（高分子化学与物理专业论文）包埋脲酶基因工程菌的微囊的制备及性能研究.pdf

中文摘要 尿毒症的发病率很高，严重影响到患者的健康及生命。口服型微囊用于治疗尿毒症与 肾脏移植、血液透析相比具有成本低廉、使用方便、清除率较高等优势，有良好的发展前 景。这一技术的关键是研制具有优异性能，能高效率清除毒素的工程菌，提高微囊的机械 强度，使微囊在通过肠道清除毒物时不会破碎。目前为止，未见报道有一种微囊能满足机 械强度的要求。加拿大麦吉尔大学张明瑞等人研制的海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠( a p a ) 微囊在保持良好通透性的基础上需进一步提高其强度。 我们使用聚乙烯醇( p v a ) 以多种方法制备微囊，发现以冷冻法制备的物理交联p v a 微囊具有条件温和、机械强度好、通透性好、化学性质稳定的特点。p v a 微囊的耐磨强 度远大于a p a 微囊，a p a 微囊的破损率为1 0 0 时，在相同机械压迫下p v a 微囊的破损 率仅为3 。并且p v a 微囊对尿素、尿酸、肌酐等小分子能在1 0 m i n 内完全通透。包埋过 程中加入o 5 海藻酸钠有利于微囊的长期保存。包菌量为1 5 0 m g 菌g 微囊时可在保持较 高产率基础上得到有最佳分解尿素活性的微囊。包菌微囊在不同p h 缓冲液中和较高浓度 盐溶液( o 5 nn a c l ，o 5 nk c l ，o 5 nn a h c 0 3 ) 中基本上仍保持稳定。由此预测微囊在 病人体内能保持相当好的稳定性。 我们制备的低温物理交联聚乙烯醇微囊完全可替代现有的a p a 微囊用以包埋脲酶基 因工程菌，解决a p a 微囊在强度方面的缺点，有望应用于口服治疗尿毒症。 关键词：低温物理交联，聚乙烯醇微囊，脲酶基因工程菌，机械强度，通透性 a b s t r a c t u r e m i ai sar a t h e rw i d e s p r e a dd i s e a s e u p t od a t es e v e r a lt h e r a p e u t i cm e t h o d sa r e a v a i l a b l ee g t r a n s p l a n t a t i o na n dh e m o d i a l y s i s t r a n s p l a n t a t i o ni sl i m i t e db yt h e a v a i l a b i l i t y o fd o n o r sa n dh e m o d i a l y s i si se f f e c t i v eb u te x p e n s i v ee s p e c i a l l yf o r d e v e l o p i n gc o u n t r i e s e a r l i e rw o r k a n do n g o i n gr e s e a r c hb yp r o f e s s o rc h a n ga n dd r p r a k a s ha tm c g i l l u n i v e r s i t yh a s s h o w nt h a tt h eo r a la d m i n i s t r a t i o no f m i c r o c a p s u l a t e d g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e d e c o l ic a nd e c r e a s e d r a s t i c a l l y t h eu r e aa n do t h e rw a s t e m e t a b o l i t e si nu r e m i cr a t s t h ek e yp r o b l e mn e e d st ob es o l v e di st od e v e l o pan e w m e t h o df o rt h ep r e p a r a t i o no f m i c r o c a p s u l e so fg o o dm e c h a n i c a ls t r e n g t hs ot h a tt h e e n c a p s u l a t e dc e l l s a f t e r o r a la d m i n i s t r a t i o n ，w h e np a s s i n gt h r o u g ht h ei n t e s t i n eo f u r e m i ap a t i e n t s ，w i l ln o tr a p t u r e ，a n da f t e rr e m o v i n gt h et o x i n s ，c o u l db ed i s c h a r g e d f r o mt h eb o d yi nt h es t 0 0 1 a tp r e s e n tt h e r ea r en om i c r o c a p s u l e si n c l u d i n gt h ea p a m i c r o c a p s u l e ss t r o n ge n o u g ht oa t t a i ns u c hf u n c t i o n sa n da b i l i t y w ed e s i g n e dt h e f o l l o w i n g m e t h o d sf o rp r o d u c i n gm i c r o c a p s u l e sw i t hg o o d m e c h a n i c a ls t r e n g t hf o re n t r a p m e n to fg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e de c o l i t h ec h e m i c a l m e t h o dw a st ou s eg l u t a r a l d e h y d ea n db o r i ca c i dt oc r o s s l i n kp v a m i c r o c a p s u l e s ，b u t t h e ys h o w e d t o x i ce f f e c tt ot h eb a c t e r i a w ef o u n dt h a tu s i n gl o w t e m p e r a t u r ep h y s i c a l c r o s s l i n k i n gm e t h o d t op r e p a r ep v a a l g i n a t em i c r o c a p s u l e sw a sv e r ys u c c e s s f u l t h e m e m b r a n ew a s s t r o n g a n dt h e p e r m e a b i l i t y w a s g o o d w h e nb r e a k a g eo fa p a m i c r o c a p s u l e sw a s10 0 u n d e r t h es a m ec o n d i t i o np v a m i c r o c a p s u l e sw a so n l y3 u r e ac a r lp e r m e a t et h r o u g hp v ab e a d sw i t h i nl m i n ，u r i ca c i dw i t h i n 10m i na n d c r e a t i n i n ew i t h i n3m i n ，a n dt h ep v a m i c r o c a p s u l e ss h o w e dh i 曲c h e m i c a ls t a b i l i t yi n b u f f e rs o l u t i o n so fd i f f e r e n t a c i d i t y ( p h 1 1 1 ) a n d s a l ts o l u t i o no f h i g h c o n c e n t r a t i o n ( 1 o nn a c l ，1 o nk c l ，1 o nn a h c 0 3 ) t h el o w t e m p e r a t u r ep h y s i c a lc r o s s l i n k i n gp r o c e d u r eo fp v a w a sn o n t o x i ct ot h e e n g i n e e r e dd h 5c e l l sw h i c ha t t a i n e dh i g ha c t i v i t yi nv i t r os t u d i e s n ol e a k a g eo f b a c t e r i aw a sd e t e c t e da f t e re n c a p s u l a t i o n t h ep v a m i c r o c a p s u l e sa l s os h o w e dh i g h 2 s t a b i l i t yo fa b i l i t yo fd e c o m p o s i n g u r e ai nb u f f e rs o l u t i o n so fd i f f e r e n ta c i d i t yr p h4 9 、a n ds a l ts o l u t i o no fh i g hc o n c e n t r a t i o n ( o 5 nn a c i ，o 5 nk c i ，o 5 nn a h c 0 3 ) a d d i t i v eo fo 5 a l g i n a t ew i l lh e l pt h ee n c a p s u l a t e dc e l l sm a i n t a i nh i g ha b i l i t yo f d e c o m p o s i n gu r e a b o t hg o o dy i e l d a n dh i g ha b i l i t yo fd e c o m p o s i n gu r e aw e r e o b t a i n e dw h e n1 5 0 m gb a c t e r i aw e r ee n c a p s u l a t e di n1 9m i c r o c a p s u l e s p v am i c r o c a p s u l e sp r e p a r e db yl o wt e m p e r a t u r ep h y s i c a lc r o s s l i n k i n gm e t h o d h a v eah i g hp o t e n t i a lt ob eu s e df o ro r a la d m i n i s t r a t i o nf o rt h et r e a t m e n t so fu r e m i a p a t i e n t s k e yw o r d s ：p v am i c r o c a p s u l e s ，l o wt e m p e r a t u r ep h y s i c a lc r o s s l i n k i n gm e t h o d ， g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e de c o l i ，m e c h a n i c a ls t r e n g t h ，p e r m e a b i l i t y 第一章绪论 第一章绪论 1 1 尿毒症的病理和治疗方法简介 一、尿毒症的症状 人体肾脏由上1 0 0 万个极小的过滤单位所构成，主要功能包括过滤和排泄新陈代谢后 的废物和多余的水分，调节水、盐、酸碱、离子平衡，制造红血球生长激素，活性维牛素d 及控制血压。许多原发性或继发性肾脏疾患是由于肾结构和功能遭到损害，最终导致急性 或慢性肾功能衰竭。其中慢性肾功能衰竭( c r f ) 是一种渐进发展的疾患，其后果是引起一 系列代谢紊乱和临床症状所组成的综合症，如水、电解质、酸碱平衡失调以及心血管系统、 血液系统、神经系统、骨胳系统等各脏器、各系统的损害等，故又称终末期l 肾病，死l 率 较高。据统计，我国每年百万人口中有1 0 0 人左右患c r f ，其中绝大多数是青壮年。 1 8 4 0 年德国医生p i o r r y 等人使用尿毒症一词来描述肾功能衰竭症候群。当内生肌酐清 除率下降至正常值的2 0 以下，血液中非蛋白氮明显升高达2 1 4 2 m m 0 1 l ( 6 0 m g d 1 ) 以 上，并伴有各种尿毒症症状时，一般即可确诊为尿毒症 1 。 尿毒症的临床表现非常复杂，分述如下： ( 一) 水和电解质 失水、水过多、低钠血症、钠潴留、高钾血症、低钾血症、血磷升高、血钙降低、高 镁血症、血硫酸盐和其他微量元素如铜、锶、锡、锌可升高。 ( 二) 代谢性酸中毒 酸中毒的症状有：深而大的呼吸( 即k u s s m a u l 氏呼吸) ；食欲不振、腹痛、恶心、呕 吐：心肌收缩无力，可引起心力衰竭；血管扩张、血压下降；头痛、躁动不安、严重者可 昏迷。严重的酸中毒可导致呼吸中枢和血管运动中枢麻痹，为尿毒症常见死亡原因之一。 ( 三) 各系统症状 i 、消化系统：消化道症状是最早最突出的症状。发生原因可能是肠道中存留的尿素 酶将尿素分解为氨，刺激胃肠道粘膜而引起恶心、呕吐、食欲不振、消化性溃疡、顽固性 呃逆等，晚期病人常有明显的口臭及口腔粘膜溃疡。有的病人可出现腮腺重大。腹泻也常 见，严重者大便可带粘液和血。 第一章绪论 2 、神经系统：神经系统的症状是尿毒症的主要症状。通常在尿毒症早期出现乏力、 头痛、顽固性失眠、性情变化和注意力不集中等，随着病情加重，逐渐出现烦躁不安、嗜 睡、谵妄、抽搐，甚至昏迷。 3 、循环系统：常见有肾性高血压、心力衰竭及纤维素性心包炎。是慢性肾功能衰竭 的重要死亡原因之一。 4 、血液系统：常见有中度至重度的贫血、出血倾向、白细胞异常。 5 、呼吸系统：酸中毒时出现代偿性的呼吸加深加快。随着病情的加重，呼吸中枢功 能发生障碍，出现周期性呼吸。此外由于毒性代谢产物的作用，还可引起尿毒症性肺炎 ( 肺泡内有纤维素渗出) 、胸膜炎等。 6 、皮肤：体内尿毒在皮下沉积，使病人皮肤瘙瘁和表皮脱落；皮表出现白色的“尿 素霜”：病人面部肤色较深并萎黄，有轻度浮肿，称为尿毒症面容。 7 、骨骼系统：尿毒症骨病变，总称为尿毒症性骨营养不良症，包括软骨病、纤维性 骨炎、骨质疏松、骨硬化症，严重时出现转移性钙化。 8 、代谢失调：出现体温过低、尿毒症性假性糖尿病、高脂血症、蛋白质和氨基酸缺 乏及代谢废物的潴留。 9 、免疫系统功能障碍：病人机体抵抗力下降，极易发生感染，以肺部和泌尿感染为 多见。可促使肾功能恶化。 二、尿毒症的病理和尿毒症毒素 自1 8 4 0 年德国医生p i o r r y 等人用尿毒症一词来描述肾功能衰竭症候群以来，对c r f 发病机理的研究已有1 6 0 年的历史，肾脏病学家长久以来一直在寻找引起尿毒症的毒素。 本世纪6 0 年代以来，有关肾脏的一系列生理学和病理学研究取得了重大进展，人们逐渐 认识到，c r f 的发病机理十分复杂，它不仪需要解释c r f 病人的临床症状、体征，而且 需要解释c r f 病程进行性发展的内在原因。于是人们先后提出了“完整l 肾单位学说”、“矫 枉失衡学说”、“肾小球高滤学说”、“肾小管高代谢学说”、“尿毒症毒素学说”等。其中， 由于越来越多的所谓“毒性物质”在患者的体内被发现，“尿毒症毒素学说”近年来的发 展尤为令人瞩目【2 。 尿毒症毒素学说认为，新陈代谢是维持生命的基本保障，而人体的肾脏在这种保障中 起着不可替代的作用。因各种病因所造成的肾功能与结构的损伤，使得某些在正常情况下 原本可以通过肾脏进行排泄的毒素在体内产生了积累，造成了机体的一系列病理改变，甚 第一章绪论 至危及生命，这些物质就是所谓的尿毒症毒索。目前己知尿毒症患者体液内约有2 0 0 多种 物质的浓度比正常人要高，其中一些代谢产物经动物实验和临床观察证明是有毒的，可引 起尿毒症的某些症状。 理论上，凡被认定为尿毒症毒素的，必须具备下述条件：在尿毒症患者体内该物质 的浓度显著高于正常；该物质的化学结构和理化性质明确：高浓度的该物质与特异的 尿毒症临床表现相关；动物试验或体外实验证实该物质在其浓度与尿毒症患者体内浓度 相似时，可出现类似毒性作用；体液内该物质浓度下降与尿毒症症状、体征改善相伴随 【3 。但目前的尿毒症标志物没有一种能满足上述所有条件。 通常按尿毒症毒性物质的生化特性和其在透析中的性状可分为以下3 大类 4 5 ：( 1 ) 小分子毒性物质，分子量 8 0 ) ，为水凝胶微球。其堆密度与 水接近。聚乙烯醇浓度增大，微球的堆密度稍有增大，含水量稍有降低，但变化不大。 表3 - 4 不同聚乙烯醇浓度微球的含水量和堆密度 墨圣堕堕鳖堡! 墅! ! ! ! ! 堆密度( g m 1 ) 1 ，0 3 1 0 41 , 0 61 0 7 含水量( ) 8 80 8 6 98 5 88 4 0 二、海藻酸钠添加剂对微球物理性能的影响 海藻酸钠是由n l 一葡萄糖醛酸和b d 甘露糖醛酸1 ，4 连接的嵌段共聚体，易溶于 水形成粘稠溶液。在聚乙烯醇微球中添加海藻酸钠可为包埋在微球内的菌体提供一定的养 料和液体活动空间，有利于菌体活性的保持。我们用添加了不同量海藻酸钠( 0 1 ，0 5 ， 1 o ，15 ，2 0 ) 的1 2 聚乙烯醇用冷冻法制备空白聚乙烯醇微囊，并测定其机械强 度、含水量和堆密度的变化。机械强度用前述微球在一定机械压迫下的破损率来表征。结 果见表3 5 。 可见海藻酸钠浓度增大，微球的堆密度稍有增大，含水量稍有降低，但变化不大。当 海藻酸钠浓度从0 增至1 5 时，其堆密度和含水量的变化不超过5 。在相当大的机械压 迫下都能完好无损，有很好的机械强度。 第三章低温物理交联法制各的浆乙烯醇微裳的膜通透性、强度及化学稳定性研究 表3 5 不同海藻酸钠浓度的1 2 聚乙烯醇浓度微球的含水量和堆密度 三、微球的通透性 从图3 7 ，3 8 ，3 9 ，3 1 0 可见，微球对尿素、尿酸、肌酐和维生素b ：有很好的通 透作用。尿素能在i m i n 内完全通透微球，肌酐能在3 m i n 内完全通透微球，尿酸能在1 0 m i n 内完全通透微球，维生素b 。能在2 0 m i n 内完全通透微球。 图3 7 在空微囊通透作用下的维生素b 。浓度振荡时间关系图 0151 0 1 52 03 06 0 时间( m i n ) 图3 - 8 在空微囊通透作用f 的尿素浓度振荡时间关系图 6 0 0 5 0 0 喜4 0 0 蜊3 0 0 蛙 髅2 0 0 嗟 1 0 0 o 0135 1 02 0 3 06 0 时间( r a i n ) 0 o 0 0 0 0 0 柏 加 仲 一器量划避n五帐划磐 第三章低温物理交联法制备的聚乙烯醇微囊的膜通透性、强度及化学稳定性研究 图3 - 9 在空微囊通透作用下的肌酐浓度振荡时间关系图 曲 e 埘 装 赢 基 01351 0 2 0 3 06 0 时间( r a i n ) 图3 1 0 在空微囊通透作用下的尿酸浓度振荡时间关系图 拿 e 型 避 锰 嗤 6 0 0 5 0 0 10 0 0 o135 102 03 0 时问( m i n ) 四、微球的化学稳定性 低温交联的1 2 聚乙烯醇微球在p hl 11 缓冲液中振荡1 2 h 后的质量及堆密度变化 如表3 - 6 所示。在1 nn a c i ，1 nk c i ，1 nn a h c 0 3 水溶液中振荡1 2 h 后的质量及堆密度 变化如表3 7 所示。 微球在以上处理后质量和堆密度最大变化率小于3 ，基本保持不变。可见用冷冻 物理交联法制备的聚乙烯醇微球具有相当好的化学稳定性，可在体内胃肠道中保持稳定不 被分解。 第三章低温物理交联法制备的聚乙烯醇微囊的膜通透性、强度及化学稳定性研究 表3 6 微球在p h1 11 缓冲液中振荡1 2 h 后的质量及堆密度变化 缓冲液d h 值 l3 57 9 1 1 堆密度 处理前 1 0 6 处理后 l0 51 0 41 0 510 410 5i 0 3 ( g m 1 ) 变化率 一0 9 4 1 8 9 0 9 4 1 8 9 0 9 4 2 8 3 处理前 1 5 4 质量( g )处理后 1 ，5 31 5 01 5 21 5 31 5 21 5 0 变化率 一o 6 5 2 。6 0 1 3 0 o 6 5 1 3 0 一2 6 0 表3 7 微球在几种无机盐水溶液中振荡1 2 h 后的质量及堆密度变化 堆密度( g m 1 )质量( g ) 盐溶液 处理前处理后变化率处理前处理后变化率 1 n n a c l1 0 50 9 4 15 21 - 3 0 1 n k c l1 0 61 0 6 - 4 ) 1 5 41 5 30 6 5 1 nn a h c o t10 50 9 4 1 5 11 9 5 五、微球的形态结构观察 从图3 1 1 可见，用低温物理交联法制备的聚乙烯醇微球为有较好球形的水凝胶。 从图3 1 2 ，3 1 3 ，3 1 4 ，3 1 5 可见，聚乙烯醇微球表面凹凸不平。聚乙烯醇浓度越 大，表面越密实。较高倍数显微照相显示微球表面布满微孔。 从图3 - 1 6 聚乙烯醇微球的切片观察可见，微球内部多为带状条纹。 图3 - 11 未染色1 2 聚乙烯醇空白微囊的光学显微照相( 放大3 5 0 倍) 第三章低温物理交联法制备的聚乙烯醇微囊的膜通透性、强度及化学稳定性研究 图3 1 2 染色1 2 聚乙烯醇空白微囊表面形态的光学显微照相( 放大2 8 0 0 倍) 图3 1 3 染色8 聚乙烯醇空白微囊表面形态的光学显微照相( 放火2 8 0 0 倍) 图3 一1 4 染色1 4 聚乙烯醇空白微囊表面形态的光学显微照相( 放大2 8 0 0 倍) 第三章低温物理交联法制备的聚乙烯醇微囊的膜通透性、强度及化学稳定性研究 图3 1 5 染色1 2 聚乙烯醇空白微囊表面形态的光学显微照相( 放大4 2 0 0 倍) 图3 - 1 6 染色1 2 聚乙烯醇空白微囊内部形态的光学显微照相( 放大2 1 0 0 倍) 六、聚乙烯醇微囊与a p a 微囊机械强度的比较 取2 0 4 0 目聚乙烯醇空微囊与a p a 空微囊各1 0 0 颗于5 0 m l 三角瓶中，加入1 5 0 颗直 径5 m m 的玻璃小珠，5 m l 蒸馏水，1 8 0 r p m ，3 7 。c ，摇振2 4 h 。于显微镜下观察微囊的完整 性，比较两者的机械强度。结果如图3 一1 7 所示。 由图3 - 1 7 可见，在以上测试条件下，a p a 微囊已完全破碎，而聚乙烯醇微囊的破碎 率仅为3 。可见冷冻法物理交联聚乙烯醇微囊的机械强度远大于a p a 微囊。 4 第三章低温物理交联法制各韵聚乙烯醇微囊的膜逶透性、强度发化学稳定性研究 图3 1 7 ，聚乙烯醇空微囊与a p a 空微囊在相同机械压迫f 的破损率比较 本章小结 1 、测定不同聚乙烯醇浓度微球的含水量及堆密度，结果显示微球中水含量相当高( 8 0 ) ，其堆密度与水接近。聚乙烯醇浓度增大，微球的堆密度稍有增大，含水量 稍有降低，但变化不大。 2 、聚乙烯醇浓度增大，机械强度增大。聚乙烯醇浓度在1 0 以上具有良好的机械强 度。聚乙烯醇浓度在1 2 以上时取1 0 0 颗微球( 2 0 4 0 目) 置于5m ih 2 0 ，1 8 0 r p m ， 3 7 0 c 振荡8 h 无破损。 3 、添加剂海藻酸钠浓度增大，微球的堆密度稍有增大，含水量稍有降低，但变化不 大。当海藻酸钠浓度从0 增至2 时，其堆密度和含水量的变化不超过4 。添加 海藻酸钠不会降低微球的机械强度。 4 、低温交联聚乙烯醇微球对尿素、尿酸、肌酐和维生素b ：有很好的通透作用。尿素 能在l m i n 内完全通透微球，肌酐能在3 m i n 内完全通透微球，尿酸能在1 0 m in 内 完全通透微球，维生素b 。能在2 0 m i n 内完全通透微球。 5 、低温交联的1 2 聚乙烯醇微球在p h1 1l 缓冲液和1 nn a c i 、i nk c l 、1 nn a h c 0 1 水溶液中振荡1 2 h 后的质量及堆密度变化小于3 ，基本保持不变。可见用低温 物理交联法制备的聚乙烯醇微球具有相当好的化学稳定性，可在体内胃肠道中保 4 2 第三章低温物理交跌法制备的聚乙烯醇微囊的膜通透性、强度硬化学稳定性研究 持稳定不被分解。 6 、三维视频显微照相系统显微成像观察低温物理交联法制备的聚乙烯醇微球为有较 好球形的水凝胶，表面凹凸不平、布满微孔。聚乙烯醇浓度越大，表面越密实。 微球内部为带状条纹。 7 、相同机械压迫下比较，当a p a 微囊破碎率达1 0 0 时，聚乙烯醇微囊的破碎率仅为 3 。低温物理交联聚乙烯醇微囊的机械强度远大于a p a 微囊。 8 、以上工作显示低温物理交联法制备的聚乙烯醇微球有相当好的机械强度、通透性 及化学稳定性。用于脲酶基因工程菌的包埋及包埋后口服治疗尿毒症有很好的可 行性。 第必章低温物理交联法制备的聚乙烯酵包菌微囊的性能 第四章低温物理交联法制备的聚乙烯醇包菌微囊的性能 4 1 引言 我们研究了聚乙烯醇包菌微囊在不同包埋条件下及不同环境中的分解尿素活性及稳 定性，由此选择最佳的包埋条件，考察包菌微囊在人体内的活性稳定性。 一、实验试剂与仪器 聚乙烯醇( 聚合度2 4 5 0 5 0 海藻酸钠 司班8 0 机油 氯化钠 磷酸氢二钾 氢氧化钠 尿素 磷酸 二乙酰一肟 硫代氨基脲 无水硫酸镁 硫酸镍 胰蛋白胨 酵母浸粉 氨苄青霉素 葡萄糖 维生素b 1 2 4 2 实验材料与方法 醇解度9 8 9 9 ) 化学纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 化学纯 分析纯 化学纯 生化试剂 上海化学试剂公司进口分装 永嘉精细化工二厂 天津市化学试剂三厂 市售 天津大学科威公司 天津市化学试剂六厂 天津市科密欧化学试剂开发中一巳 沈阳化学试剂厂 天津市化学试剂三厂 北京化学试剂公司 北京化工厂 上海试剂四厂 天津市耀华化工厂 北京奥博星生物技术责任公司 北京奥博星生物技术责任公司 b e b c o 分装 天津市化学试剂三厂 天津市东方卫生材料厂 第四章低温物理变联法制器的聚乙烯醇包菌微囊的性能 磷酸氢二钾分析纯 磷酸二氢钠分析纯 磷酸氢二钠分析纯 s h b i i i 型循环水真空泵 b l 6 1 0 电子天平 万分之一天平 t g l 1 6 b 台式离心机 m o t o r sm - - 6 2 0 0 c 超净台 高压灭菌锅 电动搅拌器 t h z c 恒温振荡器 p h s 一2 5 型酸度计 7 8 1 磁力加热搅拌器 u v 一9 l0 0 紫外可见分光光度计 c r 2 2 g 高速离心机 天津市化学试剂六厂 天津石英厂霸州市化工分厂 天津市化学试剂六厂 郑州市上街华科仪器厂 德国s a r t a r t i u s 德国s a r t a r t i u s 上海安亭科学仪器厂 台湾科学公司 上海嘉定安亭科学仪器厂 天津市威华实验仪器厂 江苏太仓市实验设备厂 上海伟业仪器厂 江苏金坛市医疗仪器厂 北京 日本h i t a c h i 二、实验方法 微囊的制备、菌分解尿素活性的测定、微囊含水量和堆密度的测定、微囊机械强度的 测定、微囊化学稳定性的测定如第二章、第三章“实验方法”所述。 4 3 结果与讨论 一、包菌率 菌的包埋：1 9 湿菌，2 0 m l1 2 p v a 。 将机油微囊体系滤出微囊，以测定菌分解尿素用反应介质沈涤微囊，洗出液与机油 混浊液混合，分液漏斗中静置分层，水相中加反应介质一尿素至尿素浓度为1 0 m g m l ，总 体积为1 5 0 m l a 测定l h 后未被包埋菌分解尿素量m i 。另取o 2 9 自由菌，加入1 5 0 m l 尿素 浓度为1 0 m g m l 的反应介质一尿素溶液，测定1 h 后分解尿素量m 2 ，作为标准。计算包菌 率。 第四章低温物理交联法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 包菌率= 1 - ( m l m z ) + o 2 1 o ) 4 1 0 0 测定结果：m 1 - 9 3 2 4 9 ，m 2 = 9 9 1 5 9 。计算包菌率为8 1 2 。 二、空白微囊和尿素的作用 菌的包埋：1 2 湿菌，2 0 m l1 2 p v a 。 取包有o 1 9 湿菌的微囊及等量空白微囊置于1 0 m l 1 0 m g m l 尿素- 反应介质中，测定 分解尿素活性。 由图4 1 可见，空白微囊除了因通透作用引起尿素浓度降低外，对尿素浓度基本上无 影响。包埋后菌有很高的分解尿素活性，可见该包菌过程是无毒的。 图4 - 1 等量包菌微囊及空白微囊对尿素浓度的影响随时间的变化 。 占 世 蛏 憔 嗤 02 0 4 06 08 01 0 01 2 0 时间( r a i n ) 三、包埋后微囊中菌的泄漏情况 菌的包埋：1 9 湿菌，2 0 m l1 2 p v a 。 将微囊置于无菌水中浸泡振荡2 4h ，隔8h 换水一次。测定微囊中菌分解尿素的活性变 化。 微囊分解尿素的活性变化：o 1 9 湿菌分解1 0 m l 1 0 m g m l 尿素的活性 由图4 2 可见，浸洗后微囊分解尿素的活性并未降低，相反还有所提高。这可能是浸 洗过程中提高了微囊的通透性引起的。由以上结果基本可认为无菌的泄漏，菌在微囊内可 稳定存在。 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 o 第四章低温物理交联法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 图4 - 2 浸洗前后等量微囊对尿素浓度的影响随时间的变化 。 目 、 3 瑙 爱 懈 隧 f 磊磊司 l 量选煎1 0l o2 03 04 0 时间( m i n ) 四、添加剂海藻酸钠浓度对包菌微球分解尿素性能的影响 菌的包埋：1 9 湿菌，2 0 m l1 2 p v a ，改变海藻酸钠浓度( o ，0 5 ，1 o ，1 5 ， 2 0 ) 。 我们比较了新鲜制备的含o 1 9 湿菌的聚乙烯醇微囊分解2 0 m 1 1 0 m g m l 尿素8 m i n 与保 存4 5 天后微囊活性及活性丧失情况。 图4 - 3 海藻酸钠浓度对包菌微囊分解尿素的活性的影响( 新鲜制备) 024681 0 1 21 41 6 1 82 0 时间( r a i n ) 海藻酸钠浓度 由图4 3 可见对于新鲜制备的聚乙烯醇微囊，添加海藻酸钠反而会降低菌的活性， 特别是海藻酸钠浓度增至10 以上时菌活性的降低更为明显。这可能是海藻酸钠浓度的 增大引起含水量的降低和堆密度的增大，导致通透性下降，影响尿素进入微囊内与菌作用 4 7 o 9 8 7 6 5 4 3 2 1 o 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 o ， 一_【是3趟矮憾噬 第四章低温物理交联法制备的聚乙烯醇包菌微囊的性能 的速度。 图4 - 4 海藻酸钠浓度对包菌微囊后分解尿素的活性的影响( 保存4 5 天) ： 瓷 3 趟 袋 懈 嗤 度 表4 - 1 保存4 5 天的含oi g 湿菌的微球分解2 0 r a l 1 0 m g m l 尿素4 r n i n 后 与新鲜制备的微球活性比较及活性丧失情况 由图4 - 4 及表4 1 可见，对于经长期保存( 本实验中为4 5 天) 后的聚乙烯醇微囊， 微囊内菌的活性有不同程度的下降。添加海藻酸钠浓度为o 1 一0 5 时菌的活性下降较未 添加海藻酸钠者小，其中海藻酸钠浓度为o 5 时菌的活性下降最小( 仅下降1 8 ) ，且 此时菌的活性最大。海藻酸钠浓度继续增大( 1 0 一1 ，5 ) 菌的活性下降迅速加快，较未 添加海藻酸钠者大。这可能是因为海藻酸钠是线性多糖，长期保存过程中可作为营养成分 供给予微囊内的菌，使菌能保持较好活性。但海藻酸钠浓度过高也降低微囊了的通透性， 结果表现为微囊内菌活性的下降。 结论：加入适量的海藻酸钠添加剂有助于微囊中工程菌活性的长期保存。适合的海藻 酸钠浓度为0 1 一0 5 。海藻酸钠浓度过高，无论在瓤鲜制备还是在长期保存中都会引起 微囊活性的明显降低。 0 g 8 7 6 5 4 3 2 1 0 第四章低温物理交联法制备的聚乙烯醇包菌微囊的性能 五、包菌量对包菌微球性能的影响 菌的包埋：2 0 m l1 2 p v a ，o 5 海藻酸钠浓度，改变菌的包埋量( 5 m g 菌儋微囊 2 0 0 m g 菌儋微囊) 。 ( 一) 不同包菌量的微囊制备的产率及物理性能比较 机械强度测试：取l o o 颗微囊于一5 0 m l 三角瓶中，加入1 0 0 颗直径5 m m 的玻璃小珠 5 m l 蒸馏水，1 8 0 r p m ，3 7 0 c ，摇振8 h 。于显微镜下观察微囊的完整性。 表4 2 不同包菌量的微囊制备及物理性能比较 由表4 - 2 可见，包菌量从5 m g 菌g 微囊至1 5 0 m g 菌g 微囊，微囊制备仍有很好的产 率和机械强度，堆密度和含水量的变化很小( 小于5 ) ，说明菌和聚乙烯醇有很好的融 合性。当包菌量继续增大( 2 0 0 m g 菌g 微囊) ，混合液粘度过大，不利微囊的制备，成球 率大大降低。 ( 二) 包菌量对包菌微球分解尿素性能的影响 测定活性溶液为2 0 m l1 0 m g m l 尿素- 反应介质。 由表4 3 和图4 5 可见，包菌量越大，等量微囊分解尿素的能力越大。从实验结果看， 包菌量为1 5 0 m g 菌撞微囊时，微囊有很好的分解尿素作用。包菌量包菌量继续增大( 1 5 0 r a g 菌g 微囊) ，混合液粘度过大，不利微囊的制备，成球率大大降低。 故选用包菌量为1 5 0 m g 菌，叠微囊 4 9 第四章低温物理交联法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 表4 - 3 等量微囊分解尿素量( m g g 微囊) 图4 - 5 不同包菌量的1 9 微囊分解尿素量随时间变化曲线 4 0 0 3 5 0 ；3 0 0 。2 5 0 艘2 0 0 嗟1 5 0 蒌1 0 0 5 0 o 025 1 02 0 3 0 4 0 6 0 9 0 反应时间( m i n ) 包菌量 ( m g g 微囊) 七、微囊的化学稳定性 ( 一) 不同p h 对包菌微囊及自由菌分解尿素活性的影响 将包菌微囊置于不同p h 缓冲反应液中测定分解尿素能力，并与自由菌进行比较。 微囊的制备：5 0 m g 菌幢微囊，2 0 m l1 2 聚乙烯醇，o 0 5 海藻酸钠。 不同口h 缓冲反应液的配制：取反应介质配制0 2 n n a 2 h p 0 4 溶液、o 2 n n a h 2 p 0 4 溶 液，加尿素至1 0 m g m l 。用上述溶液配制p h 5 ，6 ，7 ，8 ，9 的缓冲反应液。 对照：取等量的1 0 m g m l 尿素反应介质测定微囊分解尿素能力。 1 、不同d h 对自由菌分解尿素活性的影响：取自由菌5 0 m g ，加入2 0 m l 缓冲反应液， 18 0 r p m ，3 7 0 c 摇振。测定尿素浓度随时间变化。 第四章低温物理交联法制备的聚乙烯酵包菌微囊的性能 图4 - 6 自由菌在不同p h 缓冲反应液中对尿素分解作用随时间的变化曲线 2 e 高 e v 魁 疑 艇 峰 051 02 03 04 06 0 振荡时间( m i n ) 反应缓冲液 p h 值 2 、不同p h 对微囊分解尿素活性的影响：取含菌5 0 m g 的微囊，加入2 0 m l 缓冲反应 液，8 0 r p m ，3 7 0 c 摇振。测定尿素浓度随时间变化。 图4 - 7 包菌微囊在不同p h 缓冲反应液中对尿素分解作j = j 随日寸间的变化曲线 ： e 刍 官 v 划 装 船 滢 05l o2 03 04 05 06 0 振荡时间( m i n ) 反应缓冲液 p h 值 由4 - 6 ，4 - 7 可见，包菌微囊在不同p h 缓冲反应液中对尿素分解作用的变化与自由菌 类似。缓冲溶液p h 值为6 7 时分解能力最强。包菌微囊在缓冲溶液中的分解尿素能力 远高于在非缓冲的反应液中。这可能是由于实验中所用菌还为具备分解利用氨的功能，故 而在分解尿素的过程中释放出氨，使溶液p h 值显著升高，影响菌的活性所致。缓冲溶液 p h 值为5 时可能导致部分菌的死亡，导致菌分解尿素的活性下降。 0 8 6 4 2 o 第四章低温物理交联法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 ( 二) 包菌微囊在较高浓度盐溶液中的分解尿素活性 将包菌微囊置于较高浓度盐溶液中( 胃肠道中主要的无机盐n a c i 、k c i 、n a h c 0 3 ) 测定分解尿素能力。 微囊的制各：5 0 m g 菌g 微囊，2 0 m l1 2 聚乙烯醇，o 0 5 海藻酸钠。 较高浓度盐反应液的配制：取反应介质分别配制o 5 nn a c l ，o 5 nk c i ，o 5 nn a h c 0 3 1 n n a c l ，1 n k c l ，1 n n a h c 0 3 溶液，加尿素至1 0 m g m l 。 图4 - 8 包菌微囊在1 n 盐反应液中对尿素分解作用随时间的变化曲线 = e e 一 划 避 懈 疃 051 02 03 04 0 5 06 0 振荡时r n j ( m i n ) 图4 - 9 包菌微囊在o 5 n 盐反应液中对尿素分解作用随时间的变化曲线 ： 皇 5 刨 蠖 懈 噻 051 02 03 04 05 06 0 振荡时间( m i n ) 分解尿素活性的测定：取含菌5 0 m g 的微囊，加入2 0 m l 盐反应液，8 0 r p m ，3 7 。c 摇 振。测定尿素浓度随时间变化。 5 2 o 8 6 4 2 0 第删章低温物理交联法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 对照：取等量的1 0 m g m l 尿素一反应介质测定微囊分解尿素能力。 从图4 - 8 ，4 - 9 可见，微囊中的菌在较高浓度盐溶液中仍有较好活性。在o 5 nn a c i ， o 5 nk c ，o 5 n n a h c 晚中基本上仍保持原有活性。 从以上实验结果可知，微囊具有良好的化学稳定性，在人体肠道中即使是在水电解质 发生紊乱的病人体内仍可维持很好的活性。 八、聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊与其他吸附剂的分解尿素能力的比较 目前常用的清除尿素吸附剂有氧化淀粉和包含脲酶一磷酸锆的微囊，但这两者的吸附 性能都不高。清除人体总体液中的4 0 9 尿素需3 8 8 9 氧化淀粉或1 2 1 2 9 包含脲酶一磷酸锆 的微囊 3 1 ，而用l g 我们制备的聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊在2 m i n 内即可分解 3 9 4 3 m g 尿素，也就是说约l o g 聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊即可在2 0 m i n 内分解掉 4 0 9 尿素。见图4 1 0 。 图4 1 0 聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊与氧化淀粉和包含脲酶一磷酸锆的徽囊 消除4 0 9 尿素所需吸时寸剂量的比较 可见我们制备的聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊分解尿素的性能远优于其它吸附 剂，预计用少量吸附剂即可达到较好疗效。但实验中所用基因工程菌在分解尿素过程中释 放出大量的氨，对人体不利。目前已针对该问题进行有效改进。预计将来还可通过转入其 它基因用于吸附分解尿毒症的其他毒素如尿酸、肌肝等。 第四章低温物理交瞒法制各的聚乙烯醇包菌微囊的性能 本章小结 1 、经测定微囊的包菌率为8 1 2 ，空白微囊除了因通透作用引起尿素浓度降低外，对尿 素浓度基本上无影响。包埋后菌有很高的分解尿素活性，可见该包菌过程是无毒的。 经浸洗后微囊分解尿素的活性并未降低，相反还有所提高。菌在微囊内可稳定存在。 2 、加入适量的海藻酸钠添加剂有助于微囊中工程菌活性的长期保存。适合的海藻酸钠浓 度为o 1 一0 5 。海藻酸钠浓度过高，无论在新鲜制各还是在长期保存中都会引起微 囊活性的明显降低。 3 、包菌量越大，等量微囊分解尿素的能力越大。包菌量为1 5 0 m g 菌幢微囊时，微囊有很 好的分解尿素作用，微囊制备仍有很好的产率和机械强度。 4 、微囊具有良好的化学稳定性。包菌微囊在不同p h 缓冲反应液中对尿素分解作用的变 化与自由菌类似。缓冲溶液p h 值为6 7 时分解能力最强。包菌微囊在缓冲溶液中的 分解尿素能力远高于在非缓冲的反应液中。包菌微囊在较高浓度盐溶液( o 5 n n a c l ， 0 5 nk c i ，0 5 nn a h c 0 3 ) 中基本上仍保持原有活性。推断包菌微囊在人体肠道中即 使是在水电解质发生紊乱的病人体内仍可维持很好的活性。 5 、由以上实验结果说明，低温物理交联法制备聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌具有很好的 包菌率和稳定性。最佳的包埋条件为0 5 海藻酸钠、包菌量1 5 0 r a g 菌g 微囊。 6 、我们制备的聚乙烯醇包埋脲酶基因工程菌微囊分解尿素的性能远优于其它吸附剂，清 除人体总体液中的4 0 9 尿素需3 8 8 9 氧