（有机化学专业论文）基于靶酶结构的新型抑制剂先导化合物的合理设计与筛选研究.pdf

博士学位论文 d o c t o r a ld l s s e 骶棚0 n 摘要 药物( 含农药) 研发过程中最关键的步骤之一就是尽可能地发现或设计作用靶标( 酶) 抑 制剂的先导结构。随着理论与计算化学、分子病理生物学、分子和结构生物学、药物化学和分 子药理学等学科的不断发展，越来越多的抑制剂作用分子机制得以阐明，相应作用靶标( 酶) 的结构及其活性中心与配体分子间相互作用的信息也逐渐清晰。目前，发现或设计靶酶抑制剂 先导结构已经从传统的随机筛选发展到在有效的分子模拟指导下针对靶酶结构特征进行合理设 计的后基冈组时代。由于在分子水平上认知受体一配体相互作用的详细机理能够有效地提高 新型高效抑制剂先导结构合理设计和筛选研究的速度和准确度，因此，分子水平上认知受体一 一配体相互作用的详细机理往往是研发靶酶抑制剂过程中最重要的科学问题。目前主要是通过 各种现代分子模拟、基因工程、光谱表征和有机( 固相) 合成等技术交叉集成来研究和阐明靶 酶活性中心与底物、特别是配体( 抑制剂) 分子问相互作用的详细机理。 本论文综合运用了各种现代分子模拟、基因工程以及光谱表征等技术系统地研究真核中3 羟基一3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶( c l 嬲s ih m g r ) 、原核中3 羟基3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶 ( c l 嬲s i ih m g r ) 、农作物真菌中羊毛甾醇1 4 q 脱甲基化酶( c y p 5 1 ) 等靶酶抑制剂和靶酶活 性中心的结构信息以及作用位点与配体( 抑制剂) 分子间相互作用的详细机理。在此基础上， 进行了基于上述靶酶结构新高效抑制剂先导结构的合理设计与筛选研究。具体研究内容如下： 第一章，简单介绍了计算机辅助药物设计常用方法和原理，对人体肝脏细胞中3 羟基- 3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶( c l 雒s lh m g r ) 系、原核中3 羟基一3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶 ( c l a s s i ih m g r ) 系，以及真菌中羊毛甾醇1 4 昏脱甲基化酶( c y p 5 1 ) 系的性质、功能及其研 究进展、意义进行了详细介绍，同时对各个酶系的抑制剂研究进展进行了总结介绍。 第二章，以人体肝脏细胞中h m g r 作为c l 瓠s ih m g r 酶系的代表为研究对象，对已知的 他汀类抑制剂进行了基于点叠合( a t o m f i t ) 和以药物分子对接在活性空腔的结合构象为它们的 空间叠合方式( d o c k f i t ) 的两种叠合方式的3 d q s a r 研究，并获得了具有较高精度的 m o d e l s d o c k 预测模型。根据已知的他汀类抑制剂的结构与活性信息构建t u p l e t s 药效团模型， 利用复合物品体结构中他汀类抑制剂与受体活性空腔的相互作用信息，以及将前面获得的 3 d q s a r 模型作为一个评价模型进行了基于结构的虚拟筛选研究，筛选出3 0 个结构新颖的候 选化合物，用于体外微粒体水平上的h m g r 酶抑制活性测试。 第三章，以肺炎链球菌中h m g r ( s p h m g r ) 作为c l 硒s 1 ih m g r 酶系的代表为研究对 象，在计算理论模拟方面，利用假单胞菌中的h m g r 晶体结构( p d bc o d e ：1 t 0 2 ) 为模板构建 了s p h m g r 的空间理论三维结构，并进行了分子动力学模拟研究；基于模建得到的s p i _ g r 理论模型进行分子对接、分子碎片轨道理论( 脚e n tm o l e c u l 盯o r b i t a l ，f m o ) 能量计算研究， 得到可靠的对接程序方法和活性空腔的重要残基信息；根据前两步的研究信息，针对s p h m g r 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e r l 7 j i o n 活性空腔进行基于受体结构的虚拟筛选研究，并将f m o 计算作为虚拟筛选的一个评价模型， 最终确定3 0 个候选化合物进行下一步的活性测试研究。生物活性测试实验方面，首先从肺炎链 球菌中提取h m g r 基冈进行克隆、表达和功能研究；利用紫外吸收分光光度法，通过检测反应 物n a d p h 在3 4 0 舯处的吸收峰的变化来反应底物消耗的原理建立了离体酶水平的生物活性测 试方法，对理论计算中筛选的化合物进行酶体水平的活性测试，初步实验结果显示通过理论与 实验相结合的筛选，获得了一个比已知的l o v a s t a _ t i n 抑制剂对s p h m g r 抑制活性更高的、结构 新颖的苗头化合物，此化合物可以作为先导化合物进行进一步的优化设计研究。 第四章，分别以稻瘟菌的羊毛甾醇1 4 弘脱甲基化酶( m g c y p 5 1 ) 、柑桔绿霉菌的羊毛甾 醇1 4 * 脱甲基化酶( p d c y p 5 1 ) 为研究对象，根据p 4 5 0 家族酶系蛋白氨基酸一级序列同源性 不高、空间二维、三维结构性质较保守的特点，利用c p h m o d e l s 方法分别构建出了较可靠的 m g c y p 5 l 、p d c y p 5 1 的空间三维结构模型，再根据蛋白活性空腔的疏水性较强的特性，采 用与之相对应的组合对接和打分程序方法( f l e x p h a 珊p m f g o l d ，f 1 e ) 【) i 卯m f g o l d ) ，以 及已有抑制剂的作用机制信息，针对两个体系我们分别筛选出1 9 和2 7 个候选抑制剂苗头化合 物。根据各自的酶体和菌体水平的活性测试结果显示，候选苗头化合物中有多个化合物都具有 很好的抑制活性，可以作为很好的先导化合物来进一步研究。整个研究结果显示：通过上述的 同源模建、分子对接、虚拟筛选的整套计算流程能够以较高命中率筛选出较好的苗头化合物， 说明了整个计算流程的可靠性和准确性。 关键词：3 羟基一3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶( h m g c o a ) ；羊毛甾醇1 4 叶脱甲基化酶( c y p 5 1 ) ； 分子模拟；基因克隆、表达；生物活性测试 n 博士学位论文 d o c t o r a ld l s s e r t a 丁l a n a b s t r a c t r a t i o n a ld e s i 印i n gn o v e ll e a ds t | m c t u r e so fe m m e - t a 唱酏e di n h i b i t o r sp l a yak e yr o l ei nt 1 1 e p r o c e s so fd m g o rp e s t i c i d e 陀s e a r c h 锄dd e v e l o p m e n t m 锄yi n h i b i t o r sh a v eb e e nd e v e l o p e db y 们d i t i o n a l l e a dc o m p o u n dd i s c o v e 巧m e t h o d s ，i n 、v h i c ham 蜘a do fn 删l yo c c u r i n gc o m p o u n d s h a v eb e e ns u r v e y e df o rt 量l e i ra b i l i t yt oc o n n o ld i s e 勰e0 rf u n 西h o w e v e r ，t 1 1 ee x p l o s i o nmt h e f h n d a i l l e n 诅ll ( n o w l e d g eo f b i o l o g j c a lp r o t e i ni n t e r a c t i o n sh 硒e n a b i e dar a t i o n a la p p r o a c ht 0i n l l i b i t o r d e s i 印b a s e do n 廿1 e o n i c a l 锄ds n l j c t l u mb i o l o 鲥p r e c i s e l ye x 锄i n i n g 廿l ei n t e r a c t i o l l sb 酿v e e n 锄d m s i np r o t e i nt a 唱e t s 锄da t o m si np o t e n t i a ji e a dc o m p o u n d st h a tb i n dt ot h ep r o t e i n sc a ni m p m v et h e s p e e d 锄dv e r a c 时o fm t i o n a li n h i b i t o rd e s i 印t i l i sa b i l 时t 0w o r ka th i 曲r e s o l u t i o nw 油b o t l l p p o t e i t l s 卸dl i g 锄dm a l ( e sr c c e p t o r - l i g 锄di n t e m c t i o nm e c h 锄i s mr e s e a r c h0 n eo f 廿1 e 缸n d a i l l e n t a l s c i e n c t i f i ci s s u e si n 劬i b i t o rd e s i 驴a tp r e s e 心t i l ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e 铆e e np r o t e i n 卸d l i g a n d 咖d i e dm a i n l yb ym o i e c u l a rs i m u l a t i o n ，g e n ee n 西n e e r i n 岛s p e c 仃o s c o p i ca i l a l y s i s ，( s o l i d - p h a s e ) o 卿i cs ) ，n t h e s e s ，a n ds oo n i n l i st h e s i st 1 1 ei n h i b i t o rs t m c t u r e ，t h ei n t e r t i o nm e c h a n i 锄b e 撕e e nl i g 勰d ( i n h i b i t o r ) a n d a c t i v es i t eo f3 一h y d m x y 一3 _ m e t h y l g l u t a r y l - c o e n z y m ear 甜u c t a s ei nh 啪粕( c l 嬲s ih m g r ) ， 3 一h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l _ c o e n 巧m ear e d u c t 硒eo fp r o c a 巧o t i co 玛a n i s m ( c l 雒s - l ih m g r ) 锄d s t e m l l 4a l p h a - d e m e t l l y l 罄e ( c y p 5 1 ) i n 觚g u sw e r es y s t e m i cr e s e a r c h e db ym o l e c u l a rs i m u l a t i o n ， g e n ee n g i n e 嘶n 舀s p e c 打o s c 叩i c 锄a l y s i s ，( s o l i d - p h 雒e ) o 唱龃i cs y l l t h e s e s ，锄ds oo n b 笛e do na b o v e i n f o m a t i o n 蚰r l l c t u r e - b 嬲e dr a t i o n a ld e s i g n 卸ds c r e e nf o rn o v e l 卸de 仃e c t i v el e a d 曲兀j c t u r eo f i i l l l i b i t o r sw e r ep e 墒丌n e d t h ep r e s e n tt h e s i si so 玛a n i z e d 硒f o l l o w s ： i nc h a p t e ro n e ，c o m p u t e r - a j d e dd r u gd e s i g ni nc o m m o nu s e dm e t | l o d s 锄dt 1 1 e o r i 鹪h a v eb e e n 他v i e w e d ，锄dt h ec h 啾r ，觚c t i o n ，a d v a n c e si nc l 硒s ih m g c l 雒s i ih m g rc y p 51 ，锄d r e s p e c t i v ei n h i b i t o 硌、e 陀i n t r o d u c e d i nc h 叩t e r 铆o ，矾e - d i m e n s i o n a lq 啪t i t a t i v es 咖c t u r e a c t i v n yr e l a t i o n s h i p ( 3 dq s a r ) w i t h c o m p a 咖i v em 0 1 e c u l a rf i e l d 锄a l y s i s ( c o m f a ) w 嬲p e 而n i l e do nk n o 、ns t a t i n si n h i b i t o r so fc l 签s i h m g & p 帕d i c t i v em o d e l sw e r ee 蛐1 i s h e db yi l s i n g 觚od i 腩r e n t 啪y s ：( 1 ) m o d e l s 一凤o b t a j n e db y s y b y lc o n v e n t i o n a lf i t - a t o mm o l e c u l 盯a l i 割i m e n tm l e ，( 2 ) m o d e l s - d o c ko b t a j n e db yd o c k i n g c o m p o u n d si n t 0 t t l eh m g r t i v es 沁i n t 黜dw 胁c o m f a3 dq s a rp r e d i c t i v em o d e l s ， m o l e c u l 盯s 耐k ep r o p e r i y ( e l e c 仃。蚴i c 锄ds 钯r i c ) m 印p i n g 锄ds n u c n l r e _ b a s e d ( b o t l ll i g 孤d 锄d 佗c 印向r ) v i i t u a ls c r e e n i n gh a v eb e e ne m p l o y e dt 0e x p l o r ep o t e n t i a ln o v e lh i t sf o rt h ec l 舔s - ih m g r i n h i b i t o r s ar e p r e 鸵n 倒v es e to ft l l i r t yn e wc o m p o u n d so fn o n - s t a t i n l i k es 自m c t u r e sb u tw i t l lh i g h i p i c 5 0v a l u e sw e 陀s o r t e do u ti nt h ep r e s e n t 咖d y t h e s ec o m p o u n d sw i l lb eu s e df o rb i o l o g i c a jt e s t i nc h 印t e rt h r e e ，t h ec l a s s i ih m g r3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a 巧1 - c o e n z y m ear e d u c t 笛ei n 跏叩幻埘朋已删铆妞( s p h m g r ) w a ss n j d i e d i nc o m p u t e rt h e o qt e r r i l ，n l en l e o 巧 3 d s n u c n l r eo fs p - h m g rw a so b t a i n e db yh o m o l o g ym o d e l i n gb 笛e do nc 巧s t a ls 仇l c t u r e so fm e c l 嬲s i ih m g rp s e u d o m o n 嬲 m e v a l o n i i1a n dm o l e c u l a rd y n 锄i cs i m u l a t i o n s u b s e q u e n t l y ， m o l e c u l 盯d o c l d n ga n d 仔a g m e n tm o l e c u l a ro r b i t a l ( f m o ) w e mp e r f o m e dt oe v a l 岫_ t et h es u i 诎l y d o c k i n gp r o c e s s 卸dk e yr e s i d u e si na c t i v es i t e b a s e d 伽a _ b o v e 陀a r c hs 臼l l c t u r e d - b a s e dv i r t u a l s c r e e n i n gw 鹤p e r f o 彻e d ，a n das e to ft 1 1 i r 够h i t sc o m p o u n d s 、v e r es c r e e n i n go u tf o rb i o l o 舀c a lt e s t i n e x p e r i m e n tt e m ，t h e 如1 l l e n g t hs p - h m g rg e n ew e r ec l o n e d 锄de x p r e s s e di ne 疗b l 2 1 t i l e a c t i v 时o fs p h m g rw 丛卸a l y z e dw 曲锄u v - ss p e c 仃o p h o t o m e t e rb 雒e do n 廿l eo x i d a t i o n0 r r e d u c t i o no fn a d p hm o n i t o r e da t3 4 0 n m w i t l lt 1 1 ea b o v ec o m p u t e rm o d e l i n g 锄de x p e r i m e n t m e t h o dw eo b t a i n e dap o t e n t i a ll e a di n h i b i t o ro fs p - h m g t h e1 部tc h a p t e r ，i nm e m b e r so ft h ec y t o d h r o m ep 4 5 0s u p e r f 抽1 1 y ，t h ed e g r e eo fs e q u e n c e i d e n t i 哆i sl o w ( k 1 ，拮抗剂或部分激动剂k l l ( 2 。( 2 ) 占领学说( o c c u p a t i o nt h e o 巧) ，即药物作用强度与药物占领受体的数量成正比，药物与受体的 相互作用是可逆的，药物浓度与效应服从质量作用定律；药物占领受体的数量取决于受体周围 的药物浓度、单位面积或单位容积内受体总数：被占领的受体数目增多时，药物效应增强；当 全部受体被r 与领时，药物效j 达最人。( 3 ) 二态学说( t w os t a t en e o 珂) 或变构学说( a l l o s t e a r i c t h e o 叮) ，认为受体蛋白大分子本身就存在两种类型的构象状态，即有活性的活化态( 松驰型 构象) r 和无活性的静息态( 紧密型构象) t ，二者处于动态平衡，l 为变构常数。药物小分子， 可诱导蛋白质的构象变化，使其空间结构更适宜与药物分子结合，即诱导契合的概念。 药物小分子自身的化学结构与性质、活性功能基团的空间配置、分子体积的形状和大小、 化学反应性、带电性、电荷分布以及与受体空腔的结合模式等等，这些方面的性质都对药物的 生物活性的高低有决定性的影响。在生物体给药后，某一特异性的药物分子进入生物体，按一 定的药物作用机制，与肌体内某些部位的特定靶标生物大分子发生相互作用，发挥生物化学活 性，从而改变生物大分子的物理化学性质，达到治病的目的。药物的生物效应是药物分子和生 物大分子之间反应和相互作用的结果，探索药物与受体相互作用的基本原理是药物设计的重要 基础。 根据有关生物活性物质结构与功能的特征和关系，以及药物在生物体内的作用“靶点”， 即所谓受体的三维结构信息，应用量子力学、分子动力学、构效关系等基础理论数据研究药物 对酶、受体等的作用药效模型，设计出具有特定药效的药物分子。计算机辅助药物设计方法可 2 ： 博士学位论文 d o c t o r a ld t s s e r t a l l o n 以通过计算机模拟技术，研究配体小分子与受体生物犬分子之间的结合构型和立体化学特征、 药物与受体的结合模式和特异性结合位点、药物分子的活性基团和药效团模型等，为设计和优 化具有潜在的生物活性物质的结构并设计出新的药物分子提供理论指导。 1 2 1 计算机辅助药物分子设计常用方法 利用分子模拟、理论计算和计算机辅助药物设计方法来研究受体生物大分子中药物结合部 位的结构与性质、药物与受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、 药物分子的活性基团和“药效构象”等等，可为改造现有的具有一定生物活性的物质结构和设 计新的先导化合物提供理论上的预测和指导，从而改变目前新药研究中“泛泛合成、普遍筛选” 的状况，大大提高新药研究的效率，逐步形成“理论研究、药物设计、药物合成、药理研究” 相结合的寻找新药的新途径。 计算机辅助药物设计的出发点是基于对药物与受体之间相互作用的理解和研究。根据药物 受体生物犬分子的结构是否已知，计算机辅助药物设计有着两种不同的研究策略：直接药物设 计和间接药物设计。直接药物设计是根据已知受体的三维结构设计出配体分子，间接药物设计 是在未知受体三维结构的情况下，从一系列配体分子中归纳总结出药物分子的结构特点、构效 关系及受体空腔结合的要求，以此设计新的配体小分子。 1 2 1 1 直接药物设计 药物分子的活性依赖于分子间的三维相互作用，生物大分子靶点的三维结构，特别是活性 位点结构信息是设计新的药物分子的重要依据。生物大分子的三维结构信息的获得方式主要有 两种：实验数据和理论预测数据。实验数据主要来自于x 射线晶体衍射和核磁共振的测定；理 论预测数据主要是根据同源家族蛋白序列的同源性推测出其结构同源性的方法，推测出生物大 分子的空间三维结构模型。随着细胞生物学、分子生物学和结构生物学的发展，越来越多的药 物作用靶标分子被确定，空间三维结构被确定，为直接药物设计的应用提供了有利的条件，使 得直接药物分子设计成为药物设计的主要方法【1 5 】。 直接药物设计方法，可以分为全新药物设计( d en o v od 九唱d e s i 印) 和三维结构搜寻两类。 1 2 1 1 1 全新药物分子设计 全新药物设计又称为从头设计，此方法根据受体活性部位的形状和性质要求，由计算机自 动构建出与受体活性空腔在形状、性质上互补的全新配体小分子。它能够提出结构全新的具有 启发性的先导化合物，故称为全新或者从头药物设计。这种方法通常能提出一些新的思想和结 构类型，但对设计出的化合物要进行全合成。最早的全新设计方法为g r i d 1 6 】，随后各种方法 应运而生，现已开发出一批实用性较强的软件，其主要包括由l u d i 【1 7 】、l e 印f o 曙【1 8 】、 s p r o u t 【1 9 】、b u i l d e r 等【2 0 】，其中l u d i 最为常用。 3 、 ： 博士学位论文 d o c t o r a ld l s s e r 汀i a n 全新药物设计方法根据药物分子构建时采用的基本构建单元的不同，主要可分为自动分子 模板定位法( a u t o m a t e dm 0 1 e c u l a rt e m p l a t e d i r e c t e dd m gd e s i 凹) 、原子生长法( a t o mb u i l d ) 、分 子碎片法( m o l e c u l a r 丘硼皿e n ta p p r o a c h ) 等，其中以分子碎片法为最主要的设计方法 2 1 】。 在靶酶确定，但其晶体结构未知的情况下可以采用同源模建方法构建出初始结构构型，之 后进行分子力学和分子动力学模拟等步骤，最终获得稳定、可靠的受体空间三维结构。 1 2 1 1 1 1 同源模建 基冈复制和趋异同化产生了同源蛋白族系，同源的序列可能来自共同的祖先。蛋白质的同 源性使人们有可能根据已知的蛋白质三维结构去推测未知结构的同源蛋向质的初步结构。1 9 6 9 年b r o w n e 以及其同事首先以鸡蛋清溶菌酶的结构为基础，手工模建了甜乳白蛋白的空间结构， 并获得了成功，从此开启了同源模建( h o m 0 1 0 舒m o d e l i n g ) 的先河【2 2 】。人们通过对类似蛋白 质空间结构的对比发现，蛋白质的三维结构比蛋白质的一级结构更加保守，而后者有比d n a 序列更为保守。因此，用类似物的三维结构来预测蛋白质结构是比较可靠。生物进化过程中， 有时d n a 序列变异而会引起蛋白质的氨基酸序列突变，可是维持蛋白质功能和结构部分的氨 基酸序列不会变化。一般说来，负责维持功能的氨基酸常位于蛋白质的表面，而负责维持结构 的氨基酸多位于蛋白质的核心，在进化过程中有较大变异的氨基酸则多在环状结构( 1 0 0 p ) 上， 将氨基酸序列和结构进行比较，如果两个序列的一致性( i d e n t i 够) 超过3 0 ，则此两种蛋白 质就判定为同源蛋白【2 3 2 5 】。同源模建的基本假设是序列的同源性决定了三维结构的同源性， 一个未知结构的蛋白质分子( 目标蛋白) 的结构是可以通过与之序列同源且结构已知的蛋白质 ( 模板蛋白) 来进行预测的。 一般说来，同源蛋白模建的具体计算步骤分为以下几步： ( 1 ) 模板选择。从已知三维蛋白结构的数据库( 如：p r o t e i nd a t eb a i l k ) 中挑选与目标蛋白 序列同源的蛋白结构作为分子模建的模板( t e m p l a 把) 。序列之间的同源性在5 0 以上，则通过 模板蛋白准确构建出来的蛋白三维结构具有很高的准确性；若序列同源性在3 0 5 0 之间， 则通过模板蛋白准确构建出来的蛋白三维结构具有很好的、一定的准确性；若序列同源性在3 0 以下，则仅仅通过序列比对模建出的蛋白很难有好的结果。 ( 2 ) 序列联配。序列定位和排列是同源模建蛋白的关键步骤。序列联配分为多重序列联配 ( m u l t i p l es e q u e n c ea l i 酆吼e m ) 和结构联配( s 咖c t u m la l i 印m e n t ) 。通过多重序列联配可以确定 它们的序列保守区域，根据同源性可知，这些片断的三维结构应该是相似的。通过结构联配可 以确定结构上的保守片断，如：a 螺旋的核心位置，保守性氨基酸残基的位置等相似的结构特 征【2 6 】。 ( 3 ) 模型搭建。保守区域主链结构预测，基本做法是做序列比对，之后根据残基间的对应 关系，将已知的结构信息应用到未知结构中去。非保守区域主链结构预测【2 7 ，2 8 】，通常采用数 4 博士学位论交 d o c t o r a ld i s s e r t a = 兀o n 据库查询和系统构象搜索方法。数据库查询方法的出发点在于假定具备相似末端的等长片断， 其结构相似。系统构象搜索方法一般是对待定的二面角进行格点搜索。 侧链结构预测【2 9 ，3 0 】。主要有理论模拟计算和数据库算法两大类方法。前者按照一定的规 则产生构象并采用一些的具体方法进行进一步的筛选，一般可以找到合理的构象，但是计算量 比较大。数据库算法主要是基于侧链转子库( r o t a m e rl i b r a 巧) 的方法，选取一些侧链二面角具 有确定取向的优势代表构象进行计算，从而大大减小了计算量，也能得到比较可靠的结果。 ( 4 ) 模型优化。模型产生了模拟蛋白的初始坐标构象，模拟是在真空中状态，通常含有较 多的不合理的原子间碰撞，因此必须进行进一步的能量优化。优化常用的是分子力学和分子动 力学方法，对于结构保守区的主链原子一般要加上谐性限制优化方法。 ( 5 ) 模型评价。根据一系列原则对所建立的模型进行评价，并采取相应的修改、优化方法 和手段。评价的依据主要来源于一些实验事实和理论推导，如同源蛋白的n m r ，x 射线衍射结 果、定点突变结果，依此确定相应结构的空间取向、各结构保守区的相对位置等。评估的手段 有很多，对应的软件也有很多，可以作出蛋白质主链二面角的r 锄a c h a l l d r 锄分布图，可以检测 分子中键长、键角以及二面角的分布，可以计算出所有残基的能量分布，可以计算分子的溶剂 的可及性表面、分子表面的极性和北极性分布等。通过这些性质和统计分布规律的比较，来对 模型进行评价。 1 2 1 1 1 2 分子力学 分子力学( m o l e c u i a rm e c h 锄i c s ) 方法又称力场方法，是以经典牛顿方程为基础，通过计 算来描述分子构象和能量的一种方法。这一算法是基于以下假设：分子是由原子组成的，所以 孤立分子或相互作用体系的势能函数是分子或体系中原子位置的函数 3 1 ，3 2 】。原子间的相互作 用按照牛顿力学来处理，原子犹如小球，化学键为连接小球的弹簧。在计算过程中由于原子核 的质量远远大于电子质量，因此，在进行分子力学牛顿方程时将电子函数忽略不计，即认为原 子核的位置发生变化时，电荷在空间的分布保持不变。因此，分子力学计算不能给出体系与电 子结构有关的性质。该方法可用来确定分子结构的相对稳定性，广泛地用于计算各类化合物的 分子构象、热力学参数和谱学参数。 1 2 1 1 1 3 分子动力学 分子动力学( m o l e c u kd y n 锄i c s ) 也是建立在牛顿力学基础上的分子模拟方法，是在分子 力学的基础上描述分子运动随时间演化的方法。它通过求解分子中每个原子的牛顿力学方程来 模拟分子运动和分子的行为。第一个报道分子动力学模拟工作的是a l d e r 和w 蔚n w r i 曲t 在1 9 5 7 年完成的 3 3 】。 其基本原理就是，在一段时间内对一个相互作用的粒子体系的经典运动方程进行数值积分， 求解出体系的运动轨迹和速度，并进行相应的统计，得到所需要的信息。在分子动力学中，首 5 ： 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e r t a t i o n 先将由n 个粒子构成的系统抽象成n 个相互作用的质点，每个质点具有坐标、质量、电荷及成 键方式，按目标温度根据b o l t 盈m a n n 分布随机指定各质点的初速度，然后根据所选用的力场中 相应的成键和非键能量表达形式对质点间的相互作用能以及每个质点所受的力进行计算。再跟 据牛顿力学计算出各质点的加速度和速度，从而得到经一指定积分步长后各项质点新的坐标和 速度，这样质点就移动了。经一定的积分步数后，质点就有了运动轨迹。设定时间间隔对轨迹 进行保存。最后可以对轨迹进行各种结构、能量、热力学、动力学、力学等的分析，从而得到 感兴趣的计算结果。 m d ( m o l e c u l a rd v n a m i c ) 方法包括三个基本假定： 一，有效作用势近似 二，周期性边界条件 三，热力学量的系综平均等于时间平均。 在这些基本假定下，选择合适的粒子相互作用势，确定中心原胞的尺寸l 、体系温度t 、 密度p ( 气象为压强p ) ，并确定中心原胞内粒子的初始空间分布和速度分布，最后选定模拟的 时间步长d t 和模拟总步数，就可以进行m d 计算了。 分子力场一般由两个不同的成分组成：一组方程用以产生势能和它们的导数、力；方程所 使用的参数。同一组方程可以使用不同的参数。自七十年代起，分子动力学模拟计算的系统由 最初的单原子分子系统衍生至多原子分子，聚合物分子，至生化分子系统，其所使用的力场， 也由最简单的范德华作用，随着系统复杂难度的增加，而增加其复杂性。这些力场多是针对于 特殊目的所发展的，各有其优点与适用范围。 a m b e r ( a s s i s t e dm o d e lb u i l d i n gw i t he n e 固，r e f i n e m e n t ) 力场【3 4 3 7 】，这种力场及软件 在生物分子如蛋白质与核酸分子的模拟取得了非常好的结果。主要适用于较小的蛋白质，核酸， 多糖等生化分子。应用此力场通常可得剑合理的气态分子几何结构，构型能，振动频率与溶剂 化自由能。a m b e r 力场的参数全来自计算结构与实验值的比对，其势函数形式为： y ( ，) = 等( 卜) 2 + 冬( 臼一吼) 2 + 每【1 + c 。s ( ”国一厂) 】 6 + 水矿r 铲一c + 嚣 分子动力学法的一般计算流程为： 1 ) 给定构成物质的各个粒子的初始位置和速度。 2 ) 根据粒子的位置计算每个粒子的作用力； 3 ) 根据粒子的位置、速度和受力计算粒子的新位置和新速度。 博士学位论文 d ( ) c t o r a ld i s s e r t a ：丌a n 4 ) 更新粒子的位置和速度，然后回到2 ) ，反复进行这样的计算，直到体系达到平衡。 这样以时间函数得出的全体粒子的坐标及速度的庞大数据作为基础，求出粒子集合体的宏 观性质。 1 2 1 1 2 三维结构搜寻 受体的分子识别理论告诉我们，受体对配体的分子识别是配体的某些部位与受体的受点在 性质上呈现某种互补性，包括基团形状、电性、疏水性等。这一理论为直接以及间接药物设计 提供了依据。三维结构搜寻又称为数据库搜寻法或数据库算法，是利用计算机人工智能的模式 识别技术，把三维结构数据库中的小分子数据逐一地与搜寻标准即提问结构进行匹配计算，寻 找到符合特定性质和三维结构形状的苗头化合物，从而发现适合的潜在活性的药物分子。分子 对接方法就是其中最优代表性的一个，分子对接方法从2 0 世纪8 0 年代到现在，逐渐发展成为较 为完善的药物设计方法之一，而且成为药物设计中最为重要的方法之一。 1 2 1 1 2 1 分子对接 所谓的分子对接，就是受体空腔与配体小分子之间通过几何匹配、能量匹配以及化学环境 互补的原则相互识别的过程【5 】。分子对接的最初思想起源于1 0 0 年前f i s h e re 的“锁和钥匙模 型”。f i s h e re 认为“锁和钥匙”相互识别的首要条件是它们在空间形状上要互相匹配。当然， 药物分子与靶标分子之间的识别要比“锁和钥匙”模型复杂得多。分子对接计算是把配体分子 放在受体活性位点的位置，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价 配体与受体相互作用的好坏，并找到两个分子之间最佳的结合模式。由于分子对接考虑了受体 结构的信息以及受体和药物分子之间的相互作用，因此从原理上讲，它比仅仅从配体结构出发 的药物设计方法更加具有合理性。 分子对接方法根据不同的简化程度人致可以分为三类：刚性对接、半柔性对接以及柔性对 接。刚性对接指在对接过程中，研究体系的构象不发生变化，其中比较有代表性的方法就是j i a l l g 等发展的软对接( s o f ed o c k ) 方法。半柔性对接指在对接过程中，研究体系尤其是配体的构象 允许在一定范围内变化，其中比较有代表性的方法有k u r 】忆等以及o l s o n 等发展的分子对接方 法。柔性对接是指在对接过程中，研究体系的构象基本是可以自由变化，其中比较有代表性的 方法有a c c e r l y s 公司发展的基于分子力学和分子动力学的分子对接方法。分子对接的方法有很 多，这里介绍几种应用较为广泛的分子对接方法。 1 2 1 1 2 1 1d o c k d o c k 是第一个分子对接程序，由加利福尼州立大学旧金山分校的k u i l t z 小组于1 9 8 2 年开发，是目前应用最为广泛的分子对接程序之一【3 8 5 0 】。活性位点的确定和表达是d ( ) c k 最 重要的特点之一，d ( ) c k 利用球形集合来表示受体活性位点以及配体的形状。对于受体，程序 产生一个球集，使之填充受体分子表面的口袋和凹槽，然后将其整理成一系列的假设结合位点。 7 。， 博士学位论炙 d o c t o r a ld i s s e r l a r l o n 肚莩芸c 鲁争3 3 2 静 i - 、j 文珏ll iu | u 式中，e 表示配体和受体之间的相互作用能；为原子f 和原子j 之间的距离：彳盯和吃为 范德华排斥和吸引参数；口和6 表示范德华吸引和排斥方次；吼和g ，为原子f 和原子歹上的部 d o c l ( 3 0 开始引入经验势能函数做为评价函数【4 2 】，采用a m b e r 立场参数，但只包含静 及贪心算法( 辨e d ya l g o r i t h m ) ，整个过程包括以下几个步骤，如下图所示。 8 博士学位论文 d o c t o r a ld i s s e r t p 汀i o n 1 - 2 1 - 1 2 1 2a u t o d o c k 图1 1 ：锚优先搜索算法流程图 a u t o d o c k ( a u 切m a t e dd o c l ( i n go ff l e x i b l el 谵卸d st 0r e c e p t o r s ) 程序是s c r i p p s 研究所o l s o n 研究小组经过多年的编程设计出来的用于有机小分子与生物大分子之间分子对接的软件 【5 l - 5 8 】。最近的版本是a u t o d o c k 3 0 ，与以前的版本相比，有了很大的改进，主要体现在算法 和打分函数( s c o r i n g 丘m c t i o n ) 上。3 0 以前的版本采用经验势函数为评价函数，a u t o d o c k 3 o 版本开始采用经验结合自由能为评价函数。 1 经验势能函数 a u t o d o c k 的经验势能函数包括三项【5 9 ，5 2 】：静电作用、范德华作用和氢键相互作用。其中 氢键参数和范德华参数都来自a m b e r 力场。 2 经验结合自由能 a u t o d o c k 的经验结合自由能评价函数包括5 项【6 0 】： g = g 咖否c 争一争+ g 一删善肌，c 争一争， + g 咖善老茜“g f d f f o f “吒否( s _ + s ，叫司，2 一 运用a u t o d o c k 进行分子对接，主要按以下步骤进行： ( 1 ) 生成小分子的p d b q 文件和生物大分子的p d b q s 文件。该文件中不仅包含小分子和 大分子的坐标信息，还加进了分子中原子的形式电荷，其中大分子的p d b q s 文件中还包含了 溶剂化参数信息。 ( 2 ) 生成格点参数文件( 鲥dp 猢e t e rf i l e ，g p f ) 和分子对接参数设置文件( d o c k i n g p a 阳m e t e r 丘1 e ，d p f ) 。这些文件中包括小分子和大分子中各原子的类型、配体分子的溶剂化参数、 网格中心位置及网格空间大小、对接过程中采用的算法和步数，以及其它相关参数。 ( 3 ) 计算空间网格参数。在此步计算进行之前，结合所研究化合物的结构特征，对一些参 数作局部调整。 ( 4 ) 进行分子对接。 9 博士学位论文 d o c t o r a l 。d i s s e r 盯l o n ( 5 ) 对对接结果进行分析和评价。 1 - 2 1 1 2 1 3f l e x x 和f l e x e f 1 e 必是德国国家信息技术研究中心生物信息学算法和科学计算研究实验室的m 砌泌 r 蹦拶等发明的分子对接方法【6 1 - 7 l 】。f l e x x 是一种快速、精确的柔性对接( f l e x i b l ed o c k i n g ) 算法，在对接时考虑了配体分子的许多可能构象。对接过程中f l e x x 首先在配体分子中选取一 个核心部分，并将其对接剑受体的活性部位，然后再通过树搜寻方法连接其余的片断。f l e x x 中的打分函数类似于b o h m 计算蛋白质配体结合自由能g 的函数【7 2 ，7 3 】，方程具体形式 如下： g = g 。+ g 删删+ g 6 删厂( 欲，口) + g 如厂( 欲，口) n 删r d h b o h d i | c 一 试 + g 册( 衄，口) + g 伽厂木( 欲) 口，d i n l 伽一c o 哪 其中：厂( 衄，口) 是偏离理想的儿何特征的惩罚函数：，。，是复合物中被冻结的可旋转 键的数目；g ，。，、g 删、g f d 、g 。、g 跏和g o 是通过拟合得到的半经验参数； 欲= 足一r ，其中r 为原子间的距离，心为原子间的理想距离，一般为原子对的范德华半径 和加上o 6 a 。 f l e x x 的对接算法建立在逐步构造策略的基础之上，通过球面