（微生物学专业论文）重组组织型纤溶酶原激活剂变异体（reteplase）复性研究.pdf

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s e p h a i o s e 4 b 亲和层析柱，用来纯化r e m p l a s e 刺桐胰蛋白酶抑 制剂( e t i ) 是一种丝氦酸蛋白酶抑制剂类，而r e t e p l a s e 是精氨酸特征性的丝 氨酸蛋白酶，它能被e t i 作用点上的a r 9 6 3 识别并产生可逆性结合；据此可以 用e t i 作为亲和填料来纯化r e t e p l a s e 并与s e p h a r o s e4 b 偶联，制成 e t i s e p h a r o s e 4 b 亲和层析柱，得到很好的纯化效果，纯度在9 0 。 将r e t e p l a s e 基因亚克隆到p e t 3 2 a ( + ) 质粒载体上。将其转入到b l 2 1 ( d e 3 ) 中，实现了硫氧还蛋白t r x 与r e t e p l a s e 的融合表达，融合蛋白部分以可溶的形 式存在，用镍柱纯化后，可溶蛋白的浓度为0 2 m g m l ，但比活仅为1 0 0 0 i u m g 说明并非所有可溶蛋白都正确折叠，其原因在于硫氧还蛋白t r x 在细胞质中主要 以还原状态存在，不能提供足够的氧化还原力使r e t e p l a s e 正确拆叠 关键词：组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失变异体( r e t c p l a s e ) ，蛋白复性，包 涵体，二硫键异构酶( p d i ) 辅助蛋白复性，分子排阻色谱( s e c ) 辅助蛋白复 性，刺桐胰蛋白酶抑制剂( e t i ) 亲和层析硫氧还蛋白( t r x ) 山东大学磺士学位论文 r e f o d i n go fr e t e l ) i a s e a b s t r a e t c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s a r e t h e m a i n d i s e 鲤s w h i e h 廿旷i 鳅t ot h e i i v e s o f h u m a n a m o n gt h e na r ea l ：1 1 t er n y o e 可d i a li n f a r c t i o n p u l m o n a r ye m b o l i s m , b r ：, i n i n f a r c t i o n d e e pv 日1 0 惜t h r o m b o s i s , o u t e ra o r t i ci n f a r c t i o n a c c o r d i n gt oe s t i m a t eo f w h o ，a p p r o x i m 蕾e t y 。t w e l v e m i l l i o n p e o l j l e d i e o fe a c l o v a s c u l a r d i s e a s e s 劬y e a - i n t h e w o r l d t h e e f o r e , i t i s a n u r g e n tr e q u i r 鲫e n t f o r d e s i g na n d p r o d u o e s o m e k i n d s o fm e d i c i n e s t od 日a w a yt h r o r n t r e t e p l a s e 。o n eo ft h em o s te f f e c t i v em e d i c i n e sf o rc a r d i o v a s c u l a rd i s e e s e s ，h a s m a n ya d v m t a 瞒s u e ha se a s i l yp r o d u o e ，l o n gh a l fl i f e e f f e c t i v ef o r ( ：l e a - a w a y t h r o m b u s 1 i t t l e s i d e e f f e c ta n d d 已 t h eg e n eo fr e t e p l a 莹i ss u l x ：l o n e di n t ot h eo e t 2 2 b 百l dt h e 戡p r e s s i o nv e c t o r w a st r a r 塔f o r m e di n t o e o l ib l 2 1 ( t ) e 3 ) t h ep r o t e i n e k p r e s s e sa si n c l u s i o nb o d y ， w h i c hh a s 怕f e a t u r eo f h i g h 以p r e s s i o nl e v e l r 酋i s t i n gh y d r o l y z a t i o no fe n z y m e , 1 1 0t o x i c i t yt oh o s t i ft h ep r o t e i n 锄b ee a s i l yr e f o l d e d ，f o rc e r t i 3 i r l 。i n c l u s i o n b o d yi s a 年l p r o p n 如c r l o i c 皂 w e s t u d i e d t h e e x p r e 签i o n e o n d i u o n o f r d 喇巍a n dg o c 钔叫m i z e d c o n d i t i o n f o ri n e r e e e j n gt h e 以d 陀螽i 刨do fi n d 喇o nb o d y c u l t u r ei t i e ! d i t l m ：t r y p t o n e1 0 g t ，y e a s tr e e x t r a e tp o w d e r5o r e ，n a c i1 0g t t ，n 龟h p 0 口2 h 2 06g ，l 。k h 2 p 0 43 g ，l m g s 0 4 0 h 2 01g ，l ，g l u c o s e5g ，l ，p h ：7 2 ，3 71 2 o x y g e nd i s s o l v e w a sk e p t 1 0 0 a t t h e b e g i n n i n g3h o u ro f e u l t u r e a n d t h e f o l l o w i n gp r o c e s s w a s c o n t r o l l e d t o 4 0 * , 3 5 0 m l2 0 0g ，l r r y 6 t o n ew a sa d d e dc o n t i n u o u s l ya f t e r3 ho ff e r m e n t a t i o n w h e no d e o og e tt o2 0 ，l f r r gi sa d d e dt of i n a l m 皇1 妇廿8 叩m 。g l u 嘴 c o n c e n t r a t i o ni sk e p tu n d e r0 1g ，l 4 01 2 ，t h e nh a v e s tb a c t e r i aa f t e r4 hi n d u c e db y i f r r g u s n g t h i s p r o t o c o l ，w e t i a v e b e 3 1 a l ：_ e t 0 0 1 3 悟n3 9 ，l i n c l u s i o n b o d i e s i no r d e rt oe p l o r et h ee f f i c i e n tm e t h o d so fp r o t e i nr e f o l d i n gi nv i t r o , w e a t t e m p t e dt ou 赞i t l ef o l l o w i n gm e t h o d s 3 山东大学硕士学位论文 t r a d i t i o n a ld i l u t i o nr e f dd i n gw h i c hg s h ，g s s gw a su t i l i z e dt op r o m o t eb o t h f o r m a t i o n 钔dr e s l x j f f l i n go fd i s u l f i d eb o n d s 哥dl - a r g i n i n ew a sa d d e dt o r e f d d i n gb u f f e rt op r e v e n ta g g r e g i o n ； 。 r o t e i n d i s u l f i d e i m m e r 匀s e ( p d i ) w a s u s e c l t o c a t a l y z e p r o t e i nr e f o l d i n g r e v i s e ds i z ee x d u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ( s e c ) w a s 蚓e c t e dt o 笛西文r e t e p l a s e r e f d d i n g t h eo p u n i z e dr e r 瞳u r er a t e so ft h r e em e t h o d sa r e2 、1 3 2 0 1 0 、9 2 r e s p e c a v d y e r y t h r i n a 仃y 两ni n h i b i t o r ( e t i ) ，w h i c hb e l o n g st os e r i n ep r o t e i n a s e i n h i b i t o r ，h a s t h e a b i l i t y t o b i n d t or e t e p 4 a s e a n d f i n i t yc h r 饼嘲r a p h ，c o l u m n c o n j u g = e d e t it o c n b r - a c t i v a t e d s e p h a r o s e4 1 3 c a n p u r i f yr e t e p l a s e s u c c e s s f u l l y t h eg e n eo fr e t e p l a s ei ss u b d o r e di n t ot h ef e - r 3 2 a ( * ) a n de x p r e s s t o g e t h e rw i t h 椭o r e d o x i n s ( r r x ) i n e c d ib l 2 1 ( d f _ 3 ) p a r to ft h ep r o t e i ni s c d s s d v a b l et h ec o n c e w a t i o no fd i s s o l v a b l ep r o t e i ni s0 3 m g r n la f t e rp u n f i e db y n i - n t ah i s b i n dr e s i n s b u ti t 3 s p e c i f i ca c 6 v i t yo n l y1 0 0 0 1u m g w h i c hs h o w t h a ia l id i s s o l v a b l ep r o t e i ni 钔血r e n a t u r e d f i r s to fa 1 1 t h et h i d - d i s u l f i d er e d o x p o t e y d a lo ft h ec y t o p l a 目 ni st o ol o wt op r o v i d ea s u f f i d e n td r i v i n gf o r c ef o rt h e f o r m a t i o no fs t c 3 b l ea i s u l f i d e ss e c o n d u n d e rp h y d d o g i c dc o n d i t i o r 蛀t h e r ea r e n o e n z y m e s t h 蕾锄c a t a l y z e p r o t e i n t h i d o x i d a t i o n k e yw o r d ：r e t e p l m e ( r - p a ) p r o t e i nf d c i n g ( r e f o l c r n g ) ，i n c l u s i o nb o d y , h r a 【e n d i 刚f | d e i 晰a 鹭( p d i ) c a t a l y s t p r o t e i n f o l d i n g p r o t e i n f o l d i n g o n 百础d 吲 d l r o m 重o g r 币h y ( s e c ) 。e r la f f in i c h n o m 重o g r a i ) yt h i o r e d o x i n s ( t r x ) 4 山东大学硬士学位论文 论文缩写词表 a p ：扪p i d i n 氨苄青霉素 d a t p ：d e o x y a d e n o e n e t r i p h o s p h 蕾e 脱氧腺苷三磷酸 d c t p ： c l e o x y c y t i d i n e t r i p h o s p h a t e 脱氧胞苷三磷酸 d g t p d e o x y g u a n o s i n e t t i p h 稍p h a 塘脱氧鸟苷三磷酸 m p ：d e o x y t h y m i d i n e t r i p h p h a 【e 脱氧胸苷三磷酸 if r r g ： i s o p r o p y l - 1 州争9 倒a c t o e j d e异丙基硫代e - d - 半乳糖苷 d t t ：d i t h i g n r e i t o i 二硫苏糖醇 e d t a ：e t h y l e n e g l y c o l 麟s ( 9 - 宣佣酣叫d r 哪- n ，n ，n 州日t e t r a a c e t i c a c i d 乙二胺 四乙酸 s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s - p a g e - s o d i u m d o d e c y l 刚l f a t e - p o l y a c r y l a t l i d e g dd e c t r o p h o r e s i s s d s - - 聚丙 烯酰胺凝胶电泳 p c r ：p o i y m 目氍c h 目nr e a c 6 0 n 多聚酶链式反应 r t - f c r ： r e v e r s e b a - s 酬p 【i 0 1 1p o l y m e r a s e c h a nr e a c t i o n 反转录多聚酶链式反应 b s a ：b o v i n e s e r u m a l b u m i n 牛血清白蛋白 e b ：d h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 o d ：o p 石dd e r l s i t y 光密度值 d o ：d i s s o l v e do x y g 御溶氧 a g i t = a g i t a t i n gs p e e d 搅拌速度 a r g ：a r g i n i n e 精氨酸 c h o c e l l ：c h i n e s e h a l t e r o v m jc e l l 中国仓鼠卵细胞，c h o 细胞 c 悔c y s t e i n e 半胱氮酸 e r ：e n d o p l a s r n i cr e t i n u m 内质网 g s h ：r e d u c e dg i u t “o n e 还原型谷胱苷肽 g s s g ：o x i c u z e dg l u t 甜_ e 氧化型谷胱苷肽 l v l y s n e 赖氨酸 2 - m e ：2 m 叭删h 种12 - 巯基乙醇 p d i ：p r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e 蛋白质二硫键异构酶 r g ：r a s m i n o g e n 血纤维蛋白溶酶原 r m ：r a m 1 i n 血纤维蛋白溶酶 r e t e p l a s e ：t h er e c o m b i t r a i tt y p e o fn o v e lt i s s u ep i 钏i n 0 9 a c 6 v a t o r ( t - p a ) v a r i a n t 组织型纤溶酶原激活剂的重组变异体 r h p d i ：r e c o i t d n a n t h u m a n p r o t e i n d i s u l f i d e i m 重组人蛋白质二硫键异构酶 r p - h p l c ：r e v e - s e d - p h a s eh p l c 反向高效液相色谱 5 山东大学硕士学位论文 t - p a ：t i s s u ep l a m t n o g ma c 6 v a t o r 组织型纤溶酶原激活剂 c y s , c y s t e i n e 半胱氨酸 户e i g ：p o l y e t h y l e n e g l y c o l 聚乙二醇 g u h c i ：g u a t d i n e h y d r o c t _ o n d e盐酸胍 i e c ：i o ne x c h a n 9 e c h r o m a t o g r a p h y 离子交换色谱层析 i m a c ：i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 固定化金属离子亲和色谱层析 s e c ：s i z e e x l u s i o n 甘m 绷) g r 单时分子排阻色谱 t r x ：t h i o r e d o x i n s 硫氧环蛋白 6 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 i i 血栓病给人类健康构成极大的威胁 急性心肌梗死，脑梗死、肺梗塞、外周动脉血栓和深部静脉血栓等心脑血管 疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，全世界每年 大约有1 2 0 0 万人死于心脑血管疾病心血管类疾病给个人类的健康构成了严重 的威胁。血栓的形成多发生于心、脑血管，是一种死亡率极高的心血管疾病。因 此，研制和生产高效的溶解血栓药物，已成为临床的迫切要求 1 2 溶血栓药物韵种类 链激酶( s k ) 与随后开发的尿激酶( uk ) 被称为第一代溶栓药物。组织型纤溶 酶原激活剂( t - p a ) 、尿激酶原( p r o - u k ) 属第二代产品，这些药物经大规模临床 试验证明其疗效确切，已成为急性心肌梗死( a m i ) 常规疗法但是，第一、= 代溶栓药尚存在着溶栓特异性不高、半衰期短、易出血等缺点近年来，应用基 因工程和单抗等生物技术对t p a 等药物进行改造，开发出t p 的突变体以及 一些天然的溶栓酶成为第三代溶血栓药品，在对a m i 的治疗显示出比第二代溶血 栓药物更好的效果下表【1 2 司是一些溶血栓药物的比较 名称 结构组成半衰期再通率或活缺点 性 链激酶( s k )4 1 4 氨基酸，等 2 3 m i n 两小时血管与纤维蛋白 电点5 2通畅率为 的结合能力 6 6 6 低。具有免 疫原性 尿激酶( u k )南分子量 1 5 m i n 对心肌梗死可能含有有 3 3 0 0 0 瓤5 4 0 0 0 和深度静脉毒成分，溶 两部分组成血栓再通率肠壁细胞 6 0 7 山东大学硕士学位论文 组织型纤溶酶原激 5 2 7 个氨基酸 4 - - 6 m i n 急性心肌梗需要剂量 活剂( t p a ) 组成，有5 个死再通率为大。导致出 功能域 8 6 8 血 r e t e p l a s e 仅含t - p a 1 3 1 6 m i n心肌梗死再价格贵 k r i n g l e 一2 和 通率8 2 丝氨酸蛋白酶 域 m o n t e p l a s e t p a 突变体2 3 m i n6 0 m i n , l 、肌 梗死再开通 率达7 9 4 t e n e c t e p l a s e 和t p a 相2 0m i n 5 7 6 4 比，分子中3 个位点发生了 突变 l a n o t e p l a s e 是t - p a 缺失3 7 m i nt p a 无差异颅内出血率 和点突变体， 它去除了t p a 分子上 f i n g e r 和e g f 域，并修饰 k r i n g l e - 1 上 糖基位 k 1 k 2 p u 嵌合体t - p a 和尿激酶比t p a 和尿 构建而成激酶延长6 2 0 倍 8 山末大学硕士学位论文 葡激酶( s a k ) 1 3 6 个氨基酸 具有免疫原 的单链多肽， 性 无二硫键 尿激酶( p r o - u k )4 1 1 个氨基酸稍高的早 组成的糖蛋白期脑出血率 食血蝙蝠唾液纤溶 2 8h 具有潜在的 酶原激活剂( d s p aa刺激免疫反 1 ，b a t - p a )应的能力 蚓激酶( e p a 重组e p a 的 1 u m b r o k i n a s e ) 比活在2 0 0 0 30 0 0 i u im g 纳豆激酶2 5 0 多个氨基 n k l 2 0 0 0i u 6 2 0 ( n a t t o k i n a s e 。n k )酸残基组成的 m g 一条单链多肽 i 3r e t e p l a s e 组织型纤溶酶原激活剂变异体结构 1 9 4 7 年，a s t r u p 等首次在组织碎片中发现t p a ，在生理情况下，t - p 由血 管内皮细胞经单链形式合成并释放，存在于机体多种组织和体液中肺、肾，前 列腺等组织t p 含量较高肝、脾、平滑肌和骨骼肌含量较低。t - p a 基因位于第 8 q 染色体上，天然的t - p a 由5 6 2 个氨基酸残基组成，它在胞内切除氨基酸的信号 肽及前肽，分泌进血液转变成为成熟的t 上p a 分子，成熟的t p a 由5 2 7 个氨基酸组成， 为分子量为6 7 0 0 0 的丝氨酸蛋白酶它具有3 个糖基化位点、1 7 对二硫键，等电点 在7 8 - 8 6 之问t - p a 分子主要由5 个功能域组成，n 端重链( h ) 指型区( f ) ： s e r l - s e r 5 5 ，含纤维蛋白结合位点；生长因子区( e ) ：c y s 5 6 - a s e 8 7 含肝细胞膜受 体结合位点：k r i n g l e 区k ：t h r 8 8 - g l y l 7 6 含1 1 7 糖基化位点： k z 区：a s n 1 7 7 - a r g2 7 5 含1 8 4 糖基化位点和纤维蛋白结合位点：c 端轻链l ：i l e 2 7 6 - p r o5 2 7 9 山末大学硕士学位论文 含4 4 8 糖基化位点、活性中心、p a i 结合位点：介导t p a 与纤维蛋白结合的区域 是f 区和k 2 ，f 区和区的功能是与纤维蛋白结合，但结合部位不同，k 。区的结合 部位是纤维蛋白裸露的羧基端l y s ，l y s 的类似物e a c a 能完全抑制这一结合，而对 f 区介导的与纤维蛋白的结合没有影响。 r e t e p l a s e 是t 呻a 的重组突变体( f i g 1 ) ，在t - p a 分子原结构的基础上删 除了其中的k r i n g l ei 、f i n g e r 、e g f - - 个结构域，只保留了t 呻a 分子中的k r i n g l e i i 及蛋白酶两个功能区：1 7 6 - 5 2 7 氨基酸及n 端的1 3 个氨基酸，为单链非糖基化 蛋白，由3 5 5 个氨基酸组成，分子量为3 9k d l 4 一。蛋白酶功能区可以激活纤溶酶 原成为纤溶酶，后者具有生物学活性，可以清除纤维蛋白。k r i n g l ei i 则与提高 纤溶酶原向纤溶酶转变的活性有关，上述两个功能区具有较好的溶栓作用。被切 除的f i b r o n e c t i nf i n g e rd o m a i n 与血浆纤维蛋白的高亲和性有关，会导致在血 栓表面聚集更高浓度的什a 使溶栓过程从血凝块外到内进行，溶血栓时间延长 r e t e p l a s e 不含该功能域，与血浆纤维蛋白的亲和力降低。与血凝块表面的结合 是可逆的旧；表皮生长因子域可以在肝脏内加速清除率，糖基化部分则与血浆清 除的调节有关，不同种类的糖基化部分执行的任务不一样 竹 山东大学硕士学位论文 图卜1t - p a ( 上) 和r e t e p l a s e ( 下) 的结构 f i g 卜ls t r u c t u r eo ft p a ( t o p ) a n dr e t e p l a s e ( b o t t o m ) f2f i n g e rd o m a i n ：e = e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rd o m a i n ；k l = k r i n g l e - 1 ： l 【z = k r i n g l e - 2 ：p = p r o t e a s ed o m a i n l 7 1 1 4r e t e p l a s e 研究进展 国内赵友春等人阍从人脑c d n a 文库中经p c r 扩增得到组织型纤溶酶原激活 剂重组变异体( r e t e p l a s e ，简称r - p a ，中文名称：瑞替普酶) 的c d n a ，经测序确 证，克隆于表达载体p e t 2 2 b ，转化大肠肝菌b l 2 1 进行重组表达表达的r - p a 占菌体总蛋白的4 0 ，以包涵体形式存在黄坚嘲将r e t e p l a s e 基因转入到毕赤 酵母细胞中，r e t e p l a s e 以包涵体的形式表达邓长江等人1 1 q 构建r p a 分泌表 达型毕赤酵母重组菌株，经s d s - p a g e ，w e s t e r nb l o t 鉴定及生物学活性检测证 实在重组菌株中实现了r _ p a 分泌活性表达表达产物分子量为3 9k u ，与相关 报道的一致通过正交试验，优化发酵条件。表达活性最高为1 0 5 0i u 舶l 孙石 静f 1 1 l 最终成功构建了能在海带中表达r p 的真核表达载体，用基因枪法转入海 1 1 山东大学硕士学位论文 带中表达，f a p a 法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带为后续研究工作打下 坚实的基础。2 0 0 2 年。国家药品质量监督管理局批准山东元隆生物技术有限公 司( 注射用瑞替普酶) 、江苏苏中制药厂( 注射用瑞替普酶) 、爱德生物技术发展 ( 中国) 有限公司( 注射用重组人组织型纤溶酶原激活剂) 、苏州中凯生物药业 有限公司( 注射用重组人组织型纤溶酶原激活剂) 等4 家企业的国家二类新药二 期临床实验i 馏 德国宝灵曼( b o e h r i n g e rm a n n h e i m5 m b h p e n z b e r g ，f r g e r m a n y ) 公司 研制成功并于1 9 9 6 年被美国f d a 批准上市【1 3 , 14 】通过大肠杆菌表达系统获得 r e t e p l a s e ，表达产物含3 5 5 个氨基酸的非糖基化单链分子，分子量约3 9k d 。含 9 对二硫键，表达产物为没有活性的包涵体，采用稀释复性的方法对包涵体进行 复性，复性率不高于5 在真核中表达的r e t e p l a s e 大多以有活性的形式存在，但是由于其表达低， 容易被糖基化，阻止了r e t e p l a s e 的应用。r e t e p l a s e 在大肠杆菌中得到高效表 达。表达产物为包涵体通过体外复性恢复其生物学功能。 r e t e p l a s e 含有9 对二硫键，在复性过程中很容易错配，因此体外复性率很低有效的复性方法是 解决r e t e p l a s e 应用中瓶颈问题 1 4 包涵体蛋白复性研究进展 1 4 1 包涵体的形成机制研究 目前的研究认为，包涵体的形成有如下原因1 嘲：( 1 ) 表达的蛋白过多过 快，没有足够的时间和空间折叠形成正确结构( 2 ) 折叠的过程中疏水基团的暴 露而形成聚集( 3 ) 细胞质中没有足够的氧化性使蛋白形成正确的二硫键( 4 ) 培 养温度、p h 值、某些金属离子等因素影响包涵体动力学的稳定( 5 ) 原核系统缺 乏真核系统对真核生物蛋白的加工和修饰功能。 1 4 2 包涵体的洗涤溶解 超声碎菌处理后离心得到不溶性的包涵体，为除去其中的杂质核。常用的 洗涤剂为t r i t o n x - 1 0 0 、e d t a 经过常规2 3 次优化条件的洗涤。可得到相对纯度 较高的包涵体包涵体通常需要加入强变性剂才能溶解，常用的变性剂为尿素和 盐酸胍。过高浓度的变性剂会使蛋白完全变性，严重破坏其二级结构无法恢复活 1 2 山东大学硕士学位论文 性，通常尿素浓度为6 8 1 几。盐酸胍浓度为4 6 1 l 。此外还可使用去污剂， 如s d s ( - t - 二烷基硫酸钠) 、c t a c ( 十六烷基三甲基氯化铵) ，c a p s ( n 二烷基肌 氨酸) 以及极端p h ( 2 - 4 ) 酸性缓冲液不同的重组蛋白需要的变性剂，要在试验 中摸索。 1 4 3 蛋白质的折叠机理 使形成包涵体的蛋白折叠恢复天然构象及活性的过程称为复性。变性剂溶解 的包涵体在折叠成天然构象蛋白的过程中，首先要形成中间体，中间体可能有两 种走向：聚集体或天然构象蛋白。聚集反应是二级或更高级的反应，而正确折叠 是一级反应。根据k i 百h a b 芎等旧正确折叠和聚集的动力学竞争用一个简单模型来 描述( 图1 - 2 ) 毛心 u isn l 心 岛 a f i g l - 2 折叠和聚集的动力模型 f i g u r e1 - 2 k i n e t i cm o d e lo fr e f o l d i n ga n da g g r e g a t i o n u ( u n f o l d i n g ) 完全变性态；i ( i n t e r r n e d i a t e s ) 折叠中间态；a ( a g g r e g 叠i o n s ) 聚 集态；n ( n a t i v e ) 天然结构态 形成中间体( i ) 从完全变性( u ) 和天然结构( n ) 可以描述为一级动力学 反应( 萨1 ) 形成聚集态( a ) 被认为是高级反应( n 差2 ) 实际操作中复性条件 ( 如变性剂的浓度) 应该调整使平衡倾向天然结构态( k 2 k 4 ) 中间体的形 成可以假设为瞬间的k 1 可以忽略在k 4 * o 时，建立了一级和二级或高级反应的 竞争变性蛋白浓度随时间变化可由方程( 1 ) 等= 一( k 2 u + k 3 u i | )( 1 ) 天然蛋白的浓度变化： 百d n = k l u( 2 ) 山东大学硕士学位论文 k 2 是折叠反应系数k 3 是聚集反应系数。u 是变性蛋白的浓度，n 是天然蛋 白的浓度。n 是反应级数这个微分等式中的u o 必须知道。方程( 1 ) 在反应级 数n = 2 时可以解析为 y m = 矗t n 【l + 訾c h 卅咄，) y 是复性反应的产率在时间无限延长的最终蛋白产率可以表示为 y = 盎- n ( 十韵 ， 由( 4 ) 可以看出，在蛋白浓度越低，正确折叠的几率就越高，蛋白质在复性过 程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水作用，二是部分折叠的肽链分子问的 疏水作用前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞 争影响蛋白质复性效瓠因此，在复性过程中。抑制肽链间的疏水相互作用以防 止聚集是提高复性效率的关键。 1 4 4 - - 硫键在蛋白质正确折叠中的作用州 二硫键对于蛋白最终结构的稳定有至关重要的作用，错误配对的c y s 残基 ( c y s ) 常常阻碍蛋白折叠成为天然构象c r e i g h t o n 1 争笠】实验室经过2 0 年的研 究提出了b p t i ( 牛胰蛋白酶抑制剂) 的折叠途径。 r u j 咄一硼i 醴阡一l b 如i d 出n - h _ - 坤 图i - 3b p t i 的形成二硫键过程示意图 f i g u r e 卜3t h ed i s u l f i d eb o n df o r m a t i o np r o c e s so fb p t i b p t i 有三对二硫键：c 5 c 5 5 c 1 4 - c 3 8 ，c 3 0 - c 5 1 交性，还原的分子经过折 叠首先形成具有一对二硫键的分子群，有1 5 种异构体。其中( 3 0 - 5 1 ) 和( 5 5 5 ) 稳定，故能积累经过进一步的氧化，形成4 种含两对二硫键的折叠中间体其 中两种各有一对非天然二硫键( c 5 - c 1 4 或c 5 - c 3 8 ) 。具有部分折叠的构象：部分 肽链折叠成类天然构象，而另一部分处于去折叠状态具有柔性，这种构象有利于 山东大学焉士学位论文 巯基p 二硫键交换反应，通过链内二硫键重排形成( 3 0 - 5 1 ，5 5 5 ) ( 3 0 - 5 1 ，5 - 5 5 ) 具有类天然构象，巯基c 1 4 与c 3 8 处于分子表面彼此靠近，容易氧化形成第3 对 二硫键完成氧化重折叠。另外两种折叠中间体( 3 0 - 5 1 1 4 - 3 8 ) 。( 5 5 5 ，1 4 - - 3 8 ) 含两对天然二硫键具有准天然构象( q u a s i - n a t i v ec o n f o r m a t i o n ) ，其特 征是整体结构极似天然构象，只是在缺少最后一对二硫键的局部区域有所不同， 这种构象过于稳定，缺乏柔性，进一步氧化与折叠需越过很大的能垒，严格地说它 们都属于无效的折叠中问体( u n p r o d u c t i y ei n t e r m e d i a t e ) ( 3 0 - 5 1 ，1 4 - 3 8 ) 只 有经过二硫键重排转变为上述含非天然二硫键的异构体，才能再进入有效的折叠 途径：而( 5 5 5 ，1 4 3 8 ) 除有能垒障碍外，巯基c 3 0 与c 5 1 内埋，难以氧化是一种 无出路的中间体( d e a d e n di n t e r m e d i a t e ) 由此可见，b p ? i 沿着一条单一的、 特异的途径进行折叠。 b p t i 的折叠途径说明，任何一种蛋白质在其氧化重折叠的初期都是通过多途 径形成不同的异构体，随着进一步折叠结构越来越稳定。异构体的数目逐步收敛， 只保留为数不多的中间体，再通过有效的折叠中间体最终转变为独一无二、能量 最低、具有天然构象的功能蛋白。还原、伸展的肽链在折叠的早期二硫键的形成 基本上是一个随机的过程( 只是在一级结构中距离较近【捌，或邻近有碱性氨基酸 【刎的两个巯基更容易，随着多肽折叠的进一步进行，二硫键的形成越来越受空 间构象的限制，只有具有了一定的多肽构象才能使巯基相互靠拢形成正确的二硫 键，当一定数目天然二硫键形成后才会出现有序的类天然构象，天然二硫键不仅 能稳定这种有序结构，而且还有引导进一步氧化与折叠的作用。总之，正是氧化与 折叠的协同作用才使还原、伸展的肽链迅速转交为功能蛋白 i 4 5 蛋白质复性方法 1 4 5 ：l 稀释复性 稀释复性是工艺较简单的复性方法，其过程是将高浓度的变性蛋白稀释到很 多倍的折叠缓冲液中。当蛋白质复性起一般可获得较高的复性率稀释方法有一 步稀释、分步稀释和脉冲稀释：稀释复性的缺点是很大的缓冲液体积，给后继的 蛋白的浓缩造成了很大的困难 1 4 5 2 透析复性 山东大学瑷士学位论文 将变性蛋白装入透析袋中，对复性缓冲液进行透析透析袋中蛋白浓度逐 渐降低的过程中，蛋白开始恢复天然构象采用缓慢透析或分步透析即对含变性 和的复性缓冲液透析。并使复性缓冲液中变性剂浓度逐渐降低必要时添加抑制 聚集产生的物质，可以提高复性率和复性蛋白浓度闲 1 4 5 3 色谱复性。蚓 虽然s e c 的复性机理还没有完全研究清楚，但是b a t a s 等提出了一个初步 的解释。当变性蛋白进入柱顶端时。因变性蛋白具有无规则卷曲的结构，其s t o k e s 半径大只能进入凝胶颗粒间的空隙，而不能进入凝胶颗粒内部的孔，迁移速度 快。交性剂由于分子量小。可进入凝胶颗粒内部的小孔，迁移速度慢。因此当变性 蛋白通过色谱柱时。变性剂浓度不断减小最后和s e c 流动相达到平衡变性剂浓 度的降低促使蛋白开始折叠，多肽链折叠成紧密的类似天然的结构。分子的 s t o k e s 半径减小，可以进入凝胶颗粒的孔中，移动速度较慢。随着复性的进行 蛋白质的结构变得更加紧密。蛋白质在流动相和凝胶之间的分配系数逐渐增大