水稻NERD途径关键基因OSNERD1的功能研究.doc

水稻NERD途径关键基因OSNERD1的功能研究 陈雄平 （华中农业大学作物遗传改良重点实验室，武汉） 摘要：（）是一种存在于植物中转录水平的基因沉默（，）机制，需要、及等多种蛋白介导同源位点的甲基化。拟南芥中发现了独立于的一条新途径，其关键蛋白为。能够与蛋白相互作用，产生的s分子，介导某些新近进化基因的甲基化，并影响其组蛋白修饰。序列同源比对结果表明，水稻中存在有与同源非常高的蛋白，分别命名为和。体外结合试验结果表明，的结构域能够结合，参与下游基因的表观调控。对突变体中一些转座子的检测表明，该基因的突变会影响转座子的表达量变化及其表观修饰，并且这些转座子集中在家族，g家族转座子在营养核中表达活跃，可能与的花粉不育相关。 关键词：；转座子；甲基化 ：；：A：0439114（15）040988-05 DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.04.057 ： 作者简介：陈雄平（），男，湖南娄底人，在读硕士研究生，研究方向为水稻表观学，（电话）（电子信箱）。 是一种广泛存在于动植物中非编码（n），在调控基因表达中发挥着重要的作用-。其中，（）是联系表观修饰与s的一条重要途径。通过产生的s介导起始位点及其同源位点基因组的甲基化来实现对基因表达的调控，该过程依赖和。水稻（Oryzasative）中也发现了一些同样可以介导内源性同源位点的甲基化。此外，拟南芥中高通量数据中也发现一些途径的靶位点，不仅产生的，还可以产生的，这些发现使介导的甲基化更为复杂和多变。拟南芥蛋白的发现给介导的甲基化和组蛋白修饰变化的研究提供了新方向。的作用依赖于以及，而及目前只发现其在外源途径中发挥着作用。因此，通过以外的途径对基因组中的基因进行调控表达，且该途径可能影响植物性状和对外界环境适应性的表观变异与遗传。 途径在作物中是否保守目前仍然未在其他植物中报道，本研究通过序列比对在水稻中发现了两个与同源的蛋白，一个为突变体，突变体表型表现为花粉不育，其转座子表达量发生了改变，相应的甲基化修饰以及组蛋白修饰也发生了改变。 材料与方法 材料 突变体研究使用的突变体为韩国突变体，编号为，插入位点为第一个外显子，材料背景为。 引物研究所用引物见表。 方法 序列比对及进化树进化树分析中水稻的蛋白质序列于（：），其他各种植物的蛋白序列网站（：），采用软件进行多序列比对，并用E构建进化树。 利用引物、检测基因插入位点后的表达量，具体步骤见参考文献。 体外组蛋白结合试验利用引物扩增的结构域区域，扩增片段经及酶切后连入载体表达，体外组蛋白结合试验参考文献。 蛋白用适当浓度的分离胶（）进行分离，并转膜至膜（公司），蛋白电泳和转印系统为公司的?誖（），具体过程参见说明书。转膜完成后，将膜用浸入牛血清白蛋白的磷酸缓冲液（）封闭或过夜，取出后弃封闭液。按照的稀释比例在的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中加入一抗，、抗体购自公司以及公司。室温下温育或过夜，再经次溶液和溶液（每溶液添加的吐温）洗膜（每次），用溶液按照的比例加入二抗，室温下温育，次溶液和溶液洗膜（每次），洗膜后用显影，具体操作可依照说明书。 甲基化敏感的酶切取的突变体及野生型（）抽穗时期水稻大样，每体系加单位的甲基化敏感酶（，），酶切以上，然后变性，稀释至。取体系进行普通程序，引物设计位点为关注位点的两侧。 染色质免疫沉淀取突变体及野生型（）抽穗时期的叶片进行染色质免疫沉淀。将上述材料用甲醛溶液真空交联，添加甘氨酸至终浓度，抽真空以终止交联。交联好的样品用灭菌水洗两次，吸干表面水分，经液氮磨碎后用双层（）过滤两次并离心，超声波破碎至片段主带为左右，然后用孵育，洗去与非特异性结合的染色质，随后加入特异性抗体孵育过夜，经不同缓冲液洗涤后，解交联过夜并纯化沉淀。采用方法检测染色质修饰情况，引物为、，具体试验步骤参考文献。 结果与分析 是的同源蛋白 截至目前，仅在拟南芥中报道了的存在10。序列比对分析表明，其他植物如大豆、玉米等也存在类似拟南芥蛋白，这证明在植物中是广泛存在的（图）。水稻与拟南芥相对应出现了两个与同源的蛋白，分别命名为及。 的结构域结合能力的分析结果 结构域是表观修饰中重要的一种结构域，能够识别的甲基化状态。根据的结合特异性可分为2个大类，分别为能够结合未甲基化以及甲基化的组蛋白（），已报道拟南芥结合。对以及进行序列比对可发现个同源蛋白在结构域上有着很大的相似性。由此，本研究表达了的原核蛋白（图），进一步的体外组蛋白结合试验证明了的结构域能够结合（图），与拟南芥中的不同。的结构域能够识别，甲基化状态的改变会进一步改变染色质的结构，影响基因的表达，这证明可能参与了基因表达的表观调控。 突变体的分离和鉴定 从韩国突变体库中购买并检测到一个编号为的插入突变体（图），所用的引物为（图）。设计引物及检测插入前后基因的表达量，插入位点前不表达，插入位点后的部分却是表达的（图）。检测基因的表达量发现该插入可导致插入后的基因部分超表达（图）。该插入影响了基因的表达，因此可作为一个突变体材料挖掘基因的功能。 基因在水稻中的表达 对基因在水稻中进行表达谱的检测，基因在水稻的胚乳中表达量是比较高的（图）。此外，在抽穗期间的叶片中可以发现基因表达水平也比较高（图）。由此推测基因可能在水稻的生殖发育以及胚乳发育过程中起作用。 基因突变对花粉育性的影响 大田种植观察到突变体不育，进一步花粉碘染试验发现突变体花粉不育（图）。统计结果表明，野生型可育，杂合体可育，杂合体半不育也进一步说明了影响花粉的育性。花粉的石蜡切片研究表明，突变体花药发育不正常，形态发生了改变；花粉粒也比野生型的少而且小（图）。 突变对转座子的表达及其表观修饰的影响 水稻与拟南芥相比存在有大量的转座子元件且拟南芥中的突变影响下游转座子基因的修饰，因此挑选了一些在甲基化酶突变体中表达受到影响的转座子，表达量检测结果表明，一些转座子在抽穗期叶片中表达量有较大变化（图）。突变下游变化最大的转座子属于转座子家族，进一步挑选了一些其他的转座子检测其表达量，绝大部分该类型转座子表达量有了明显变化（图）。此外，相应位点的、以及也有明显变化（图）。对其中变化最大的转座子检测其甲基化修饰，引物位点的甲基化有变化（图）。因此，突变能够影响转座子的表达，这种影响是通过组蛋白修饰及其甲基化修饰的改变来进行的。综上所述，突变影响转座子的表达及其表观修饰，而在这些差异的转座子中，转座子占据了比较重要的一部分。 小结与讨论 途径鲜有在单子叶模式植物中报道。本研究在单子叶模式植物水稻中证明单子叶植物中同样存在蛋白，由此可见蛋白广泛的存在于单子叶及双子叶植物中。对转座子的染色后免疫沉淀试验以及甲基化敏感的限制酶切技术分析，从下游基因的水平验证了突变能够影响转座子的表观修饰。同时，蛋白的结构域能够结合甲基化，更进一步表明基因参与水稻的表观调控。 在一些影响甲基化修饰或者途径中关键基因的一些突变体中，花粉不育是一个比较普遍的现象，。雄配子体形成即花粉的形成在植物表观遗传中有着非常重要的意义，决定了父代的何种表观修饰能够遗传给后代。拟南芥甲基化测序结果发现营养核与精核、小孢子细胞在甲基化上差异明显。这些差异区域左右集中在类型的转座子，上为转座子元件。由此可见家族的转座子在花粉发育中占据着十分重要的作用。 突变体中许多家族的转座子表达量及表观修饰出现了明显的变化，由此推测可能通过影响转座子表达来影响水稻花粉的育性。突变体相对于拟南芥中该突变体有