（分析化学专业论文）电化学和光谱方法研究环糊精包合物与dna的相互作用.pdf

摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 是基本的遗传物质，它对生命遗传密码的翻译、转录、 复制起着非常重要的作用，临床上使用的许多抗肿瘤、抗癌药物都以d n a 为作用 靶点，为了进一步探索和认识d n a 的性质、结构、行为、形态、揭开生命的奥秘， 人们研究了大量小分子与d n a 之间的作用。而由于靶向分子与d n a 的相互作用是 在生理条件下发生的，生命体内大量存在的多糖物质可能对靶向分子的形态有影 响。因此，借助于环糊精的模拟酶功能，将靶向分子包合筑构成超分子体系并用于 研究它们与生物大分子d n a 的作用，从而有助于从分子水平了解抗肿瘤、抗癌药 物的作用机理，为设计临床上更为有效的药物提供理论指导，而且对开发新型生物 传感器有着重要的意义。 本论文以电化学方法、光谱( 荧光、紫外一可见光谱) 方法为研究手段，对环 糊精包合噻吩类小分子后形成的超分子化合物与d n a 的相互作用进行了研究，共 分为四章，各章内容概述如下。 第一章介绍了d n a 的基本组成和结构，与d n a 相互作用的小分子种类、相 互作用的模式和研究其相互作用的技术方法，对环糊精超分子组装体系与d n a 的 相互作用进行了阐述，并对今后的发展作了简要的展望，提出本论文研究的立题思 想。 第二章用电化学方法研究了争环糊精一硫堇包合物与d n a 的相互作用。结果 表明，在p h 7 2 的p b s 缓冲液中，伊环糊精以1 ：1 包合硫堇，其包合常数为4 5 8 l m o l 。 肛环糊精硫堇包合物以嵌入方式与d n a 形成一种非电活性超分子化合物，包合物 与d n a 的结合比是1 ：1 ，结合常数为6 2 5 x 1 0 4 l m o r l 。 第三章用荧光及可见光谱方法研究了良环糊精一硫堇包合物与d n a 的相互作 用。发现在p h7 2 的p b s 缓冲液中，肛环糊精以1 ：1 包合硫堇，包合常数为4 4 4 l m o l ：伊环糊精一硫堇包合物主要以嵌入方式与d n a 发生相互作用。荧光光谱实验 的结果是d n a 对硫堇包合物的荧光峰有蓝移和猝灭效应，猝灭常数k s v 为 6 1 2 x 1 0 4 l m o l ；探讨了其荧光猝灭机理，比较了硫堇包合物和游离态硫堇与d n a 作用程度的大小。可见吸收光谱实验的结果是d n a 与硫堇包合物之间的嵌插结合 作用使包合物的最大可见吸收峰红移、吸光度降低。运用电子吸收光谱，得出它们 的结合比是1 ：1 ，结合常数为3 4 7 x 1 0 4 l m o l 一。 第四章用电化学方法对肛环糊精( 伊c d ) 一亚甲基蓝( m b ) 包合物与d n a 的相互 作用进行了研究。发现在p h 7 0 5 b r 缓冲液中争环糊精以l ：1 包合m b ，包合常数 为7 3 6 6 lm o f ! 。通过溶液中的d n a 以及d n a 修饰电极表面上的d n a 与# - c d - m b 包合物的相互作用引起包合物的式电位和峰电流的变化，以及体系受溶液中离子强 度的影响变化，受0 0 0 1 的p d d a 聚阳离子的影响变化等，推出g - c d m b 包含物 和d n a 之间作用方式主要是静电结合。通过电流法得出包合物和d n a 之间的结合 比是l ：l ，结合常数是1 7 3 x 1 0 4 l m o l 。 关键词；相互作用；包合物；硫堇：亚甲基蓝；争环糊精；d n a a b s t r a c t d c o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) i sak i n do fb i o l o g i cg e n e t i cl a r g em o l e c u l e ，i tp l a y s v e r yi m p o r t a n tr o l ei nl i f eg e n e t i cc o d e i n t e r p r e t a t i o n ，t r a n s c r i p t i o na n dc o p y , i ti st h e p r i m a r yt a r g e tm o l e c u l ef o rm o s to fa n t i c a n c e ra n da n t i v i r a lt h e r a p i e sa c c o r d i n gt ot h e c e l lb i o l o g y 1 1 1 ei n v e s t i g a t i o no f t h ei n t e r a c t i o no f d n aw i t ho t h e rm o l e c u l e si so f g r e a t i m p o r t a n c ei ne x p l o r e i n gt h es t r u c t u r ea n dc h a r a c t e ro f d n aa n dt h e i rf u n c t i o n s i nf a c t ， t h ei n t e r a c t i o no ft a r g e tm o l e c u l ea n dd n at a k ep l a c ei np h y s i o l o g i c a le n v f f o n m e n t s o i nv i r t u eo ft h ef u n c t i o no fs i m u l a t ee n z y m e ，c y c l o d e x t r i nc a l lb eu t i l i z e dt oi n c l u d et h e t a r g e tm o l e c u l ea n di n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no ft h ei n c l u s i o nc o m p l e xw i t hd n a i ti s h e l p f u lt ou n d e r s t a n ds o m ed i s e a s e sa n dt h em e c h a n i s m ，a n do f f e ra c a d e m i cg u i d a n c ei n d e s i g n i n ge f f e c t i v ed r u g , a n di so fg r e a ts i g n i f i c a n c ei ne m p o l d e r i n gs e n s i t i v ec h e m i c a l p r o b e so f p o l y m e rs t r u c t u r e i nt h i sp a p 瓯t h ei n t e r a c t i o no f c y c t o d e x t r i ni n c l n s i o nc o m p l e xw i t hd n a h a v eb e e n s t u d i e db ye l e c t r o c h e m i s t r ya n ds p e c t r o s c o p y ( f l u o r e s c e n c ea n du v - ss p e c t r o s c o p y ) m e t h o d s t h e r ea r ef o u rc h a p t e r s ， c h a p t e ri w ed e s c r i b et h es t r u c t u r eo fd n a ，t h es m a l lm o l e c u l es p e c i e sr e a c t i n gw i t hd n a ， t h er e a c t i o nm o d e ，a n dt h ei n v e s t i g a t i o nm e t h o d s a tt h es a l n et i m e ，w ed e s c r i b et h e r e a c t i o no fc y c l o d e x t r i nc o m p l e xs y s t e mw i md n a g i v es o m ea d v i c eo nt h ef u t u r e r e s e a r c h w j mt h e s ed e s c r i b e da b o v ea sb a s i s t h ep u r p o s e so f t h i sa r t i c l ea r es u g g e s t e d c h a p t e r t h ei n t e r a c f i o no f 3 - c y c l o d e x t r i n - t h i o n i n ei n c l u s i o nc o m p l e xw i t hd n ai ss t u d i e d b ye l e e t r o c h e m i c a lm e t h o d a tp h 7 2p b sb u f f e rs o l u t i o n s ，t h i o n i n ew i t hf l - c y c l o d e x t r i n f o r ma1 ：1i n c l u s i o nc o m p l e x a n dt h es t a b i l i t yc o n s t a n ti s4 5 8lt o o l t 1 1 ei n c l u s i o n c o m p l e x c a l lr e a c tw i n ld n ai nt h em o d e lo fi n t e r c a l a t i o n , f o r m i n g a n o n - e l e c t r o c h e m i c a l l ya c t i v es u p r a m o l e c u l a rc o m p l e x t h e i rb i n d i n gn u m b e r sa n dt h e b i n d i n g c o n s t a n t w e r ee s t i m a t e d t o b e la n d 6 2 5 x 1 矿l m o l 。 c h a p t e r t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d 3 - c y c l o d e x t r i n ( c d ) - t h i o n i n e ( t h ) i n c l u s i o n c o m p l e xw a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c ea n dv i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt hw i mf l - c df o r ma1 ：1i n c l u s i o nc o m p l e xw i mt h es t a b i l i t y c o n s t a n to f 4 4 4lt o o l i nt h ep h7 2p b sb u f f e rs o l u t i o n s f l - c d ，t hi n c l u s i o nc o m p l e x i n t e r a c t e dw i t hd n a b yi n t e r c a l a t i v em o d e t h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o np e a ko fi n c l u s i o n c o m p l e xs h i f t e dt o w a r ds h o r tw a v e sa n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i f i e sd e c r e a s e di n t h e p r e s e n c eo fd n a t h eq u e n c h i n gc o n s t a n tw a se a l c u l a t e dt ob e6 1 2 x1 0 lm o l “b y s t e m - v o t r u e rm e t h o d t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss t u d i e d 弛ei n t e r a c t i o no f 伊c d t hi n c l u s i o nc o m p l e xa n dt h i o n i n ew i t hd n aw e r ec o m p a r e d n l ea b s o r p t i o n s p e c t r l l n lo ft h ei n c l u s i o nc o m p l e xw a sd e c r e a s e da n ds h i f t e dt o w a r dl o n gw a v e si nt h e p r e s e n c eo fd n a , c o n f i r m i n gt h ei n t e r e a l a t i v ei n t e r a c t i o no f 良c d 删w i t l ld n a t h e b i n d i n gn u m b e r sa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n tw e r ee s t i m a t e dt ob e1a n d3 4 7 x 1 0 lm o t “ b ys p e c t r o p h o t o m e t r y c h a p t e ri v t h ei n t e r a c t i o no f 毋c y c l o d e x t r i n m e t h y l e n eb l u ei n c l u s i o nc o m p l e x 研t l ld n _ ai s s t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d a tp h7 0 5b rb u f f e rs o l u t i o n , 良c y c l o d e x t r i nf o r n la 1 ：1i n c l u s i o nc o m p l e xw i t hm e t h y l e n eb l u e t h es t a b i l l t yc o n s t a n ti s7 3 6 6lm o l b e t h t h ec y c l i cv o l t a m m e t r i cp e a kp o t e n t i a la n dp e a kc u r r e n to fi n c l u s i o nc o m p l e xw e r e i n f l u e n c e db yt h ed n ai ns o l u t i o na n do nd n a a ue l e c t r o d e r h e c y c h e v o l t a m m o g r a m so fi n c l u s i o nc o m p l e xi np r e s c n c eo fd n aw e r ei n f l u e n c e db yi o n s t r e n g t ha n db y0 0 0 1 p d d ap o l y c a t i o n t h ee x p e r i m e n tp h e n o m e n o nr e v e a l e dm a t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n8 c y e l o d e x t r i n m e t h y l e n eb l u ei n c l u s i o nc o m p l e xa n dd n ai si n t h ee l e c t r o s t a t i cb i n d i n gm o d e n l eb i n d i n gn u m b e r sa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n tw e r e e a l c u l a t e dt ob ela n d1 7 3 x l 矿m o ll b yc u r r e n tm e t h o d k e yw o r d s ：i n t e r a c t i o n ；i n c l u s i o nc o m p l e x ；t h i o n i n e ；m e t h y l e n eb l u e ；f l - c y c l o d e x t r i n ； d n a 硕士肇位论文 m a s te r st h e s i s 华中师范大学学位硷文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：毒爱矗 日期：唧年g 月2 f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：，耋囔嚆 日期：孵r 月叫日 导师签名： 日期砑f - 掺 乃包f l j 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。国垂途塞握窑卮鲎唇i 旦圭生i 旦= 生i 旦三生筮查! 作者签名：童篼啬 日期： 四年c 月叫目 导师签 日期： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 1 1 前言 第一章绪论 d n a ( 脱氧核糖核酸) 是生命遗传的物质基础，因而d n a 的研究成为分子生 物学和生物化学中最为活跃的研究领域之- - ”j 。 d n a 是一种长链的多聚核苷酸，它的基本结构单位是核苷酸；核苷酸由含氮 碱基、戊糖和磷酸三种成分组成。含氮碱基主要由四种：腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 和胸腺嘌岭( t ) 。戊糖为p d l 一2 一脱氧核糖。其中戊糖和磷酸起结构作用，丽碱 基则携带遗传信息。d n a 的长链型结构是由脱氧核糖核苷单磷酸通过37 ，57 一 磷酸二酯键连接而成( 如图1 左) ，这四种脱氧核糖核酸的连接及排列顺序构成了 d n a 的一级结构，是d n a 结构和功能的基础。 d n a 的一级结构决定了d n a 的二级结构和空间结构。d n a 的二级结构是由 两条反方向平行的多聚核苷酸链上碱基之间的氢键维系而成的有规则的双螺旋结 构模型l 那( 如图l 右) 。其两条链之间的螺旋呈现两种凹形，其中一条沟区较浅， 称之为小沟，而另一条沟区较深，称之为大沟。四种疏水性的碱基位于螺旋内侧， 碱基平面基本上与纵轴相垂直，碱基之间的堆集距离为3 4 a 。磷酸基与脱氧核糖在 外侧，彼此之间通过磷酸二酯键相连接，形成d n a 的骨架。糖环平面与纵轴平行。 双螺旋的直径为2 0 a 。顺轴方向，每隔3 4 a 有一个核苷酸，两个核苷酸的央角为 3 6 0 ，因此沿中心轴每旋转一周有1 0 个核苷酸，每间隔3 4 a 重复出现同一结构框架。 碱基之间a 与t 相结合，其问形成两个氢键，g 与c 相结合，其间形成三个氢键。 碱基的这种互补配对构成了d n a 的复制、转录、反转录的分子基础。d n a 结构的 稳定性主要来源于三种力：一是互补碱基对之间的氢键：二是碱基堆积力，由芳香 碱基上的百电子之间的相互作用产生，是比较主要的力：第三种力来自磷酸基上的 负电荷与介质中的阳离子之间的静电作用力。 在细胞内部环境中，双螺旋d n a 分子不是以细长的链状商分子的自由状态存 在，而是依据周围离子环境、细胞内p h 及与d n a 形成复合物的d n a 结合蛋白的 不同性质采用更高级的形式，从而形成了d n a 的三级结构，即d n a 双螺旋的进一 步扭曲，包括线状双链中可能有的扭结、超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环 以及环状d n a 诸如扭结、超螺旋和连环之类的各种拓扑学状态1 4 j 。 对d n a 结构和功能认识的不断深入推动了分子生物学和分子遗传学的迅速发 展，使其成为生命科学的带头学科，有力的促进了生命科学中各分支学科的发展。 d n a 分子的研究丰富和深化了人类对生命起源、生命进化和生命本质等生命科学 最基本问题的认识。在d n a 研究中，板凝胶电泳、放射型标记及各种非放射性标 记( 包括酶学标记和化学标记) 、吸收光谱等方法的广泛采用，极大地推动了核酸 研究全面纵深的发展，取得了令人瞩目的研究成果。在工业、农业、医学、环境保 护方面已崭露头角的基因工程，应用范围日益广泛，正成为一个有巨大潜力的新兴 产业。 图1 d n a 中多核苷酸链的一个小片断( 左) 和w a s t o n - c r i c k 双螺旋模型及其碱基配对原理( 右) 1 2 小分子与d n a 的相互作用 d n a 与其他分子相互作用研究，有助于了解某些分子对生物体内d n a 复制和 转录的影响，及由此引起的物种性状变异f 5 】，各种化合物与d n a 间亲和力的大小 和化学核酸酶的作用机制【】等信息。在医药中，研究d n a 与其靶向分子相互作用 的规律，可以阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物及致癌物的作用机理，对于寻找副作用 小、疗效好的抗癌药物母体和进行体外筛选抗癌药物，研究抗癌药物在生物体内治 疗疾病的本质具有重要意义。另外，d n a 与其他分子相互作用模式、作用机理等 方面的研究对于筛选高灵敏度、高选择性的电化学活性标记物以及d n a 杂交信号 的有效转换及检测具有重要价值 1 2 1 小分子种类 一简单金属离予 2 一些金属离子，特别是一些过渡金属离子，它们能与d n a 发生缔合作用，使 某些d n a 的结构发生改变 9 - 1 0 l 。游离的金属离子可直接与d n a 发生作用，单价金 属阳离子易于通过分散的“离子云”与d n a 结合，从而非特异性地稳定核酸的二级 和三级结构。单价阳离子与d n a 分子小沟内的a t 区结合会导致d n a 弯曲，并使 小沟变得更狭窄。二价金属离子经常对核酸产生特异作用，例如能使d n a 弯曲， 使r n a 分子折叠，也可作为核酸酶的输因子等。二价金属离子通过与核酸碱基或 磷酸酯键上的氧结合而形成外表面或内表面的连接方式，这样便降低了相邻带负电 的磷酸基团间的静电排斥，从而使d n a 双螺旋结构更稳定。 二金属配合物 无机离子金属配合物，尤其是过渡金属离子配合物构成了d n a 靶向化合物的 一大类，这类化合物具有两大用途：( 1 ) 可望设计成人工核酸酶，从而实现对d n a 链上某些位点的特异性剪切；( 2 ) 可望设计并合成出性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒 剂。 ( 1 ) 金属卟啉配合物 卟啉是一类广泛存在于自然界的重要的生物活性物质，除了n a 、k 、l i 与卟啉 形成2 ：1 配合物，几乎所有的金属都与卟啉形成1 ：l 配合物。d n a 的骨架一磷酸链是 带负电荷的，由于阴、阳离子的静电作用，一般情况下，阳离子卟啉配合物与d n a 的结合比阴离子、强极性非离子型卟啉配合物强。故有关阳离子卟啉配合物与d n a 相互作用研究报道也最多【l ，这类阳离子卟啉不仅在癌症与肿瘤的光动力疗法中有 诱人的前景【1 2 l ，而且具有抗逆转录病毒作用。一般认为，没有轴向配体的金属卟啉 阳离子优先嵌入结合在5 一c g 一37 ( c 胞嘧啶，g 鸟嘌呤) 序列的碱基对平面之间i i ”， 同时引起d n a 构象相应的变化【1 4 l 。具有轴向配体的金属卟啉阳离子因其产生较大 的空间阻碍，则以空间匹配及静电作用优先对d n a 螺旋小沟中连续的a t ( a - 腺嘌 呤，t _ 胸腺嘧啶) 碱基对 a 】n 【q n ( n 2 ) 识别。除了中心金属离子、卟啉母核上的 取代基体积及卟啉的荷电性以外，溶液的离子强度也是影响卟啉和金属卟啉与d n a 结合模式的一个重要因素。 ( 2 ) 其他过渡金属配合物 自从顺二氯二氨合铂( i i ) 的抗癌活性被发现以来f 1 “，有关顺铂及其他有类似 结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非常活跃【1 7 18 1 。大量研究表明，这 类药物的抗癌活性与其和d n a 链共价结合并导致d n a 结构变化的能力密切相关 1 9 1 。由于顺铂及其类似物具有很强的毒副作用，而且某些肿瘤对它们产生抗药性， 所以开发能克服抗药性或具有广谱抗肿瘤活性的铂配合物成为目前及今后研究的 重点。 具有四面体结构的铜配合物、八面体结构的过渡金属( 如r u 、r h 、c o 、t i 等) 配合物与d n a 相互作用的研究也受到大量关注。例如r u 配合物具有独特的发光性 能，而且热力学稳定性好，使其成为研究d n a 性质的一种有效的光物理和光化学 探针【2 0 2 1 1 。另外，r u 配合物还可作为d n a 损伤的光敏剂【2 2 】，即活化的r u 配合物 与d n a 嘌呤间电子转移产生鸟嘌呤自由基，经一系列反应，最终导致d n a 断链。 关于c o ( p h e n ) 2 ”( p h c n 1 ，1 0 菲咯啉) 与d n a 的相互作用，普遍认为是配体1 ，l o 一菲咯 啉环平面嵌入d n a 的碱基对之间所致。但p a n g 等人【2 3 l 的研究表明，在较高的离子 强度时，c o ( p h c n h 2 + 与d n a 的相互作用表现为嵌入相互作用，丽在较低离子强度 时则为静电相互作用。这说明嵌入相互作用和静电相互作用随离子强度不同可以相 互转化。 三d n a 靶向抗生素 d n a 靶向抗生素包括多肽及蛋白质类抗生素如博莱酶素、葸环抗生素如阿酶 素及道诺酶索、烯二炔抗生素和乙撑亚胺型抗生素等。博莱酶素的抗癌活性被认为 是在f e 或c u 等具有氧化还原活性的金属离子与氧同时存在的条件下，断裂d n a 所致。关于阿酶素的生物活性机理研究，迄今有两种观点；一种认为阿酶素通过经 典的嵌入结合直接与d n a 相互作用而导致对d n a 复制及转录过程的抑制( 2 4 】：另 一种观点认为阿酶素可诱导氧自由基的形成，从而对核酸进行切割1 2 ”。相关研究表 明烯二炔类抗生素是通过与d n a 序列特异性结合并进而引起单链d n a ( s s d n a ) 或双链d n a ( d s d n a ) 的损伤而表现出生物活性。丝裂酶素作为一种临床上常用 的重要抗肿瘤剂，是乙撑亚胺型抗生素的代表物质，丝裂酶素的抗肿瘤能力及强细 胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。作为一种生物还原性烷化剂，丝 裂酶素与d n a 结合之前，必须经过一系列还原活化过程，活化后的丝裂酶素先与 d n a 结合使之单烷基化，然后产生双烷基化产物脚l 。 四一些杂环基染料 一些多环芳香小分子，分子体积小，并具有一定的刚性平面，它们可以嵌入到 d n a 分子双螺旋结构的碱基对中。具有电活性的药物小分子可以作为研究电极表 面d n a 分子杂交的探针，用于观察与d n a 碱基对的嵌入作用。 1 2 2 作用模式 小分子与d n a 结合的部位是d n a 的碱基、磷酸骨架和戊糖环。d n a 链上平 行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及d n a 螺旋链形成的大沟、小沟组成小 4 分子识别位点。作用方式大致可分为三种：非共价结合、共价结合和剪切作用。 一非共价结合 非共价键最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水作用等。非共价键属于弱 作用力，但在分子水平的生命现象中上述的作用力却是一种决定性的因素，形成了 核酸生物功能所需要的空间结构。非共价键结合的程度和方式与具体的环境条件有 关。其主要包括三种不同的结合方式即：静电结合、沟结合和嵌插结合。 ( 1 ) 静电结合( e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ) ：即分子通过非特异性的相互作用结合于 带负电荷的d n a 双螺旋外部。一般认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架。 s h a k e d 等人【2 7 】认为d n a 分子表面由静电力形成的水化层中水分子的排列与碱基有 关。 ( 2 ) 沟结合( g r o o v e b i n d i n g ) ：即分子通过疏水作用与d n a 的大沟或小沟的碱基 对边缘直接作用。静电结合与沟结合作用一般不会造成d n a 的构象发生变化。很 多蛋白分子与d n a 特异性的结合是通过d n a 大沟区作用，而药物小分子因其分子 体积小多数在小沟区作用。大小沟区在电势能、氢键特征、立体效应及水合作用上 都存在很大的不同。典型的小沟区结合的药物分子多含有几种简单的芳香杂环结构 单元组成，如呋喃、毗咯或苯环等，这些芳环由扭转自由的键来连接，由此产生合 适的扭转力来配合小沟区内的螺旋曲线，取代沟区的水分子，并与d n a 双螺旋中 沟区的碱基对边缘通过范德华力相互作用，分子上的- n i l 基团可以同碱基对形成氢 键。小沟区是a ：t 富集区，它与g ：c 富集区相比更窄一些，更有利于形成范德 华力，小分子主要在t 的c 2 位的0 或a 的n 3 形成氢键，同时a ：t 富集区的 负电荷大于g ：c 富集区，有利于带正电荷的小分子进入沟区，p u l l m a n 等人【2 8 】已 经说明了d n a 的a ：t 小沟区的负的静电势大于g ：c 富集区，是形成d n a 沟区 特异性作用的一个静电因素。 总之，药物小分子能够选择性地与d n a 中a ：t 富集区，通过氢键、范德华 力等作用，非嵌入地缚住d n a ，从而阻止d n a 的模板复制，起到了抗病毒、抗肿 瘤的作用。 ( 3 ) 嵌插结合( i n t e r c a l a t i o n ) ：平面芳香环系统通过离域霄体系间的百- 1 r 相互作用 及疏水作用嵌入d n a 碱基对之间，是药物分子与d n a 发生作用的最重要形式之一。 嵌插结合往往会改变脱氧核糖磷酸骨架的的扭转角以使相邻碱基对间距离足够大 至允许插入该分子，随后d n a 结构会发生进一步的变化，例如弯曲或解链以有利 于嵌入过程的完成。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基之间后，有的可以直接抑制 d n a 的复制、转录的功能；有的则经过进一步活化后，使d n a 断裂受损进而影响 其功能。 影响药物嵌插方式的因素最具有影响的理论是两级互补理论1 2 9 ，具体面言，其 存在以下影响因素： ( 1 ) d n a 的结构不同构型的d n a 与同一化合物作用时其键合方式可能会有 所不同。 ( 2 ) 化合物的形状化合物的形状与d n a 的匹配程度决定了药物与d n a 的作 用方式，采取刚柔结合的设计思路，即有嵌入d n a 碱基对之间的刚性平面为插入 点，又有与d n a 特异结合的柔性侧链作为导向连接结构，且末端具有能断裂d n a 的生物活性部位的不同系列化合物，有利于嵌插作用。 ( 3 ) 插入基团化合物以嵌插方式与d n a 结合要求药物的插入基团要有较好 的平面性，适中的平面面积和疏水性。药物的插入配体的平面面积与插入强度成正 比，但当增大的面积与插入基团不在同一平面内而使空间位阻增大时，药物与d n a 的作用反而会减弱；当插入基团相同，适当增加辅助支链的疏水作用，也可增强药 物与d n a 的结合【”“】。 ( 4 ) 取代基的差异当药物嵌入d n a 时，取代基空间位阻过大就会减弱这种作 用，虽然大的取代基不利于嵌入剂与d n a 相互作用的动力学因素但却有利于其与 d n a 碱基之间的堆积作用，些非融合型链状芳环系统的嵌入剂分子的末端带有 正电荷而与d n a 之间也有嵌入作用，这很象小分子与d n a 沟槽结合的模式。同一 取代基，占据不同的位置时，生物活性不一样，而且取代基不同，药物的生物活性 也会发生很大的变化，但是与未取代的化合物相比，无论是亲电子基团还是斥电子 基团的取代都会增强小分子与d n a 的结合强度。 二共价结合 共价结合包括与亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。主要表现为d n a 的烷 基化及d n a 的链间交联和链内交联等，与非共价结合相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要强的多，小分子与特定碱基作用并形成加合物， 使d n a 双链解旋并产生弯曲。如顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上 相邻鸟嘌呤的n 7 共价结合形成链内加合物，使d n a 双链解旋并产生弯曲p 2 挪l 。 三d n a 断裂 d n a 修复、转录和突变是很重要的一个生物学过程，具有剪切作用的分子断 裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。 b l m ( 博莱霉素) 是一种典型的d n a 切割化合物，其分子结构的特殊性使其 能够识别并结合在d n a 中5 c , c - 37 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最 6 终导致d n a 断链。这种双功能性对于设计人工核酸酶和发展有效的抗肿瘤药物都 有非常重要的指导意义。事实上，大量研究已根据这一原理把对d n a 具有剪切功 能的分子与能对d n a 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合成序列特异性更 高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 2 3 研究方法 一电化学方法 电化学方法是一种简便、快速、灵敏及无放射性污染的原位方法。大部分药物 在生物体内需要经过氧化还原而发生生物转化，这种氧化还原和电化学过程都具有 电子传递的共性。另外由于电极溶液界面的双电层与荷电生物界面结构具有很强的 相似性，并且可以根据不同需要在电极表面通过形成自组装膜以模拟细胞膜等生物 界面，因此将电极电解质溶液界面所构成的体系作为一种模拟细胞内环境来研究生 物体内d n a 复制及转录过程相关的基本问题具有重要科学意义和实用价值【3 5 1 。 电化学方法研究d n a 与其他分子的相互作用主要基于d n a 分子对特定体系所 引起的伏安特性的差别，包括由于结合引起的体系式电势旧7 ) 的移动，小分子与 d n a 相互作用结合后，其扩散系数( d 1 值大幅度的下降，导致扩散电流的减小等电 化学行为的差异【3 ”。 溶液电化学方法研究d n a 与其他分子的相互作用已取得了许多有价值的成果 3 8 - 3 9 ，得到了一系列有指导意义的规律。例如，b a r d 等人关于一系列过渡金属配合 物与小牛胸腺d n a 结合作用的研究结果表明，当溶液中电活性的分子与d n a 静电 结合时，体系的氧化还原峰电势点p 及式电势f 将负移；而当结合为嵌入作用时， 系的氧g 还原峰电势e b 及式电势f7 将正移，为电化学方法研究d n a 与其他分 子作用模式提供了初步的判断依据。 随着d n a 研究的不断深入，早期基于悬汞电极或碳电极而发展的传统极谱法 或伏安法由于受到方法灵敏度、电极材料、样品消耗量等因素的制约，已经难以满 足现代核酸研究所提出的高灵敏度、低消耗及微量化等要求。在此背景下，提出了 一种基于d n a 修饰电极的表面电化学方法【4 0 训1 。 d n a 修饰电极的基底电极有悬汞电极【4 2 j 、碳电极( 包括玻碳电极【4 鲥、碳糊电 极f 4 4 l 、普通石墨电极4 5 、热裂解石墨电极脚】) 、模板印刷碳条电极f 4 7 】、金电极i 鹅】 等。按化学修饰电极表面微结构的尺度分类，有单分子层( 包括亚单分子层) 和多 分子层( 以聚合物薄膜为主) 两大类型的修饰c m e 。按修饰电极的制备方法分类， 制备单分子层的主要有共价键合法【4 9 1 、吸附法【5 0 】、欠电位沉积法【5 ”、l b 7 ( l a n g m u i r - b l o d g e t ) 膜法1 5 2 j 、s a ( s e l f - a s s e m b l i n g ) 5 3 】以及分子沉积膜法 5 4 1 ；制 各多分子层的主要方法是聚合物薄膜法瞄j 和气相沉积法【5 6 】。 随着表面电化学方法的出现，溶液中电化学研究d n a 与其他分子相互作用过 程中的些缺点得到了改观。庞等入首先提出利用d n a ( 或基因) 化学修饰电极 因相互作用而产生的“表面放大”效应研究d n a ( 或基因) 与其他分子的相互作用， 并建立了一种研究d n a 与电活性小分子相互作用的微量研究方法，不仅获得了与 b a r d 溶液电化学方法研究相吻合的规律，而且仅用数微克d n a 就可获得许多相互 作用的热力学及动力学参数，包括结合位点( s ) 、结合常数) 、结合分子氧化态与 还原态结合常数的比值、结合自由能( g b ) 、相互作用模式( 嵌入或静电) 、相互 作用性质的转变过程、离子强度为零的极限情况下结合常数的比值，以及结合离解 速度常数等。发现在一定条件下d n a 修饰电极与电活性分子相互作用性质可用 d e b y e - h i i k e l 理论来描述 $ 7 - 5 8 j 。 m a e d a 等人【4 8 】研究了抗疟药阿的平在d n a 修饰电极上的电化学响应。结果显 示，d s d n a 修饰电极对f e ( c b 0 6 3 f e ( c n ) 6 4 - 电对的峰电流产生抑制，但加入阿的平 后。峰电流增大，在( 1 5 ) 1 0 7 m o l l 范围内指示化合物铁氰化钾的阳极峰电流的峰 高与阿的平浓度成正比，同时，用n a c l 溶液做对比实验，证实阿的平与d n a 分子 发生强烈的特异相互作用。为研究某些药物与d n a 的相互作用机理，建立简便的 药物筛选方法作了探索性的工作。另外，可借助电化学方法通过研究非电活性分子 核电活性分子与d n a 竞争相互作用来研究以d n a 为靶的非电活性分子与d n a 的 相互作用。例如方【蜘等人利用c o ( p h c n ) 3 2 + 这一电活性分子为指示剂研究了一种在所 研究的电势范围内为非电活性水溶性c # o 衍生物与d n a 的相互作用，得到了其与 d n a 作用的结合常数等有价值的信息。 二光谱法 ( 1 ) 紫外一可见( u v v i s ) 光谱法 含有碱基生色团的双螺旋结构的d n a 分子，其u v v i s 吸收光谱在2 6 0 r i m 附 近有一强吸收峰【6 “，且某些分子如金属配合物亦有吸收谱带，可根据相互作用前后 d n a 或其他分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断： 对于d n a 的吸收光谱来说，如导致分子的轴向变化即其构象变化，则产生减 色效应及红移现象，且作用越强减色效应越明显；如导致d n a 双螺旋结构的破坏， 则产生增色效应【6 z 】。 对于金属配合物等分子的特征吸收带，如该分子与d n a 发生嵌插作用，则该 分子的吸收光谱峰出现减色效应及红移现象，且作用越强减色效应越明显：如该分 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 子与d n a 发生静电作用或沟槽作用，则该分子的吸收光谱峰出现增色效应及蓝移 现象 6 3 】。 热和碱的作用可破坏d n a 双链螺旋结构，使双链变成单链，吸光度a 2 6 0 增大。 小分子与d n a 结合后会给这种变性带来影响，进而也可考察小分子与d n a 的作用 方式。嵌插作用对d n a 的双螺旋结构起稳定作用，可导致熔链温度t m 值增大 5 8 ，而非嵌插作用的小分子不会使t m 值增大如此明显。 ( 2 ) 荧光光谱法 荧光光谱法是一种研究具有荧光特性靶向化合物的理想方法，根据相互作用前 后荧光强度的变化，对二者作用模式进行判断。对于自身荧光较低的某些配合物来 说，当与d n a 发生嵌插作用时，荧光猝灭受到抑制，配合物的荧光强度增强【6 4 1 ， 对于自身荧光特性的某些药物分子，可借助于荧光探针溴化乙锭、丫啶橙、二氨基 丫啶等对药物与d n a 的作用模式进行判断。曹等人【6 5 】用光谱法研究了邻苯二胺 过氧化氢一过氧化酶体系与d n a 的相互作用。体系的吸收峰随加入d n a 浓度的增 加而不断减小，而且特征吸收峰红移。随着d n a 浓度的增加，体系的激发光谱和 发射光谱的荧光强度都明显降低，同时发射光谱出现紫移现象，与吸收光谱有很好 的镜像关系，说明体系嵌插入d n a 与d n a 形成了络合物。 ( 3 ) 圆二色谱技术 c d 光谱以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构 型、构象和反应机理的研究提供了很多信息，是目前研究溶液状态生物分子二级、 三级及四级结构变化的最理想方法。可现场检测构象己知的生物大分子构象变化过 程；c d 是d n a