微粒子发光检测技术及其应用.ppt

微粒子发光检测技术及其应用,内容提要,国外全自动免疫分析仪简介国内全自动免疫分析仪简介微粒子载体介绍微粒子发光检测技术在传染病检测项目中的应用,西门子：ADVIACENTAURCP、ADVIACENTAURXPIMMULITE2000贝克曼：Access2、UniCelDxI800罗氏：Elecsys2019、Cobase411、Cobase601、雅培：ARCHITECTi2000sr/1000强生：VitrosECi索林：LIALSON东曹：AIA-360、600、1800、2000,全自动免疫分析仪特点全自动操作，操作简便，减少职业暴露风险反应管反应，管到管管理，增强重复性主要以磁微粒为反应固相，检测速度快一个样本同时检测多个项目随机插入检测样本，急诊功能,西门子（seimens）,ADVIACentaurXP,ADVIACentaurCP,ACS:180,healthcare.siemens/immunoassay/systems,healthcare.siemens/immunoassay/systems,IMMULITE1000,IMMULITE2000,IMMULITE2000XPi,https:/beckmancoulter/wsrportal/wsr/diagnostics/clinical-products/immunoassay/index.htm,Access2,UniCelDxI800,UniCelDxI600,贝克曼（Beckman）,UniCelDxC660iSynchronAccessClinicalSystems,UniCelDxC600iSynchronAccessClinicalSystems,UniCelDxC680iSynchronAccessClinicalSystems,UniCelDxC860iSynchronAccessClinicalSystems,UniCelDxC880iSynchronAccessClinicalSystems,附件：贝克曼仪器平面结构图,https:/mylabonline/products/clinical_chem.php,cobas6000analyzerseries,cobase411,cobase601,Elecsys2019,罗氏（Roche）,abbott/global/url/content/en_US/product/Product_Master_0012.htm,雅培（Abbott）,强生（Johnson&Johnson）,orthoclinical/en-us/ProductInformation/ClinicalLaboratories/Pages/default.aspx,VITROS3600,VITROSECiQ,索林（DiaSorin）,LIAISONXL,LIAISON,diasorin/us/prodotti-strumenti/index,东曹（Tosoh）,AIA-2000,tosoh/our-products/bioscience/clinical-diagnostics/clinical-diagnostics,AIA-900,AIA-600,AIA-360,深圳新产业四川迈克威海威高利德曼郑州安图,二、国内全自动免疫分析仪简介,china-maker/products/list.asp?cat=1&scat=1&all=1,四川迈克,MAGLUMI2000,MAGLUMI1000,MAGLUMI2000PLUS,snibe/,深圳新产业,weigaoholding/h/cpfl/ProductList.aspx?SortID=56&SortName=检验设备,威海威高,安图AutolumoA2000,“863”计划,课题一：“全自动管式化学发光免疫检测系统的研制”厦门大学、万泰、科华、安图等,机械结构设计,反应杯自动连续供给；超大反应杯容量，能存储2000个反应杯，可以随机添加智能检测反应杯数量；反应杯随机放入，无需人工排列,反应杯自动连续加载系统,精准灵活的机械抓手；快速准确抓放反应杯；,机械抓手,敏捷的取放动作,流水线式自动进样系统放置样本数一批次最大100个样本（可循环追加）样本载体样本架（5个样本位/架）样本容器血液采集管、样本杯急诊有急诊样本优先通道条码智能样本、试剂条码管理,加样系统,高效的加样针清洗系统电容式液面检知系统高加样精度，有效的控制变异自动在线稀释,试剂反应处理系统,预处理环：大幅提升实验效率超大温育盘：192个温育位高通量：200个测试/小时底物预加热技术高效混匀系统37恒温温育,最大装载24种的试剂智能试剂条码管理磁珠自动混匀410低温冷藏,多功能试剂盘模块,应用软件,全中文界面，操作简单多种数据处理方式完善的检验菜单智能化的显示系统实时温度、消耗品的监控管理编辑、存储、查询、打印功能预留LIS/HIS系统接口,磁珠(Magneticbeads,MB)，是由微粒技术发展起来的一类新型材料。粒径在几百纳米到数十微米不等，是由内部磁性材料（-Fe2O4、Fe3O4等铁的氧化物）和外层高分子材料（聚苯乙烯、多糖等）构成，通常保存在液态中形成浅棕色的乳浊液。,根据合成条件的不同，可以使其表面带有化学功能基团，如-OH、-NH2、-COOH等，使得磁珠几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白。磁珠表面可以通过共价键结合抗体等生物分子，再与相对应的靶物质结合形成新的复合物。在通过磁场时，这种复合物可被滞留，与其它组分相分离，分离简便易行，分离纯度高，保留靶物质活性，且高效、快速、低毒，可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。,磁珠的特性,大比表面和高分散稳定性：随着磁珠的粒径达到纳米级时，其比表面激增(如：半径0.8m的磁珠，比表面积可以达到70.82cm2/mg)，磁珠表面官能团密度及选择性吸附能力显著变大，达到吸附平衡的时间大大缩短。同时磁珠能够在溶液中形成乳浊液，磁珠粒子的分散稳定性也随之大大提高。超顺磁性：在外加磁场作用下磁珠可产生磁性，并做定向移动，磁场去除后磁性消失，由此可方便地进行分离和磁性导向。,磁珠的特性,生物相容性：纳米磁珠与多数生物高分子如多聚糖、蛋白质等具有良好的生物相容性。在生物工程，特别是在生物医学领域应用，具有良好的生物相容性是非常重要的。功能基特性：磁珠表面功能化的基团能与生物高分子的多种活性基团如-OH、-COOH、-NH2共价连接，可在其表面稳定地固定生物活性物质(如抗体、抗原、受体、酶、核酸和药物等)。,磁珠的制备方法,包埋法：将磁性粒子分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高分子微球。属于物理方法制备磁珠，包埋法是早期制备磁珠的方法，利用该法制备磁珠的优点是方法简单、易于操作，但是由于此法是有机高分子直接在无机磁性粒子表面沉积，所以制得的磁珠的粒径分布较宽，粒径大小不易控制，且形状不规则，因此在应用时受到了很大的限制。,单体聚合法：在磁性粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等聚合而成的核/壳式磁珠。利用单体聚合法制得的磁珠的粒径分布较均匀，而且无机磁性粒子表面包覆的有机层的薄(厚)度便于控制。虽然单体聚合法制备磁珠与包埋法相比有了相当大的进步，但是制得的磁珠的磁含量和规整性等方面仍存在很多问题。,磁珠的制备方法,原位法：是先制得单分散的致密或多孔的聚合物微球，此微球含有可与铁盐形成配位键或离子键的基团，然后根据微球所含的不同基团，采用不同的方法制备出磁珠。此法制备出的磁珠的分散性好，磁含量高。,磁珠的制备方法,磁珠的主要用途,用于细胞分离和提纯体外细胞扩增免疫检测在核酸与基因工程上的应用用作靶向释药系统的载体,IVD领域磁珠的应用,纳米磁珠分离是目前世界上最先进的分离手段，它具有快速、高效、均一性灵敏度高、非特异性低等优点。而在IVD行业中，磁珠更是具有非常广阔的前景。它所具有以下其他载体不可比拟的优点：磁珠具有高的表面质量比，可以结合更多的抗体参加免疫反应磁珠表面通过共价键结合抗体，较物理吸附更坚固磁珠由于粒径很小，在温育过程中，均匀分散在反应液之中，近似于均相反应，反应快速、高均一性磁珠的超顺磁性在后期洗涤分离过程中更利于全自动仪器应用,检测项目,甲状腺类：总/游离T3，总/游离T4，促甲状腺素，超敏促甲状腺素，T3摄取量性激素类：绒毛膜促性腺激素，泌乳素，雌二醇，雌三醇，促卵泡成熟素，促黄体生成素，孕酮，睾酮等血液系统：维生素B12，叶酸，铁蛋白等肿瘤标记物：AFP，CEA，CA15-3，CA125，CA19-9，CA50，2微球蛋白，PSA等传染病类：HBV、HIV、HCV、TP、HAV、HEV等优生优育：TORCH-IgM/IgG心血管系统：肌红蛋白，肌钙蛋白，CK-MB等血药浓度：地高辛，苯巴比妥，茶碱，万古霉素，庆大霉素，洋地黄，马可西平等其他：免疫球蛋白E，血清皮质醇，尿皮质醇，尿游离脱氧吡啶等,国内外IVD行业磁珠的研究现状,国外磁珠生产公司已经伴随着全自动免疫分析仪的开发形成规模化、产业化的生产。如Dynal、Merck、Serdyn、Magsphere等已经开发出各类磁珠应用于IVD行业。全自动免疫分析仪瑞士罗氏直径2.8m的链霉亲和素包被的氧化铁磁性颗粒作为包被固相。美国拜耳磁性微粒是以三氧化二铁为核心,外包一层聚苯乙烯组成,直径1.0m。贝克曼超细磁性微粒子技术d7m,德国尼尔森也采用超顺磁珠作为载体。国内关于磁珠应用于免疫检测的研究刚刚起步，商业应用价值没有完全体现出来。如倍爱康的磁酶免，磁发光。,在免疫诊断中常用到的磁珠是表面含有-COOH、-NH2的磁珠，这类磁珠可以方便的通过双功能团化合物在其上联上单克隆抗体。如何通过化学键将抗体包被到磁珠表面是关键，不同的官能团，连接方法相差很大。,IVD磁珠的包被,1、表面含有-NH2的磁珠,通常采用戊二醛等作为双功能团连接剂，与抗体等一同加入磁珠乳浊液中，温育、洗涤、封闭、保护。,2、表面含有COOH的磁珠,磁珠乳浊液中加入EDC等碳二亚胺类物质先活化表面的基团，然后与抗体等反应。,3、含有甲基苯磺酸基的磁珠,直接在磁珠乳浊液中加入抗体将对甲苯磺酸置换出来，属于物理化学吸附并存。,4、链霉素亲和素包被磁珠,这种磁珠可以直接与生物素标记的抗体等靶分子直接作用，作用效果好，并且具有一定的放大效果。价格较贵。,5、单抗包被磁珠,Dynal可以提供包被了二抗的磁珠，便于直接应用。,微粒子发光检测技术在传染病检测项目中的应用,国外全自动免疫分析系统的传染病项目简介安图生物传染病全自动发光项目研究进展HIVHCVHBVTP,急性期,潜伏期,窗口期,HIV感染中抗原、抗体变化图,Anti-P24,Anti-gp41/120(anti-gp36),HIVRNA,HIV-Ag,1周2周.1月2月.1年2年3年.10年.,艾滋病期,HIV-Ab,HIV四代试剂的反应模式图,第一、二代,第三代,第四代,HIV抗体筛查检测流程图,免疫印迹法(HIV1/2混合型),HIV-1阳性反应,不确定反应,阴性反应,HIV-1阳性报告,阴性报告,出现HIV-2指示条带,免疫印迹法(HIV-2),阳性反应,阴性反应,报告HIV-2血清学阳性必要时测核酸,不确定反应,每3个月随访一次,共2次,仍属可疑,则作阴性报告；如随访期间出现阳性反应则报告阳性,阴性报告,丙型肝炎病毒标志物的检测,筛查实验（抗体检测）酶联免疫法化学发光法胶体金法确认实验免疫印迹实验（RIBA）-抗体NAT-核酸,T=0,high,medium,low,NAATdetectionlimit核酸检测限,antibody,virus,neutralized,infectivitythreshold传染阈值,infectivitythreshold,low,Eclipse逃逸期,NAAT核酸,Serology血清学,Antigen抗原,Antibody抗体,antigendetectionlimit抗原检测限,Infectivity传染性,血液标志物转化过程示意图,不同标志物检测HCV标志物对比,固相载体,待测抗体,HCV包被抗原,酶标二抗,抗体筛查实验-酶联免疫法,显色底物,结构区非结构区,抗体筛查实验-酶联免疫法,ORTHOHCVVersion3.0ELISA,Murexanti-HCV（version4.0）,国外全自动免疫分析系统传染病项目简介-HIV,国外全自动免疫分析系统传染病项目简介-HCV,国外全自动免疫分析系统传染病项目简介HBV/TP,抗HIV全自动试剂37度放置7天检测国家参考品，满足国家要求,抗HIV酶免试剂37度放置7天检测国家参考品，满足国家要求,全自动试剂达到酶免试剂性能，并且精密性明显优于酶免试剂。,抗HIV全自动检测不同基因型，灵敏度与梅里埃酶免试剂相当。,抗HIV全自动检测不同基因型与梅里埃对比,血清转化盘是某个体在被某种病原体感染后，在不同时间（一般是感染早期）抽取的一系列标本组成的血清盘，这种血清盘记录了个体被感染后体内与这种病原体相关的标志物变化过程，对诊断试剂的评估有非常重要的作用。,BBI血清转化盘购买于Seracare公司，全球范围内都在使用，非常权威，是美国CDC，WHO指定的评价商业盘。中检院即将开始在传染病项目的新项目注册检验中增加此项标准，标准已起草，征求意见已结束，预计13年即将出台。,安图抗HIV全自动与Abbott检测HIVPRB926血清转化盘均在27天检出，性能一致。