测定方法同小试。 3 3 2 3 中试结果分析 1 1 0 0 0 0 0 娶1 0 0 0 0 0 0 孽9 0 0 0 0 0 曼8 0 0 0 0 0 蕾7 0 0 0 0 0 畚6 0 0 0 0 0 戳5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 l1 - 522 53 通气量( m 3 h ) 图3 8 中试工艺中通气量对提取效果的影响 f i g 3 - 8e f f e c to fe x t r a c t i o nu s i n gd i f f e r e n tv e n t i l a t i o n s 在通气量测定过程中，中试与小试工艺差别较大，在中试中所确定的最佳通气量为 2 m 3 l l 。分析主要原因是由于空化装置体积的变化引起的。小试中使用的玻璃空化装置 的体积较中试空化装置的体积小很多，其差别主要体现在横截面积上的不同，即直径上 的差别上。因此，相同条件下，横截面积越大，进气量需求越大。在进气量矫正实验 中，当通气量为2 m 3 h 时，提取效果与小试相当( 见图3 8 ) o 东北林业大学硕士学位论文 3 4 负压空化法提取虾青素与常用破壁提取方法的比较 法夫酵母是微生物细胞中最难破壁的酵母菌之一，目前国内外使用的破壁方法有酸 法破壁( 化学破壁法) 、碱法破壁( 化学破壁法) 、自溶法( 生物破壁法) 、超声法( 物 理破壁法) 。 3 4 1 实验仪器、材料与试剂 法夫酵母发酵液( 由浙江海正药业股份有限公司提供) ，水浴锅，离心机( 宁波新 芝科器研究所) ，自制空化柱( 如图3 1 ，内径为4 c m ，上端连接空气流量计和真空泵， 下端配有法兰控制空气进量) ，真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ，空气流量计( 上 海) ，高效液相色谱仪( j a s c o ，1 5 8 0 泵，1 5 7 5 型紫外检测器，v e r s i o n6 1 色谱工作 站) ，超声机，n a o h 溶液( p h 值为