（中医骨伤科学专业论文）喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价.pdf

t、o厶。一)亡u c u 2 1 2 2 2 2 3 献 述 文 一 综 论 论 考 谢 图 题 讨 结 参 致 附 课 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 中文摘要 目的：探讨可能成为骨科外固定材料石膏绷带、小夹板等的替代物葡聚糖型聚氨酯的生 物安全性，按照国家标准医疗器械生物学评价标准的一系列实验要求对其进行早期 生物学评价，为临床应用提供可靠的理论依据。 方法：按照g b t 1 6 8 8 6 医疗器械生物学评价第二、五、十、十一部分的标准要求，结合 葡聚糖型聚氨酯预期的特定用途，选取合适样本进行合理实验：急性经皮毒性实验、皮 肤刺激实验、致敏实验及体外细胞毒性实验。急性经皮毒性实验：采用浸提液急性经皮 毒性实验方法，观察豚鼠敷贴后7d 内的生活习性、体重的变化，并且给予行肝脏病理 组织学检查，判断材料的毒性；皮肤刺激实验：采用直接接触法，观察白发家兔接触后 3 d 的皮肤变化，计算原发性刺激指数( p i i ) ，评定刺激的反应类型；致敏实验：采用最 大剂量致敏法，观察激发后浸提液对豚鼠的致敏性，计算出致敏率，评定致敏等级；体 外细胞毒性实验：采用m t t 法，观察其对l - 9 2 9 小鼠成纤维细胞生长、增殖的影响，测 定加样后的2 、4 、7 d 的o d 值，计算r g r ，评定细胞毒性等级。 结果：( 1 ) 急性经皮毒性实验：动物的活动表现均无明显差异，皮肤无红斑、水肿，毛 发通顺，亮泽，不干枯，眼睛及粘膜无变化，反应灵敏，尿液清晰，大便呈粒状无异常， 肝脏的h e 染色未见有明显差异，实验组与空白组之间的体重无差异( p o 0 5 ) ，表明了 该材料的浸提液未对白化豚鼠产生毒性反应；( 2 ) 皮肤刺激实验：在除去接触物后0h 皮肤破损组有两只家兔勉强可见有红斑，p i i 等于0 3 3 ，2 4h 后仍未褪去，在4 8h 后 见一只家兔的皮肤已恢复正常，p i i 等于0 1 7 ，在7 2 h 观察另外一只家兔皮肤亦恢复， 无红斑水肿，p i i 等于0 ，p i i 均在0 0 4 9 ，表明了改材料对破损皮肤具有轻微的刺激 作用；( 3 ) 致敏实验：实验组动物在激发后各时点均未观察到红斑、水肿现象，评分为 0 ，致敏率不为0 ，与空白组无差异，与阳性组存在显著性的差异，表明该材料无致敏性； ( 4 ) 体外细胞毒性实验：5 0 、1 0 0 浸提液的实验组与空白组相比较细胞测得o d 值无 明显的差异，相对增值率相比较未见有差异，与阳性组向比较存在显著差异，细胞毒性 1 级、正常，表明对l - 9 2 9 细胞无毒性作用。 结论：葡聚糖型聚氨酯无毒、无刺激、无致敏和未对细胞增殖产生影响，具有良好的生 物安全性，可作为无毒性材料用于临床。 关键词：葡聚糖型聚氨酯，生物学评价，急性经皮毒性实验，致敏实验， 皮肤刺激实验，体外细胞毒性实验 b i o l o g i c a le v a l u a t i o no fs p r a ye x t e r n a lf i x a t i o n m a t e r i a l s de x t r a n b a s e dp o l y u r e t h a n e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oe x p l o r et h ed e x t r a n - b a s e dp o l y u r e t h a n eb i o s e c u r i t yt h a tm i g h ts u b s t i t u t e p l a s t e rb a n d a g e 、s p l i n t sf o ro r t h o p e d i ce x t e r n a lf i x a t i o nm a t e r i a l s i na c c o r d a n c ew i t hn a t i o n a l s t a n d a r d s - - b i o l o g i c a le v a l u a t i o no fm e d i c a ld e v i c e ss t a n d a r d r e q u i r i n g as e r i e so f e x p e r i m e n t sc a r r yo u ti t se a r l yb i o s a f e t ye v a l u a t i o nf o rc l i n i c a la p p l i c a t i o nt op r o v i d er e l i a b l e t h e o r e t i c a lb a s i s m e t h o d s ：a c c o r d i n gt og b t16 88 6 2 、5 、10 、1 1i nn a t i o n a le v a l u a t ec r i t e r i ao fm e d i c a l d e v i c e sm a t e r i a l s ，w es e l e c t e das e r i a lt r i a li nv i v ot oa s s e s st h e s a f e t yo fd e x t r a n b a s e d p o l y u r e t h a n ec o m b i n e dw i t hd e x t r a n b a s e dp o l y u r e t h a n ei n t e n d e df o rap a r t i c u l a rp u r p o s e i n t h es t u d y , f o u rm e t h o d si n c l u d e da c u t ed e r m a lt o x i c i t yt e s t ，v i t r oc y t o t o x i c i t yt e s t ，i r r i t a t i o n t e s ta n dt h eg u i n e ap i gm a x i m i z a t i o nt e s t a c u t ed e r m a lt o x i c i t yt e s t ：u s i n gt h ee x t r a c to f a c u t e d e r m a lt o x i c i t yt e s tm e t h o d ，o b s e r v e di ng u i n e ap i g s7da f t e re x t e m a la p p l i c a t i o no fl i f e h a b i t s 、w e i g h tc h a n g e s ，a n dt ol i n et h el i v e rh i s t o l o g yw a sa l s oe x a m i n e dt od e t e r m i n et h e t o x i c i t yo fm a t e r i a l s ；s k i ni r r i t a t i o nt e s t ：u s i n gad i r e c tc o n t a c tm e t h o d ，o b s e r v e ds k i nc h a n g e s a f t e rc o n t a c t e da f t e r3do nw h i t eh a i rr a b b i t ，c a l c u l a t e do fp r i m a r ys t i m u l a t i o ni n d e x ( p i i ) ， a s s e s s m e n to fs t i m u l a t i o nt y p e ；s e n s i t i z a t i o ne x p e r i m e n t s ：u s i n gt h em a x i m u md o s e o f a l l e r g e n ，o b s e r v e dt h es e n s i t i z a t i o na f t e rs t i m u l a t e dg u i n e ap i g sw i t he x t r a c t s ，c a l c u l a t e d s e n s i t i z a t i o nr a t e ，a s s e s s e dt h el e v e lo f s e n s i t i z a t i o n ；c y t o t o x i c i t yt e s t ：u s i n gm t r , o b s e r v e d c e l lg r o w t h 、p r o l i f e r a t i o no nt h el - 9 2 9m o u s ef i b r o b l a s t ，a f t e r2 、4 、7dd o m e s t i c a t e dt h eo d v a l u e ，c a l c u l a t e dr g r ，a s s e s st o x i c i t yl e v e l s r e s u l t ：( 1 ) a c u t ed e r m a lt o x i c i t yt e s t ：t h ea c t i v i t i e so fa n i m a lh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e h es t a i n i n go fl i v e rw a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，a n db o d yw e i g h tw a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ee x p e r i m e n t a l g r o u pa n dn e g a t i v eg r o u p ( p 0 0 5 ) t h eo b s e r v e d d i a l o g u et o x i cr e s p o n s ed on o tp r o d u c ei nt h em a t e r i a le x t r a c t so fg u i n e ap i g s ( 2 ) d e r m a l s e n s i t i z a t i o n ：t w or a b b i t sw e r eb a r e l yv i s i b l ee r y t h e m aa f t e rr e m o v i n gm a t e r i a li n0ha t b r o k e ns k i ng r o u p ，p 1 1w a s0 3 3 ，2 4hh o u r sa f t e rt h es t i l ls t r a i n e d ，s a war a b b i tr e t u m e dt o n o r m a li nt h e4 8 ha f t e rt h es k i n p 1 1w a so 17 a t7 2ha n o t h e ro b s e r v a t i o no far a b b i ts k i nt o r e c o v e r , n oe d e m a ，e r y t h e m a ，p 1 1w a s0 ，p 1 1w e r e0 0 4 9 ，i n d i c a t i n gt h a tt h em a t e r i a lh a da v e r ys l i g h tc h a n g es t i m u l a t i o n ( 3 ) s k i ni r r i t a t i o nt e s t ：o b s e r v e dp r i m a r yi r r i t a t ei n d e xi n r a b b i t sa td i f f e r e n tt i m e si sv e r ys m a l lr a n g e ( 0 - 0 4 9 ) as m a l la m o u n to fb r o k e ns k i ni s o b s e r v e de r y t h e m aw i t h i n4 8h ，b u tt h ep r i m a r yi r r i t a t ei n d e xi ss t i l l av e r ys l i g h te x t e n t ， e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，n o n i r r i t a t i n ge x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，n o n i r r i t a t i n g ；( 4 ) c y t o t o x i c i t y t e s t ：t h er e l a t i v ev a l u eo ft h er a t eo fc e l l sh a dn od i f f e r e n c ea m o n g5 0 ，1 0 0 e x t r a c to f 2 d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h e r ew e r es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e st ot h ep o s i t i v eg r o u p c e l lt o x i c i t ys1l e v e l 、e v a l u a t i o nn o r m a l n o n t o x i ce f f e c t o nl 9 2 9c e l l s c o n c l u s i o n ：as e r i e so ft h i ss t u d ys h o wt h a td e x t r a n b a s e dp o l y u r e t h a n ew i t han o n t o x i c ， n o n s t i m u l a t i n g ，n o n a l l e r g e n i c ，a n dh a v i n gn oe f f e c t o nc e l l p r o l i f e r a t i o n ，h a dag o o d b i o s e c u r i t y a n dc a nb eu s eo nc l i n i c a l k e y w o r d s ：d e x t r a n b a s e dp o l y u r e t h a n e ；a c u t ed e r m a lt o x i c i t yt e s t ；d e r m a l s e n s i t i z a t i o n ；s k i ni r r i t a t i o nt e s t ；c y t o t o x i c i t yt e s t 福建中医药大学硕士学位论文 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 前言 中医骨伤科具有悠久的历史，疗效又独特。早在公元前1 6 世纪殷商时期的甲骨文中就 有关于骨折的描述。以后黄帝内经阐发的肾主骨、肝主筋、脾主肌肉、以及气伤痛、 形伤肿等学说和论述奠定了中医骨伤科学的理论基础。在晋葛洪著肘后救卒方中首先 记载用竹片夹板固定骨折的方法：“疗腕折、四肢骨破碎及筋伤蹉跌方：烂捣生地黄熬之， 以裹折伤处，以竹片夹裹之。令遍病上，急缚，勿令转动。 可见在传统医学里非侵入性外 固定治疗骨折的方法很早就得到了重视，在以往的治疗中占着重要的地位。伴随建筑业和 交通业的发展，高能量的四肢、脊柱创伤发病率显著升高，使得侵入性外固定作用地位也 在不断的提高。创伤急诊病人的运输需要简易的固定，往往采用木板、夹板等工具，由于 固定不牢靠，不能有效稳定骨折，在转运的过程中容易导致出血增多，应用不当甚至可导 致骨筋膜室综合症等严重并发症。许多严重粉碎性骨折患者在进行手术治疗后仍需要辅助 一定的外固定矫形和维持保护内固定的作用。临床最常用的外固定材料是石膏绷带，但石 膏绷带存在诸多缺点，如操作程序复杂、时间长：制备过程中石膏粉外逸对皮肤、伤口刺 激性大，污染大；石膏密封，透气性差，易引起皮肤伤口污染，且不易观察皮肤及伤口情 况；硬度不够，致塑形时间长；传统石膏绷带一经打开后剩余石膏在短时间内凝固，造成 浪费等。虽然石膏绷带、夹板固定是骨折治疗中不可缺少的手段之一，但从生物力学和解 剖学的特点出发，传统的小夹板及石膏固定的治疗结果往往不能令人满意，并且并发症观 察不易。 良好的非侵入性外固定必须具备以下几个标准口5 ：l 、能达到良好的固定作用，对被固 定的肢体周围的软组织无损伤，保持损伤处的正常血运，不影响正常的愈合；2 、能有效的 固定骨折，消除不利于骨折愈合的旋、剪切和成角外力，使骨折端相对稳定，为骨折愈合 创造有利的条件；3 、对伤肢关节约束力小，有利于早期功能活动；4 、对骨折整复后的残 留移位有矫正作用。自二十世纪八十年代以来，国内外上一直致力于新材料的寻求，以替 代传统的固定材料。在此期间，高分子聚合物材料作为石膏代用品得到了很大的发展。国 内、外研究人员开发了多种多样的高分予外固定材料，如医用聚氨酯绷带、硅橡胶、形状 记忆聚合物等。尽管这些材料都具有良好的固定效果，但是在成本及操作上存在着一定的 困难。高分子材料的应用具有良好的固定效果，但是对环境造成负面影响，特别是通用的 有机高分子材料，尚待进一步证实，而且二者又都具有操作不便的特点，技术要求高，复 杂的颈部、胸部仍无法固定。总之非侵入性外固定材料具有向高分子材料发展的趋势，但 现有的非侵入性外固定材料又各有其不足，如若能研制一种具有更简易的外固定方式如采 用喷塑，同时又具有良好的固定效果。将来有可能替代其他种类的非侵入性外固定材料。 葡聚糖型聚氨酯绷带在2 0 世纪9 0 年代初开始应用于临床外固定材料。其组成成分为淀 粉、硝酸纤维素、多苯基多亚甲基多异氰酸酯( p o l y a r y lp o l y m e t h y l e n ei s o c y a n a t e ：p a p i ) 、 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 丙酮、硅油、二乙基环己胺。生产该产品的原料来源丰富，不需要发泡剂，生产过程易控 制，比聚醚型和聚酯型聚氨酯相比较原料来源广泛，成本低，且不用氟里昂，但是由于其 制作流程繁琐，原材料较多，未能得到很好的推广。为此我们与厦门大学化工学院功能材 料与聚合反应工程研究室合作，成功对葡聚糖型聚氨酯的原材料进行简化，大大简化了工 艺流程，设计采用喷塑的方法可随时随地实现非侵入性外固定，具有操作、携带方便，良 好固定效果，同时又安全可靠的特点。 世界各国政府及生物学评价专家于1 9 8 9 年成立了i s o t c l 9 4 医疗器械生物学评价技术 委员会，相继制定颁布了i s 0 1 0 9 9 3 系列1 7 个相关标准1 ，这些标准已逐步为世界各国所认 同并采纳。因此，对生物医学材料安全性评价主要是采用医疗器械生物学评价体系，即世 界标准化组织( i n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d so r g a n i z a t i o ni s o ) 制定的1 0 9 9 3 系列标准， 我国依次标准制定了( g b t ) 1 6 8 8 6 系列标准。葡聚糖型聚氨酯在临床应用类别属于皮 肤表面接触材料，在应用之前必须进行生物学评价。目前尚未见对葡聚糖型聚氨酯进行生 物学评价的报道，为了保障其在临床应用安全有效，必须在临床使用前进行医疗器械生物 学评价。参照以上标准，我们根据葡聚糖型聚氨酯的临床用途，使用时是有液态转化为固 态的一个反应过程，最终有可能与人体的皮肤相接触，合理的选择了四个项目即急性经皮 毒性实验皮肤刺激实验、最大剂量致敏实验及体外细胞毒性实验，作为生物安全性评价监 测项目，为该产品在临床安全应用提供理论基础。参照了国家标准有g b t 1 6 8 8 6 2 ：2 0 0 6 ， g b t 1 6 8 8 6 1 0 ：2 0 0 5 ，g b t 1 6 8 8 6 5 ：2 0 0 3 ，g b t 1 6 8 8 6 1 1 ：1 9 9 7 。 福建中医药大学硕士学位论文 材料与方法 一、实验材料 1 、实验动物 健康白发豚鼠4 0 只，雌雄各半，体重3 5 0g - - 4 0 0g ，用于急性经皮毒性试验。健康白发 豚鼠1 8 只，雌雄各半，体重3 5 0g - _ 4 0 0g ，用于致敏实验。选取健康白发家兔6 只，雌雄各 半，体重2 。0k g 2 5 埏，用于皮肤刺激实验。上述实验动物均购自厦门大学实验动物中心。 定量饲养于普通动物房，温度1 9 2 6 c ，相对湿度5 5 1 5 ，换气次数8 - 1 0 次4 , 时。 2 、实验细胞 l - 9 2 9 d x 鼠成纤维细胞，购自中国上海细胞库，用于体外细胞毒性实验。 3 、受试物 葡聚糖型聚氨酯由厦门大学化工学院功能材料与聚合反应工程研究室提供，实验中需 要用到该材料的浸提液，其制备方法按国标g b t 1 6 8 8 6 - 1 2 完成，方法如下： 选用生理盐水作为浸提介质( 细胞培养用培养液) ，称取0 5g 葡聚糖型聚氨酯，按照 0 1g m l 的比例与浸提介质混合，后在3 7 2 持续浸提7 2h 2h ，过滤浸提液密封 备用。 4 、主要试剂 生理盐水、碘伏、二甲苯、苯酚、甲醛各浓度的乙醇若干：1 7 5 医院药剂科制剂室； 2 、4 二硝基氯苯、完全氟式佐剂、硫化钠、乙醚、十二烷基硫酸钠石蜡油：汕头市西 陇化学工厂有限公司； 伊红染色液、苏木素染色液：福州迈新生物有限公司； d m e m 高糖，胎牛血清( t b d ) 、胰蛋白酶：s i g m a 公司； 氨苄青霉素、硫酸链霉素、无菌h a n k s 溶液：北京化工厂产品： 5 、一般实验器材 若干lm l 注射器：江西洪大医疗器械集团有限公司； 无刺激性胶布：北京康美特医用材料有限公司； 若干无菌纱布：河南省蓝天医疗器械有限公司； 6 、实验器材 电子天平：i s o9 0 0 1 ，北京赛多利斯仪器系统有限公司； 电热恒温鼓风干燥箱：d h g 一9 0 7 0 a ，上海一恒科技有限公司； 切片机：c m l 9 0 0 ，l e i c a 公司； 包埋机：t e c - 2 8 0 0 ，常州市郝思琳医用仪器有限公司； 组织脱水机：z t 一1 2 v 1 5 ，武汉中天鸿博医疗设备有限公司； 烤片机：z t h b1 9 0 0 ，武汉中天鸿博医疗设备有限公司； 电热恒温水浴箱：d k 一4 2 0 型上海惊鸿实验设备有限公司； 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 倒置相差显微镜：i x 7 0 ，o l y m p s 公司； 微量可调加样器：d r a g o nm e d ； 酶标仪：p l u s3 8 4 ，s p e c t r a ； 超净工作台：a i r t e c h 公司； c o 。培养箱：m e m e r t 公司； 酶标仪：e l x 8 0 0 ，b i o t e k ； 离心器：t g l 一1 6 c ，上海安亭科学仪器厂飞鸽牌； 立式压力蒸汽灭菌器：y x q l s 一7 0 a ，上海博讯实业有限公司医疗设备厂； 电热恒温鼓风干燥箱：d h g 一9 0 7 0 a ，上海一恒科技有限公司； 海尔冰箱：b c d 一5 1 8 w s a ，h a i r e ； 医用超声清洗器：k q 一5 0 0 e ，昆山市超声仪器有限公司； 微量振荡器：z w a ，常州国华电器公司； 液氮罐：福州联创特种气体有限公司； 2 5 c m 2 细胞培养瓶、9 6 孔细胞培养板、聚丙烯细胞冻存管、移液器，细胞计数板，一 次性滤器：c o s t a r 公司。 二、实验方法与观察指标 1 、急性经皮毒性实验按国标g b t 1 6 8 8 6 1 l 一1 9 9 7 进行 1 1 动物造模 j 8 4 0 只豚鼠按体重性别随机分为4 组，即完整皮肤空白组，破损皮肤空白组，完整皮肤 实验组，破损皮肤实验组，每组1 0 只，雌雄各半。于给药前2 4h 硫化钠，在豚鼠背部脱毛， 面积约2 0c m 2 ，同等条件下饲养，待脱毛后2 4h 观察脱毛区皮肤未见有异常。用1m 1 注射 器针头在无菌条件下对破损组豚鼠背部划# 号，以微出血为限，造成皮肤破损，称取并记 录每只豚鼠的重量。 1 2 实验步骤 将葡聚糖型聚氨酯研成粉末，敷于实验区， 4 层无菌纱布覆盖，无刺激胶布固定； 封闭接触2 4h ，揭除胶布纱布，3 0 温水轻轻擦拭干净； 分别在第l 、3 、5 、7d 观察豚鼠体重、体重、毛发、眼睛和粘膜、呼吸、循环、中 枢神经系统、四肢活动的变化及破损处的皮肤伤口愈合； 观察7 天后乙醚处死，大体解剖，取出1 0c m2 的肝组织，行病理组织学检查。 1 3 病理组织标本制作 固定：标本在中性缓冲福尔马林( p h = 7 4 ) 固定液中固定2 4h ： 脱水与透明：按7 0 乙醇1 次、8 0 乙醇1 次、9 0 乙醇2 次、9 5 乙醇2 次、1 0 0 乙醇1 次的顺序脱水，各浓度下3 0m i n ，二甲苯透明3 0m i n ； 浸蜡：5 0 的石蜡二甲苯液中浸蜡1 0m i n ，1 0 0 的石蜡液中浸蜡1 0m i n ： 包埋：取出脱水后的组织，将标本组织放到包埋台上进行包埋，后置于冷凝台上冷 福建中医药大学硕士学位论文 却，待组织蜡块冷却后即可； 切片：修整蜡块，在切片机上进行组织切片，厚度为5 u m ，进行连续切片； 贴片：选取理想的组织切片，提取展好的组织切片置于载玻片2 3 位置，然后于烤 箱内烤干，控制在6 0 ，3 0m i n ： 染色：二甲苯透明3m i n 、2r a i n 、lm i n ，无水乙醇2m i n 、3 m i n 、2m i n ，9 5 、 8 5 、7 5 、5 0 、3 0 乙醇各2m i n ，蒸馏水2m i n ，苏木精3 0 - 6 0m i n ，蒸馏水3 0s0 5 一l 盐酸酒精分色液5s ，蒸馏水3s ，4 0 m l 蒸馏水加2 滴氨水3s ，蒸馏水5s ，3 0 、5 0 乙 醇2m i n ，7 5 7 醇浸提载破片5m i n ，8 5 7 醇浸提载破片7m i n ，9 5 7 , 醇浸提载玻片6m i n ， 伊红3m i n ，9 5 7 醇淹浸提载玻片3s ，无水乙醇浸提载玻片3m i n ，无水乙醇浸提载玻 片4m i n ，无水乙醇浸提载玻片2m i n ，纯二甲苯浸提载玻片3m i n 、2m i n ： 封片：擦除残余二甲苯，滴一滴树胶于取材的切片上，盖玻片封片； 观察：将做好的组织切片置于光镜下进行观察其组织结构，并采用图像采集系统进 行采集图片。 1 4 观察指标 观察皮肤有无红斑、水肿，皮肤伤口愈合情况，毛发变化、眼睛及粘膜变化，体重增 长、二便及肝脏病理变化。 2 、皮肤刺激实验按国标g b t 1 6 8 8 6 - 1 0 ：2 0 0 5 进行 2 1 动物模型 白发家兔6 只，动物房饲养1w 后，于给药前2 4h 将动物背部两侧对称脱毛l oc m 1 5c m ，待脱毛后2 4h 观察脱毛区皮肤未见有异常，将脱毛部位分为四个区域，以每只 家兔背部左侧为实验区，右侧为对照区，每侧分前后两区，分别为破损皮肤区和破损皮肤 区( 如图1 ) 。 尾部 图1 皮肤应用部位 2 2 实验步骤 无菌条件下，1m 1 注射器针头在破损区域划# 号，以微出血为限，造成皮肤破损， 破损面积3a m x3c m ： 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 将浸透浸提液的4 层3c m x3c m 纱布，如图1 所示敷贴于动物背部两侧实验组区域， 将浸透浸提介质( 生理盐水) 的纱布块大小与对侧相同，敷贴在对照接触部位，用半封闭 性包扎带固定敷料； 敷贴2 4h 擦去受试物，温水洗净，观察皮肤变化。 2 3 实验观察指标 2 3 1 动物观察指标 去除受试物后0 、2 4 、4 8 、7 2h ，观察并记录各接触部位情况，按规定评分系统( 见 表1 ) ，描述每一规定时间内实验区域皮肤红斑和水肿反应情况并评分。 表1 皮肤反应评分标准 2 3 2 结果 原发性刺激指数( p i i ) = 每只动物原发性刺激记分相加动物总数。根据规定的标准评 价反应类型( 见表2 ) 。 表2 免原发性刺激反应类型 反应类型( 刺激性) 原发性刺激指数( p i i ) 极轻微( 无) 轻度 中度 重度 0 0 - 0 4 9 0 5 - 1 9 9 2 0 4 9 9 5 0 8 o 3 、致敏实验根据国标g b t 1 6 8 8 6 1 0 2 0 0 5 采用皮肤致敏实验的最大剂量法( g u i n e ap i g m a x i m i z a t i o nt e s tg p m t ) 3 1 动物模型 白发豚鼠1 8 只，动物房饲养一周后，随机分成三组，实验组，空白组和阳性组，每 组各6 只，于给药前2 4h 将动物背部脊柱两侧用脱毛剂脱毛，脱毛面积2 4c m 2 ，待脱毛 后2 4h 观察脱毛区皮肤未见有异常，行致敏实验。 9 福建中医药大学硕士学位论文 3 2 实验步骤 3 2 1 皮内诱导阶段 常规消毒后在实验动物去毛部位成对皮内注射6 个点，相邻两点上下间隔1 5a m ，每 点注射0 1m l 。如图2 ：各组注射分别为： 实验组左右对称性的按前后顺序注射完全氟氏佐剂，材料浸提液，完全氟氏佐剂与浸 提液的混合乳化剂( 5 0 ：5 0 ( v v ) 的比例混合) 。 阴性组左右对称性的按前后顺序注射氟氏佐剂，生理生盐水，完全氟氏佐剂与生理盐 水的混合乳化剂( 5 0 ：5 0 ( v v ) 的比例混合) 。 阳性对照组左右对称性的按前后顺序注射氟氏佐剂，2 、4 一二硝基氯苯，完全氟氏剂与 2 、4 - - _ 二硝基氯苯的混合乳化剂( 5 0 ：5 0 ( v v ) 的比例混合) 。 实验组头对照组 i nn i 2o o 2 1nn 匿 弗氏完全佐热 生理盐承 遐台乳剂 ( 古生理敬水) 图2 具体汪射部1 立 3 2 2 局部诱导阶段 皮内诱导完成7d 后，每只动物注射区用1 0 十二烷基硫酸钠石蜡液预处理，按摩导 入皮肤；2 4h 后，分别用滤纸片浸透实验材料浸提液，生理盐水和2 、4 一二硝基氯苯敷贴 于各组豚鼠皮内注射部位，滤纸上覆盖蜡纸封闭材料，非刺激性胶带固定，并于4 8h 2h 后除去胶带、蜡纸和滤纸片。 3 2 3 激发 局部诱导阶段完成1 4d 后，在激发前2 4h ，用脱毛剂在动物腹侧进行脱毛，脱毛后 2 4h 观察皮肤无异常，用滤纸分别浸透浸提液、生理盐水和2 、4 一二硝基氯苯敷贴于实验 组、空白组和阳性组动物腹侧部位，滤纸上覆盖蜡纸封闭材料，非刺激性胶带固定，并于 2 4h 2h 后除去胶带、蜡纸和滤纸片。 3 3 实验观察指标 3 3 1 观察指标 除去贴敷物后0h 、2 4h ，4 8h ，7 2h 观察实验组和对照组动物激发部位皮肤反应程度， 根据表3 描述每一激发部位和每观察时间皮肤红斑和水肿反应程度。 l o 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 表3 皮肤反应分类系统表 3 3 2 结果评价 致敏率= 每只动物反应评分总和总分数。美国材料与实验协会( a s t m ) f 定了致敏率，若致敏率 0 0 5 ，具体见表6 。 破损皮肤实验组与空白组之间无异常症状，皮肤无红斑、水肿，毛发通顺，亮泽， 不干枯，伤口愈合良好，眼睛及粘膜无变化，反应灵敏，尿液清晰，大便呈粒状无异常， 组间体重比较无差异( p = 0 7 4 9 0 0 5 ) 。根据豚鼠的表现及体重观察，表明在实验条件下未 观察到明显的毒性，该材料基本安全。具体见表6 。 表6 豚鼠体重重量单位( g ) 及统计分析结果( x s ，n = l o ) 观察时间0h 2 4h7 2h5d 7d 完整皮肤空白组3 7 3 2 1 0 2 3 8 1 3 5 2 3 9 1 8 1 3 23 9 9 6 7 64 1 0 2 6 7 完整皮肤实验组 3 7 5 6 2 0 73 8 0 7 1 5 23 9 2 6 7 ，3 4 0 0 2 8 24 0 9 3 5 7 破损皮肤空白组 3 7 4 4 1 3 63 8 0 5 1 4 13 8 9 3 8 24 0 0 9 9 1 4 0 8 8 7 5 破损皮肤实验组 3 7 5 8 + 9 83 8 0 6 1 4 63 9 0 1 1 1 23 9 9 3 8 4 4 0 8 6 5 2 完整皮肤买验组与苑娶压肤i 纠住组p 0 0 5 ，破 j 5 j 皮肤买验组与破彳员皮肤i 卅性组p 0 ，0 5 ， 2 、四组的肝脏组织学检查见：肝小叶结构完整，中央静脉及周围放射状排列的肝细胞 索清晰可见，且彼此连接成网，肝细胞呈多边形，界限清楚，胞浆丰富。 二、皮肤刺激实验 白发家兔活动正常，饮食正常，敷料固定良好，无移位，见附图。浸提液对白发家兔 脱毛皮肤敷贴2 4h 后，完整皮肤实验区域未见有局部无红斑和水肿反应，浸提介质( 生理 盐水) 对完整皮肤和破损皮肤均无刺激作用，破损皮肤实验区在2 4h 可见有两只白发家兔 出现勉强可见的红斑，4 8h 后一只皮肤红斑完全消失，7 2h 另外一只皮肤红斑完全消失， 见表7 。根据皮肤刺激反应评分标准，本实验完整皮肤实验组与破损皮肤组的原发性刺激指 数( p r i m a r yi r r i t a t i o ni n d e xp i i ) = 0 o 5 ，因此根据表2 兔原发性刺激反应类型可以 认为该材料对家兔皮肤无刺激性。 表7 葡聚糖型聚氨酯浸提液对白发家免皮肤的刺激指数 三、致敏实验 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 实验中激发后的7 2h 观察期内实验组动物的激发部位在各时点均无红斑、水肿现象， 与阴性组无差，阳性组的6 只豚鼠均见有不同程度的红斑，见表8 表8 各组实验动物红斑、水肿记分( n = 6 ) 2 4h4 8h7 2h 组别0i23 0i230123 空白组 600060 0060 00 阳性组 602460336l23 实验组 600060006000 根据表9 得出阴性组和实验组的致敏率为0 ，阳性对照组观察致敏率7 5 。各组的实 验结果比较见表9 。 表9 各组动物的实验结果比较 四、体外细胞毒性实验 ( 1 ) 形态学观察：倒置显微镜下观察，0h ，细胞突充分伸展，形态正常，细胞呈梭形或 不规则三角形，肉眼观察各组细胞密度均匀。 加样后2d ：空白对照组细胞形态、密度正常；阳性对照组细胞密度明显低于空白对 照组，可见细胞坏死区域，多数细胞变圆；1 0 0 组部分细胞变圆，周围密度稍低于空白对 照组，局部小面积细胞轮廓不清楚；5 0 组细胞密度稍低于空白对照组，大部分细胞形态正 常，实验组染色密度明显高于阳性对照组。 加样后4d ：阴性对照组细胞形态正常，已长满2 3 孔底；阳性对照组细胞大部分死 亡，隐约可见一些细胞影像及细胞崩解产物，残留细胞大多数形态异常，高倍镜下可见胞 浆中颗粒物质密集；1 0 0 对照组细胞密度低于空白对照组和5 0 材料组，可见局部小面积 细胞溶解、坏死区域，密度稍稀疏，部分细胞形态异常变圆，细胞密度稍低于空白对照组。 m t t 染色后，实验组染色密度明显高于阳性对照组，实验组的染色密度仍较高于阳性组。 加样后7d ：阴性对照组细胞已基本长满孔底，细胞突起回缩使得细胞呈椭圆形；阳 性对照组可见大面积细胞坏死溶解区域，仅可见少数形态异常的细胞及细胞影像。崩解产 物，几乎找不到正常细胞；其余各材料组细胞排列密集，长满孔底，大部分细胞形态正常。 m t t 染色后实验组与空白组颜色无明显差异，明显深于阳性组。 ( 2 ) m t t 法测定结果： o m t t 法测定加样后0 时、2d 、4d 、7d 的o d 值，采用单因素方差分析方法比较， 5 0 、1 0 0 的实验组与阴性组之比较p o 0 5 ，有统计学 意义。见表l o 皮肤伤 ，大便 产生明 ，2 4h 另外一 损皮肤 致。说 明了该材料无皮肤致敏性，可认为在与人体接触过程中不会引起过敏反应： 4 、细胞毒性试验显示了实验组的环境中未见有细胞数量减少，细胞形态正常，无细胞 溶解现象发生，与阳性组之间存在着显著性的差异，细胞着色情况予阴性组一致，说明了 该材料为对产生细胞毒性作用。 喷塑外固定材料葡聚糖型聚氨酯的生物学评价 讨论 中医骨伤科学在治疗上具有自己的特色，体现在非侵入性外固定与三期辩证治疗相结 合。非侵入性外固定主要采用石膏及各种木、竹、纸夹板、高分子绷带，热塑夹板等，对 操作技术的要求较高，也不可拆卸，并且有部分无法固定。因此研制一种采用喷塑方法实 现固定的材料，对骨折患者的康复和治疗及减轻骨科医护人员的劳动强度显得特别重要， 特别适合于野外条件和紧急骨折固定处理。因此我们与厦门大学共同研发了葡聚糖型聚氨 酯，作为喷塑外固定的材料。根据国际标准化组织( i s 0 1 0 0 9 9 3 ) 的文件和我国的国家标准 ( g b t 1 6 8 8 6 系列) 对预期用于人体的材料( 天然的或人工合成的) 在进入临床前必须严格 进行一系列的体内外的生物学试验，然后将资料信息综合分析以对该材料最终用于人体的 风险做出评价。按照标准规要对一种生物材料进行安全性评价，首先要根据材料的本身的 特性，最终与人体接触的性质和时间，按照国标的规定正确，合理的选择评价试验项目， 这样才有可能做出相对科学的评价结论。 一、葡聚糖型聚氨酯的优势 1 、外固定材料的不足 小夹板固定技术是祖国医学的精华，迄今相传1 0 0 0 多年，是治疗骨折常用、有效的方 法之一，是一种能动的弹性固定方法h 。但小夹板固定操作也经常出现问题如压垫使用不 当、松紧失度等，小夹板外固定属于间接固定，不适用于斜形、螺旋型和粉碎性等不稳定 的骨折，又不利于跨关节固定，患者又经常需要复诊，由医生进行调整松紧度一：，应用上 受到一定的限制。石膏绷带存在诸多缺点，如操作程序复杂、时间长；制备过程中石膏粉 外逸对皮肤、伤口刺激性大，污染大；石膏密封，透气性差，易引起皮肤伤口污染，且不 易观察皮肤及伤口情况；硬度不够，致塑形时间长；传统石膏绷带一经打开后剩余石膏在 短时间内凝固，造成浪费等。聚氨酯绷带基材是合成纤维织物，表面涂有聚氨酯树脂，既 可避免潮湿而引起的并发症，它又具有石膏绷带的特点。采用聚氨酯弹性体材料制作的弹 性绷带疆1 ，具有操作简便、使用卫生、固化速度快、质轻层薄、坚韧、透气性好、可塑性 大、耐水浸、透x 射线、不易使皮肤发炎等特点，其重量约是石膏绷带的1 3 ，而抗压强 度则比石膏绷带高一倍以上，因此聚氨酯弹性绷带正逐步取代传统的石膏绷带，成为一种 认为的新型矫形材料，被广泛用于创伤骨科治疗和矫形治疗：9 1 。聚氨酯弹性绷带，一般由 聚氨酯预聚体与溶剂、适量催化剂配制成绷带涂布原液，涂布于干燥的织物上制得。使用 时将绷带在水中浸一下，取出缠绕在需要固定的部位，由预聚体与水进行扩联和交联反应， 短时间内固化成型。张宏胜n 崛等通过临床对石膏绷带、聚氨酯绷带及聚氨酯泡沫夹板固定 效果无显著性差异。研究表明了医用聚氨酯绷带是一种对人体无毒性的合成高分子材料制 成，但是它只适用于管型固定，由于热塑时间短不利于制作成为石膏托塑型，氧化后硬度 极强，容易造成血管神经的损伤、皮肤溃疡等，所以在操作中一般用于有枕垫的管型石膏， 管型固定在急诊创伤又有操作不便等不足，强大的硬度使得拆卸不便。有学者n 3 3 将其与石 福建中医药大学硕士学位论文 膏绷带进行力学对比，发现其塑型能力较差，而且技术难度较大，对病情的把握，硬化时 间和操作 2 、葡聚糖型聚氨酯成分分析 由于聚氨酯( p u ) 分散液在制备的过程中，往往在大分子链中引入了亲水基团，故使其 成膜后的耐水性和耐热性较差。为了提高水性p u 成膜后的耐水性和耐热性能，扩大其 应用领域，已在其大分子链中引入交联结构。c o o g a n 等u 引用多异氰酸酯水分散液为交联剂， 制备了双组分水性聚氨酯，发现具有交联结构的聚氨酯膜的拉伸强度、耐溶剂性均有所提 高。因此，在葡聚糖型聚氨酯利用了氧化交联淀粉对水性p u 进行了交联改性，改性后的淀 粉由于具有价格低廉、可再生，耐水性能得到改善”3 1 。丙酮是主要的溶剂，可降低粘度， 二乙基环己胺主要是调节反应的速度。 3 、葡聚糖型聚氨酯特点 医用聚氨酯被誉为我国未来5 年内增长潜力最大的一种骨科耗材，经过几年的发展使 用，发现其使用方便，性能优良，是一种合适的骨科外固定材料。日本新材料研究所研制 的聚氨酯弹性体已批量生产，各项性能指标及使用效果均接近美国s m i t h 公司同类产品以钔。 相比较其他材料葡聚糖型聚氨酯具有以下的几个优点