（微生物学专业论文）利用酵母细胞生物转化法合成天然2苯乙醇的研究.pdf

浙江大学博士学位论文摘要 摘要 2 苯乙醇是一种具玫瑰气味的芳香醇，作为香料广泛用于食品、日化和轻工等 领域。人们对天然香料消费需求的日益增长，推动了利用生物技术方法生产天然2 苯乙醇的研究。以发酵法或酶法生产的l 苯丙氨酸为前体，利用酵母细胞将其转化 为2 苯乙醇，产品具有天然属性，可以取代从玫瑰或其它植物精油中提取的天然2 苯乙醇，具有广阔的开发前景。本文以提高2 苯乙醇转化浓度和生产率为目标，从 上、中、下游系统地研究了2 苯乙醇转化合成工艺，大幅度提高了2 苯乙醇的转化 浓度和生产率，为生物转化法合成天然2 苯乙醇的工业化应用奠定了良好的基础。 从1 5 个酵母菌株中，筛选出1 株对2 苯乙醇耐受性强、转化合成2 苯乙醇浓 度高的酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) b d 菌株，对其进行纯化并结合紫外诱 变，得到酿酒酵母b d l 8 菌株，在未经优化的培养基中，该菌株转化合成2 苯乙醇 浓度达到2 0 4g l ，是1 株适用于2 苯乙醇的生物转化合成的理想菌种。 采用单因素试验和正交试验，优化了转化合成2 苯乙醇的培养基组成、种子培 养基组成和转化培养条件，使得2 苯乙醇浓度有大幅度提高。摇瓶转化合成2 苯乙 醇的最佳工艺是：种子培养基组成为葡萄糖4 0g l 、蛋白胨2 0g l 、酵母浸出粉1 0 g l ，装量为4 0m l 2 5 0 m l 三角瓶；转化培养基组成为蔗糖1 2 0g l 、酵母浸出粉5 g l 、k h 2 p 0 47 5g l 、k 2 h p 0 49 6g l 、m g s 0 4 7 h 2 0o 5g l ，装量为3 0m l 2 5 0 m l 三角瓶；种子培养基接种后于3 0 。c 培养2 4h ，按1 0 的接种量移种至转化培养基， 再加入1 0g l 的l 苯丙氨酸；转化体系于3 0 。c 、2 0 0r m i n 条件下培养1 8h ，2 苯 乙醇的浓度可达到4 6 4g l ，摩尔产率为6 2 7 ，生产率为0 2 6g ( l h ) 。 采用b o x b e h n k e n 中心组合设计和响应面分析，建立了2 苯乙醇浓度与蔗糖、 酵母浸出粉和l 苯丙氨酸之间的二次多项式回9 j 模型，模型具有较高的准确性和实 用性，可为生物转化法合成2 苯乙醇的最优化生产提供理论基础。 采用油酸萃取，聚丙二醇2 0 0 0 萃取和d 1 0 1 大孔树脂吸附3 种产物原位分离 法转化合成2 一苯乙醇，2 苯乙醇的摩尔产率均有所提高。在油酸与培养基体积比为 1 ：3 ，振荡转速为2 5 0r r a i n ，转化温度为3 0 c ，底物浓度为1 4g l 的条件下，转化 培养1 8h ，油酸和水相中2 苯乙醇的浓度分别达到1 4 9g l 和1 7 4g l ，2 苯乙醇 的摩尔产率达到6 4 7 ，生产率达到0 3 7g ( l h ) ，较单一水相体系生物转化合成2 苯乙醇的生产率0 2 6 ( l h ) 提高了4 4 3 。以聚丙二醇2 0 0 0 为萃取溶剂，加入体 浙江大学博士学位论文 摘要 积- 9 培养基体积比为1 ：2 ，底物浓度为1 2g l 时，转化1 8h ，聚丙二醇中的2 苯乙 醇浓度可达1 1 1g l ，摩尔产率为6 8 1 ，生产率为0 3 1g ( l h ) 。在3 0m l 培养基 中加入2g 湿大孔树脂d 1 0 1 ，底物浓度为1 2g l ，转化2 4h ，2 一苯乙醇总浓度可达 6 1 7g l ，其中3 1 5g l 保留在培养基中，3 0 2g l 吸附到d 1 0 1 中，摩尔产率达到 6 9 5 ，生产率为0 2 6g ( l h ) 。 在5l 发酵罐中，进行常规水相体系、有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法转化 合成2 苯乙醇的放大实验，取得的结果与摇瓶工艺相近，表明摇瓶转化工艺放大较 为容易。基于5l 发酵罐生物转化合成2 。苯乙醇得到的菌体得率、2 苯乙醇浓度、 蔗糖消耗实验数据，建立了转化过程中菌体生长的l o g i s t i c 模型、2 苯乙醇生成的 l u e d e k i n g - p i r e t 模型和蔗糖消耗的l u e d e k i n g p i r e t 相似模型。3 个动力学模型具有 较高的拟合精度，能准确反映2 苯乙醇生物转化过程及其动力学特征，可用于酿酒 酵母转化生产2 苯乙醇过程的预测。 通过对多种有机溶剂的筛选，得出乙酸乙酯是萃取分离2 一苯乙醇的最佳溶剂， 其萃取的最佳相比o 5 ，萃取液经减压蒸馏除去乙酸乙酯，便得到提纯的2 苯乙醇， 收率为9 3 6 ，纯度可以达到9 0 7 。静态吸附实验结果表明大孔树脂d 1 0 1 也是 很好的2 。苯乙醇分离吸附剂。采用大孔树脂d 1 0 1 柱分离2 苯乙醇中，当转化液中 2 苯乙醇浓度为4 5g l 左右时，最佳上样量为5 5 柱体积( b v ) ，上样速度1 0b v l a 。 样品上柱后，用上样量同等体积的蒸馏水洗涤树脂，再用3b v 的9 5 乙醇进行洗 脱，收集洗脱液，减压蒸馏去除乙醇，此工艺条件下分离得到的2 苯乙醇样品收率 为8 4 4 ，纯度为8 5 2 。 关键词：2 苯乙醇；生物转化；酿酒酵母；原位产物分离；动力学模型；分离纯化 i i 浙江大学博士学位论文 摘要 a b s t r a c t 2 - p h e n y l e t h a n o li sah i g h e ra r o m a t i ca l c o h o l 晰t l lar o s e l i k eo d o r ，a n dt a k e so n e x t e n s i v ea p p l i c a t i o n si nf o o d ，d a i l yc h e m i c a la n dl i g h ti n d u s t r i e sa sf l a v o r so rf r a g r a n c e s t h ew o r l d w i d ed e m a n df o rn a t u r a lp r o d u c t si m p e l st h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to n p r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o lb yb i o t e c h n o l o g y t h em o s te f f i c i e n tb i o t e c h n o l o g i c a l a p p r o a c hu s e dt oo b t a i nn a t u r a l2 - p h e n y l e t h a n o li st h eb i o c o n v e r s i o no fl - p h e n y l a l a n i n e t o2 - p h e n y l e t h a n o lb yy e a s tc e l l s s i n c et h ep r e c u r s o rl - p h e n y l a l a n i n ei sn o w p r o d u c e d r n i c r o b i o l o g i c a l l y ，2 - p h e n y l e t h a n o lp r o d u c e di n t h i sw a yc a nu n d o u b t e d l yb el a b e l e d n a t u r a l ”，a n di ti sc o n s i d e r e dt ob et h eb e s ts u b s t i t u t ef o rt h ep r o d u c te x t r a c t e df r o m e s s e n t i a lo i l so fr o s e so ro t h e rp l a n t s t h ef u t u r ef o rd e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no ft h i s t e c h n o l o g yi st h e r e f o r eb r i g h t a i m e da ti m p r o v i n gt h ec o n c e n t r a t i o na n dp r o d u c t i v i t yo f 2 - p h e n y l e t h a n o l ，t h e t h e s i s c o m p r e h e n s i v e l ys t u d i e dt h e b i o c o n v e r s i o n p r o c e s so f 2 - p h e n y l e t h a n o lf r o ml p h e n y l a l a n i n eb yy e a s tc e i l s s o m er e m a r k a b l er e s u l t sw e r e o b t a i n e df i n a l l y ，i nw h i c ht h e2 - p h e n y l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n dp r o d u c t i v i t yw e r e i m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y ，a n dp r o v i d e d a na v a i l a b l ef o u n d a t i o nf o r t h ei n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n a2 - p h e n y l e t h a n o l t o l e r a n ts t r a i n ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eb d ，c a p a b l eo f p r o d u c i n gh i g hc o n c e n t r a t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o lf r o ml - p h e n y l a l a n i n e ，w a ss c r e e n e d o u tf r o mf i f t e e ny e a s ts t r a i n sc o l l e c t e d a f t e rs e p a r a t i o na n du l t r a v i o l e tr a d i a t i o no ft h e s t r a i nb d ，b d18w a ss e l e c t e da sad e s i r a b l es t r a i nf o r2 - p h e n y l e t h a n o lp r o d u c t i o nw i t h t h e2 - p h e n y l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o no f2 0 4g li ni n i t i a lm e d i u m t h ee x p e r i m e n t so fs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g nw e r ec a r r i e do u tt oo p t i m i z e t h ec o m p o s i t i o n so fb i o c o n v e r s i o na n ds e e dm e d i u m ，a sw e l la sc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o r 2 - p h e n y l e t h a n o lp r o d u c t i o n t h eb e s to p e r a t i o n sp r o c e s sw a sa sf o l l o w i n g ：t h es t r a i n m a i n t a i n e di ns l a n tm e d i u mw a si n o c u l a t e di n t o4 0m lo fp r e c u l t u r i n gm e d i u m c o n t a i n i n g4 0g lg l u c o s e ，2 0g lp e p t o n ea n d10g 几y e a s te x t r a c t ，a n di n c u b a t e da t 3 0 ca n d2 0 0r p mf o r2 4h t h e na3m lc e l ls u s p e n s i o nw a st r a n s f e r r e dt o2 5 0m l e r l e n m e y e rf l a s k sc o n t a i n i n g3 0m l o fb i o t r a n s f o r m a t i o nm e d i u mc o n s i s t i n go f12 0g l s u c r o s e ，5g ly e a s te x t r a c t ，7 5g e lk h 2 p 0 4 ，9 6g lk 2 h p 0 4a n d0 5g lm g s 0 4 7 h 2 0 i i i 浙江大学博士学位论文摘要 a f t e ri n o c u l a t i o n ，10g ll p h e n y l a l a n i n e ，w i t h o u tp r i o rs t e r i l i z a t i o n ，w e r ea d d e dt ot h e b i o c o n v e r s i o nm e d i u ma n di n c u b a t e da t3 0 。ca n d2 0 0r p m t h i sp r o c e s sr e s u l t e di na i m p r o v e m e n to f2 - p h e n y l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，u pt o4 6 4g lw i t ham o l a ry i e l do f 6 2 7 a n dp r o d u c t i v i t yo f0 2 6g ( l h ) am o d e lo fp o l y n o m i a l r e g r e s s i v ee q u a t i o nb e t w e e nt h e2 - p h e n y l e t h a n o l c o n c e n t r a t i o na n ds u c r o s e ，y e a s te x t r a c ta n dl p h e n y l a l a n i n ei nt h em e d i u mw a s e s t a b l i s h e da f t e rt h eb o x - b e h n k e nc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g na n dt h er e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i sw e r ep u ti n t op r a c t i c e t h em o d e le x h i b i t e df i n ee x a c t i t u d ea n dp r o v i d e da p r e d i c t i v em o d e lf o ro p t i m i z i n gt h em e d i u mi nt h ep r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o lb y b i o c o n v e r s i o n ns i t up r o d u c tr e c o v e r yt e c h n i q u e sw e r ea p p l i e dt op r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o l b yb i o c o n v e r s i o n ，w h i c hw a sp e r f o r m e di na q u e o u s o r g a n i cs o l v e n ta n da q u e o u s s o l i d a b s o r b e n tt w o - p h a s es y s t e mr e s p e c t i v e l y t h es e l e c t i o no fo r g a n i cs o l v e n t sa n d a b s o r b e n t sf a v o r a b l ef o re s t a b l i s h i n g t w o p h a s es y s t e mw a sc o n d u c t e d ，a n dt h e b i o c o n v e r s i o nc o n d i t i o n si nt w o p h a s es y s t e mf o rp r o d u c t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o lw e r e i n v e s t i g a t e dt o o w h e no l e i ca c i d 研t l l1 3v o l u m eo fm e d i u mw a sa d d e di n t om e d i u m ， a n ds h a k i n gs p e e d ，t e m p e r a t u r ea n dc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ew e r es e ta t2 5 0r m i n , 3 0 ，1 4g lr e s p e c t i v e l y ，t h e2 - p h e n y l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o nc o u l dr e a c h1 4 9g la n d 1 7 4g li no l e i ca c i dp h a s ea n da q u e o u sp h a s er e s p e c t i v e l ya f t e r18hc u l t i v a t i o n , 谢t l la m o l a ry i e l do f6 4 7 t h ep r o d u c t i v i t yo f2 - p h e n y l e t h a n o la c h i e v e da t0 3 7 ( l h ) w h e np o l y p r o p y l e n eg l y c o l2 0 0 0w i t h1 2v o l u m eo fm e d i u mw a sa d d e di n t om e d i u m ， t h ec o n c e n g a t i o no fs u b s t r a t ew e r es e ta t12g l ，t h e2 - 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p h e n y l e t h a n 0 1 t h ek i n e t i cm o d e l sf o rc e l l g r o w t h ，2 - p h e n y l e t h a n o lp r o d u c t i o na n ds u c r o s e c o n s u m p t i o no fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew e r ee s t a b l i s h e db a s e do nt h ed a t ao f b i o c o n v e r s i o np r o c e s si n5lb i o r e a c t o r t h r e ek i n e t i cm o d e l sw e r ep r o p o s e db yt h e l o g i s t i ce q u a t i o nf o rt h ec e l lg r o w t h ，t h el u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o nf o r2 - p h e n y l e t h a n o l p r o d u c t i o na n dt h el u e d e k i n g - p i r e t - l i k ee q u a t i o nf o rs u c r o s ec o n s u m p t i o nr e s p e c t i v e l y t 1 1 em o d e l se x h i b i t i n gh i 曲p r e c i s i o nf o rs i m u l a t i o nc o u l de x a c t l yd e s c r i b ea n dp r e d i c t 2 - p h e n y l e t h a n o lp r o d u c t i o nb yb i o t r a n s f o r m a t i o ni np r a c t i c e t h es e l e c t i o no f o r g a n i c s o l v e n tf a v o r a b l ef o re x t r a c t i o n s e p a r a t i o n o f 2 - p h e n y l e t h a n o lw a sp e r f o r m e d ，a n di tw a sf o u n dt h a ta c e t i ce t h e ri st h eb e s te x t r a c tf o r 2 - p h e n y l e t h a n o ls e p a r a t i o nf r o mb i o c o n v e r s i o nl i q u i d i ne x t r a c t i n gs e p a r a t i o n ，i fp h a s e r a t i oo fa c e t i ce t h e rt ob i o c o n v e r s i o nl i q u i dw a ss e ta t0 5 ，t h er e c o v e r ya n dp u r i t yo f 2 - p h e n y l e t h a n o lc o u l dr e a c h9 3 6 a n d9 0 7 r e s p e c t i v e l y t h r o u g hs t a t i ca d s o r p t i o n e x p e r i m e n t s ，t h em a c r o p o r o u sr e s i nd 101w a sa l s of o u n dt ob et h eb e s ta b s o r b e n tf o r 2 - p h e n y l e t h a n o ls e p a r a t i o n i fs e p a r a t i o nw a sc o n d u c t e do nc o l u m np a c k e dw i t hd 101 t h eo p t i m a ll o a d i n gv o l u m ew a s5 5b v ( b e dv o l u m e ) ，a n dt h ef l o wr a t ew a s10b v h w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f2 - p h e n y l e t h a n o li nb i o c o n v e r s i o nl i q u i dw a sa b o u t4 5 g l a f t e rs a m p l el o a d i n g ，d101w a sf i r s t l yl e a c h e db yd i s t i l l e dw a t e rw i t l lt h es a m ev o l u m e o fl o a d e ds a m p l e ，a n dt h e ne l u t e db y9 5 e t h a n o l 晰t h3b v b yt h i sp r o c e s s ，t h e p r o d u c t 谢t 1 1r e c o v e r yo f8 4 4 a n dp u r i t yo f8 5 2 w a so b t a i n e da f t e rt h ee t h a n o lw a s e v a p o r a t e d k e yw o r d s ：2 - p h e n y l e t h a n o l ；b i o c o n v e r s i o n ；s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；i ns t up r o d u c t r e c o v e r y ；k i n e t i cm o d e l ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位敝储魏轴孔签字吼叫年朋1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿苤堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 抽玉乱 辩聃：川引1 月枷 辩 致谢 首先要深深感谢我的导师阂航教授，论文是在您悉心的指导下得以完成，凝聚 了您大量的心血。在学 - j 和工作中，导师严谨的治学态度、豁达的胸怀以及乐观的 人生态度，无不时刻感染着我，并将成为终身受益的宝贵财富。值此论文完成之际， 谨向导师表示最诚挚的感谢和最崇高的敬意，也祝愿导师身体健康、万事如意! 感谢微生物学实验室的吕镇梅副教授，以及实验室里的余海霞、邵铁娟、姚燕 来、袁海平、刘击、丁霞、李子木、应燕玲、李钠、宣瑛等已经毕业的博士和硕士 们。在这个充满友爱的大家庭里，让我真正感受重返学生时代，每次与你们交流， 总可以学到很多东西，论文的完成也得到了你们的帮助，在此祝你们事业有成、大 展鹏图! 感谢我工作所在的实验室浙江工业大学药学院生化药物实验室的应国清教 授、王鸿副教授、陈建澍和易喻老师，论文的顺利完成离不开他们大力支持和帮助， 衷心祝愿我们的实验室未来发展欣欣向荣，蒸蒸日上! 感谢浙江树人大学生物与环境工程学院陈蔚青副教授给予发酵罐等仪器方面的 支持，也感谢在实验研究中给予帮助的同事和朋友们，祝你们事事顺利，家庭幸福! 感谢浙江工业大学药学院生物制药专业的毕业生来军、范师、严瑾靓，王攀、 顾彦和钱志琴等同学，论文也有你们的辛勤汗水，在此祝你们工作顺利，前程似锦! 感谢我的妻子陈虹和女儿梅婕，妻子无时无刻的支持才让我全身心投入工作和 学 - j ；梅婕的笑声欢语是我努力完成学业的动力；感谢我的亲人们，你们默默地给 予我无限的支持和鼓励，希望我学业的完成能给你们带来一些欣慰，在此也祝你们 平安健康、生活快乐! 最后感谢所有给我帮助和关心的老师们、同学们和朋友们! 浙江大学博士学位论文文献综述 1 文献综述 1 1 微生物转化 1 1 1 概述 目前，化学工业的发展正面临巨大挑战。能源短缺、资源匾乏以及环境污染己 成为世界各国经济可持续性发展的严重障碍。现代化学工业很大程度上是以石油加 工为主要内容，随着石油等不可再生资源的日趋紧张，迫切需要开发出替代产品或 取代生产技术；化学工业引起的环境污染问题也不容忽视，以破坏环境为代价的经 济发展不是长久之计。化学工业可持续发展，需要不断寻找新的经济增长点。应用 现代生物技术改造或取代传统化工产品是推动化学工业走向2 1 世纪新的经济增长 点的必由之路。 微生物转化就是利用一种或几种微生物的一种或几种酶的专一催化功能，对用 作底物的某个有机化合物分子结构的特定位置，实现一种或几种化学反应的操作过 程，使其转化成结构相似而更有价值的新化合物。生物转化技术是生物学和化学工 程的交叉学科，它把生物技术的研究成果，应用于化学工业中最为关键、且是普遍 应用的催化剂领域，是一个具有诱人前景的结合点，也是传统化学工业向新世纪绿 色化工转交的一个契合点。传统的化学工业过程以人造化学催化剂为媒介，其低效 与污染问题日益突出。自然界中生物加工过程的核心是酶( 生物催化剂) 的催化， 其过程高效而温和，与环境兼容。以酶取代人工化学催化剂，并逐步以生物可再生 资源为原料，从而对人类化学工业过程进行根本的变革，是化学工业可持续发展的 一个重要趋势。以生物催化剂为核心内容的工业生物技术在支撑新世纪社会进步与 经济发展的技术体系中地位已经被提到空前战略高度【l 】。 用于生物转化的生物催化剂形式多种多样，究竟选择酶( 分离或部分纯化) ， 还是全细胞以及细胞是否需要固定化，往往受反应类型、是否需要辅酶以及转化反 应的规模决定【2 1 。用分离酶法进行反应，通常具有反应专一性强，只催化某一特殊 官能团的转化，且副产物少，反应后处理简单等优点但是，由于酶是生物大分子， 通常稳定性差，在使用中容易失活；而且从生物体内分离纯化某一特定酶的过程往 往十分繁琐，成本昂贵，费时费力，且大多数酶从细胞内分离后，稳定性显著降低， 催化反应后极难回收；此外，许多酶反应还必须加入价格昂贵的辅酶。所有这些因 浙江大学博士学位论文 文献综述 素都不同程度上制约了酶法在有机合成中的应用。利用微生物完整细胞作为酶源直 接应用于生物转化则显得非常有优势【3 】。微生物细胞可以通过发酵方法获得，这样 便可随意控制所需生物催化剂的用量；而且生物体内的酶被其细胞自身的“自然” 环境所维持，反应过程中勿需另外提供辅酶维持酶活力，只要保持细胞活力即可。 更有意义的是，由于细胞内多种酶的存在，使得一种微生物可以接受结构相差很大 的不同类非天然底物，使其转化获得所需的光学活性化合物成为可能。例如酿酒酵 母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 可以催化许多类型的转化和还原、氧化、水解、碳 碳键形成等等。 近年来，随着人们对生物转化反应的不断探索，对其催化反应的选择性有了更 深入的了解。虽然细胞内大多数酶会在类似条件下都显示出催化特性，但是底物特 性将驱动反应向某一方向或另一方向进行。因此，对底物结构的改变和修饰已成为 影响生物转化反应的化学选择性和立体选择性的主要手段之一；同时，通过调节生 物转化过程的其他控制因素，如p h 、营养物质、抑制剂或其他添加剂、底物浓度、 细胞和底物的比例、控制细胞生长条件、对细胞进行预处理、冻溶和制成千粉等， 以及选择不同的催化体系，如双水相反应、有机溶剂反应等等手段来诱发酶的活性 以及增加反应的选择性h 羽。 微生物转化技术目前已广泛用于制药工业，如应用于甾体激素、维生素和抗生 素等各类药物的生产。几乎各类化学反应都能利用微生物转化来完成，如氧化反应、 还原反应、异构化反应和水解反应等，而且能使进行一些化学方法难以实现的多功 能化合物和手性化合物的选择性转化【7 】。 1 1 2 微生物转化的特点 与有机化学反应相比，微生物转化反应具有以下明显的优点，主要表现为以下 几个方面： ( 1 ) 高度的立体选择性 微生物转化反应属于生物酶催化的反应，保持了酶催化反应所具有的高度立体 选择性；这种立体选择性不仅具有化学选择性和非对映异构体选择性，而且还有严 格的区域选择性和对映异构体选择性。对于手性化合物的合成来说，严格的立体结 构选择性非常关键。激素、抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效与其立 体结构有很大关系，往往要求具有严格的对映体立体构型，有机化学合成往往难以 做到这一划8 ，9 1 2 浙江大学博士学位论文 文献综述 ( 2 ) 反应速率快，产物得率和质量高 从本质上讲，微生物转化反应是酶催化的反应，在最适条件下，酶能在1s 内 使1 0 2 1 0 6 个底物分子转变成产物【1 0 】，反应速率非常快。与酶转化反应相比，微生 物转化反应无需进行酶的分离纯化，从而减少了酶活性在分离过程中的损失；微生 物转化反应是在全细胞内进行，保持了原有整体酶系统，符合生物转化所需的环境 和条件，这使得微生物转化反应可以持续进行，反应量大，产物得率和质量高。 ( 3 ) 微生物转化反应条件温和、环境友好 微生物转化反应一般都在常温和中性环境中进行，无需高温高压等苛刻条件。 因此，设备简单，生产安全。原料除底物和普通培养基外没有其他特殊有毒化学物 质，因此一般没有环境危害。 ( 4 ) 可减少化学合成步骤，简化生产设备，缩短生产周期 微生物转化反应是由胞内酶所催化，有较高的特异性，它们催化1 个或2 个分 子反应而不需要保护其他基团，可减少化学合成步骤。如由黄体酮化学合成可的松 需要3 0 多步，而采用微生物转化法只需7 步反应；又如生产炔诺酮，微生物法转 化可减少6 步工序【1 l 】。此外，还可以通过基因重组的方法，将几步中间体合成中转 化酶的合成基因构建于同一个工程菌中，一次发酵就能完成以往需几步反应才能合 成的反应【1 2 1 。例如维生素c 生物转化法生产中，将l 山梨糖脱氢酶基因和l 山梨 酮脱氢酶基因，通过基因重组构建成于氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ) 的代谢工程菌中，可以在同一次转化发酵中将d 山梨醇转化成0 【酮l 古洛糖酸【1 3 】。 与酶转化方法比较，微生物转化的优点是显而易见，但也存在一些缺点，如微 生物细胞中存在的多种酶系，可能会催化一些不希望发生的副反应；微生物培养基 的组分及代谢产物，可能影响目标产物的分离纯化；此外，微生物细胞与酶催化反 应的最佳条件可能会有一些差别，从而影响转化效率等。 1 1 3 微生物转化的方法 ( 1 ) 分批培养转化法 分批培养转化法一般是在微生物培养至生长旺盛的对数生长期的中后期大量 产酶时加入底物进行转化；也有些转化工艺在生长早期加入底物。底物加入的方式 可以是粉末状固体或底物水溶液，对于水溶性差的底物，必要时也可以预先用有机 溶剂溶解后投料，投料方式可以是一次或分批【1 4 1 。 浙江大学博士学位论文 文献综述 ( 2 ) 静息细胞转化法 静息细胞转化法是将细胞生长影响降至最小情况下进行生物转化的过程。静息 细胞是指活的但不再生长的菌体，它仍保持原有各种酶的活力。静息细胞转化法是 将细胞培养一定阶段后分离菌体，将其重新悬浮于不完全培养基( 例如缺少氮源) 或缓冲液中，使其不能继续生长但也不能死亡，然后加入底物在适宜的条件下进行 转化培养。这种方法优点是可以随意改变菌体浓度，从而提高菌体细胞的利用率； 减少培养基中的营养物质，有利于产物的分离纯化 1 5 - 1 7 】。 应用活性干燥细胞进行转化也属于静息细胞转化法。活性干燥细胞可以采用冷 丙酮干粉制备法或冷冻干燥法制备，制备好的活性干燥细胞可以长期贮存，随时使 用【1 羽。 ( 3 ) 孢子生物转化法 真菌的分生孢子和子囊孢子往往具有一定的酶活力，与菌体转化相比，具有杂 质少的优点，因此二者在生物转化中广有应用。孢子生物转化需注意所用的悬浮液 和培养基成分不能促使孢子萌发，否则不能保持稳定的生物转化活力。应用于生物 转化的孢子悬浮液组分要求与静息细胞转化法相似，也是采用不完全培养基，仅含 有像葡萄糖这些产生能量的碳源或缓冲液，在适宜温和搅拌下加底物进行转化【1 8 1 。 ( 4 ) 渗透细胞转化法 微生物细胞经渗透处理可促使底物渗入细胞内与酶充分接触，同时也便于转化 产物透出细胞外。一般采用加入有机溶剂或表面活性剂促使细胞渗透性增大或改变 细胞膜孔，也可采用加入作用于细胞膜的抗生素( 例如青霉素) 来增加细胞膜的渗 透性，但必须控制用量，不能杀死转化微生物或损害细胞内酶系的活性【1 8 1 。 ( 5 ) 固定化细胞转化法 利用固定化细胞进行生物转化的优点是细胞能够重复或连续地用于生物转化， 而且便于固定化细胞与反应体系的分离，可以简化产物分离工艺固定化细胞的缺 点是增加了传质阻力1 9 , 2 0 。 1 2 生物转化与香料香精 1 2 1 香料香精概述 香料是指具有令人愉快的芳香气味，用于调配香精的化合物或混合物。香料的 应用已有悠久的历史，古代除用于敬天祭神外，也用于祛邪治病和防腐。香料按其 4 浙江大学博士学位论文 文献综述 来源可分为天然香料和合成香料；按其用途可分为日化用品香料，食用香料和烟草 香料等。11 世纪后发展的水蒸气蒸馏法，是从芳香植物提取挥发性精油( 又称芳香 油) 的最常用的方法，并沿用至今【2 1 1 。随着科学技术的进步，香料的主要成分得以 从精油中分离，鉴定其结构，并能够采用化学方法合成。近3 0 年来，由于分析和 分离技术的进步，许多植物精油中的重要微量成分先后被发现，其产品亦相继问世， 再加上其他各种香型的新品种不断