（微生物学专业论文）高效溶藻细菌混合溶藻特性的初步研究.pdf

中文摘要 有害藻类水华的频繁暴发已成为世界性的环境灾害。溶藻细菌作为水华生物防 治的可能途径，已经引起了国内外不少学者的关注。我们选择武汉市富营养化池塘 为采样点，采用改良培养基法分离得到了四株溶铜绿微囊藻的细菌，编号分别为a 1 、 a 3 、a 4 、a 5 。通过革兰氏染色、菌落形态特征以及生理生化指标的测定，其中菌株 a 3 、a 4 经初步鉴定，分别属于沙雷氏菌属和微球菌属。 实验结果表明：在溶藻效果上，菌株a l 、a 4 的溶藻效果均较好，在1 0 5 c f u 的浓度，分别经过4 天、2 天可盼全部裂解藻细胞，而菌株a 3 、a 5 的溶藻效果较 差，仅能杀死部分藻细胞，只在一定程度上抑制藻细胞的生长；在溶藻方式上，溶 藻细菌a l 、a 3 、a 4 、a 5 均通过直接方式溶藻；在溶藻范围上，菌株a 4 的溶藻范 围较广，其它三株溶藻细菌的溶藻范围较窄；在溶藻细菌保藏方面，溶藻细菌与黄 化藻样共保藏易于溶藻细菌活性的保持，且保藏时间也较长。 我们还探讨了不同的溶藻细菌混合溶藻，以寻找最佳的混舍溶藻细菌搭配，实 验表明：在溶藻效果上，菌株a 3 ta 4 的混合菌群，与单株细菌相比，其溶藻效果 更好。并且菌株a 3 、a 4 按不同比例混合，其溶藻效果均较单株细菌溶藻效果好， 通过菌落平板计数法发现，菌株a 3 、a 4 按不同比例混合，经过传代培养后，两株 菌的数量比均趋近为1 ：1 0 ，这也说明了菌株a 3 、a 4 的混合菌群有一定的稳定性； 在不同的温度和光照条件下，混合菌群的溶藻效果比单株溶藻细菌更好；在溶藻方 式上，混合菌既可以通过直接方式溶藻，也可以通过分泌某种胞外物质溶藻，且这 种物质对热有一定的稳定性。 关键词：铜绿微囊藻；溶藻细菌；混合；溶藻效果 a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo f h a 盯n f u la l g a lb l o o m s ( h a b s ) h a sr e c e m l yi n c r e a s e di nf r e q u e n c y a sal o n g t e r mt r e n do nag l o b a ls c a l e a l g i d d a lb a c t e r i ai sn o wt h o u g h tt h a t 也o s e b a c t e r i am a yt e n n i r l a t eh a n n f u l “g a lb l o o m sa n dr e g u l a t ea l g “p o ”l a t i o nd y n a m i c si n b o m 丘e s h w 卸七e ra n dm a r i n ee n v i r o n m e m s n o wm o r ea n e m i o n sh a v ef b c u s e do n 也e i s s u et h a ta i g i c i d a jb a c t e r i aa c t e da sap o s s i b l ef a c t o rt om i t i g a t et h ea d v e r s ee f f b c t so f h a b s w a t e rs 锄p l e sw e r ec o l l e c t e d 舶mt h es u r f a c eo fe u 打o p m cp o n d si nw u h a l lc 吼 t h e nm o d i f i e di n f 色c t i v em e m o d si nb o t l l1 i q u i da i l da g a rm e d i aw e r ec 枷e do u tt o i s o l a t ea l g i c i d a lb a c t e r i aw h i c hc a i ll y s eo ri n h i b i ta l g i c i d a l - w eh a v e d e v e l o p e da 1 1 e 丘j c j e n tm e t h o df o ra l 鲥c j d a jb a c t e r j ai n 矗_ c s h w a t e tf o u rs 拄面n sa i 譬i c j d a lb a c t c aw e r e o b t a i n e d f o l l rs t r a i n sa l g i c i d a lb a c t e r i aw e r ei s o l a t e d ，t h e yw e r el a b e l e da 1 ，a 3 ，a 4 ， a 5 t h e i rp h y s i o l o g i c a la r l db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e si n d i c a t e dt h a ta 3a 1 1 da 4 、v e r e c h a r a c t e r i z e dt ob es e ，r 品妇口垃三da n d 埘c ，口c d c c “占c b 向n t h ee x p e 嘞n e n t a lr e s u l ti n d i c a t e dt h a t ，n l el ”i ce f r e c to fb a c t e r i as t r a i n sal ，a 4 、v a sb e t t e r 也a nb a c t e r i as t r a i n so f a 3a n da 5 i nt h ec o n c e n t r a t i o no f1 0 8 c fu t 1 1 es t r a i n s o fa 1 觚da 4c o u l dl y s ea l g a cf o rf o u rd a y sa n dt w od a y s b mi ns a m ec o n c e n t r a t i o n ，山e s 订a i n so fa 3 ，a 5o n l yc o u l dl y s ep a r t i a la l g a ec e l l s ，t h e yo n l yr e s t r a i n e dm eg r o w m o f 触c 阳 f 括盘p r 配g f 开口s 口i nm ec e n a i nd e 鲈e e ；t h eb a c t e r i as t r a i n sa 1 ，a 3 ，a 4 ，a 5a l l l y s e dt h ea l g a eb yt h ed i r e c tw a y ；t h ea l g i c i d a lr a n g e so fs t r a i n sa 4w a sb r o a d l y ，o t h e r t 1 1 r e eb a c t e r i as t r a i n sw e r en a r r o w e r ； i nt h ea l g i c i d a lb a c t e “ap r e s e “a t i o na s p e c t ， a i g i c i d a i b a c t e r i aa 1 1 dt h ei y t i c a i g a et o g e t h e rp r e s e r v e dw a se a s yt om a i n t e n a n c e a l g i c i d a lb a c t e r i aa c t i v i t ya n dp r e s e em u c hl o n e l w em i x e dd i 任b r e n ta l 西c i d a lb a c t e r i as t r a i n st og e tm o r ee f f i c i e n tm i x e ds t r a i n s n l e e x p e r i m e mi n d i c a t e d ：t l l e1 y t i ce f f e c t so f m i x e ds t r a i n so f a 3 + a n da 4e x c e l l e dt h a to f a n v s i n g l es t r a i n s a tt h es a m et i m e ，t h el ”i ce f r e c t sw e r ec o n s i s t e mi na 1 1 yp r o p o 币o m i x e d ( 1 ：1 0 ，1 ：1 ，1 0 ：1 ) s t r a i n a 3a n da 4 t h r o u g ht e l l ( i n gc o u n to f c o j o n yo f b a c t e r i ai n d i c a t e d ： s t m i na 3a n da 4a r e rt h ed i f f 矗e n tp m p o r t i o nm i x e d ，t h et w os t r a i n sw a sa p p r o a c h e d 1 ：1o ，t l i sa l s oe x p l a i n e dm i x e ds t r a i na 3a n da 4w a sc e r t a i ns t a b i l i t va tt h ed i h 毫r e n t t e m p e r a t u r ea n di l l u m i n “o nc o n d j t i o n ，t h el y t i ce f 诧c t so fm i x e ds t r a i n se x c e l l e dt h a to f 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a n ys i n gs 缸a i n t h eb a c t e r i as t r a i n sa 3 ，a 4b o t h1 y s e dt h em i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ab yt h e d i r e c tw a y ，b u tt h em i x e ds t r a i n so c c u r e dc h a n g e ，s i n c et h e y 1 y s e dm e 蚴c 阳叫，廊 口p ，“彰h o j db ym ed i r e c t 、a y ，a l s os e c r e t i n gc e r t a i ne x t r a c e l l u r es u b s t a n c e sl y s e d 也e 蚴c 加廊口e ，。胛d j 日，a n dt h es u b s t a n c e sw a sg t e a d yi nh i g ht e r r 啦e r 咖r e i ( a yw o r d s ：脚c ，d 9 百出口口r 甥j 日；a l 百c i d a lb a c t e r i a ；m i x e d ；1 y t i ce d 宅c t 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果出本人承担。 作者签名：同脚魄砖j 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：阊脚 日期：p 锌s 月厅日 导师签名 嗍沙年口霸 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定孚受相关权益。圃垂途塞量变后溢唇! 旦圭生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名：同御 日期：妒年j 月缪日 导师 日期 益 第一章文献综述 1 。蓝藻水华及蓝藻毒素的危害 1 1 蓝藻水华及危害 在环境条件适宜时，某些蓝藻能快速生长，当达到一定的生物量时，这些藻类 在水体表层大量聚集，形成肉眼可见的藻类聚集体，即蓝藻水华( w a t e rb l o o m ) 。 水华主要是由蓝藻大量繁殖引起的，其中2 1 属近5 0 种是产毒的，主要包括鱼腥藻、 束丝藻、微囊藻、节球藻、念珠藻和颇藻等，其中微囊藻是引起水华的主要藻种川。 蓝藻水华是由水体富营养化所产生的严重后果，是目前世界各国所面临的重大环境 问题。我国是蓝藻水华分布最广，遭受影响最大的国家之一。水华藻类在水面堆积， 不但散发鱼腥具味，严重破坏景观，而且堵塞管道，迫便水厂停水。大规模的蓝藻 水华降低了水资源的利用效能，引起严重的生态破坏及巨大的经济损失，而蓝藻毒 素的产生给公众健康带来极大隐患。目前，引起人们更大关注的是蓝藻毒素所带来 的危害。 1 2 蓝藻毒素及其危害 蓝藻毒素是有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素 2 】，多种 蓝藻能产生有毒物质，在它的2 0 多个属的5 0 多个种可以产生毒素，其中研究较多 的是微囊藻属( 矗c 阳c 埘括) 、鱼腥藻属( 4 砌6 口p 舰) 、颤藻属( 伪c f 妇幻r 妇) 、念珠 藻属( 协向c ) 、鞘丝藻属( 劬鱼炉) 、束丝藻属( 4 p 日月肋埘e n d 胛) 等。蓝藻产生的 毒素多为次生代谢物，分为四种神经毒素( n e u r o t o s i n s ) 、肝毒素( h e d a t o t o x i n s ) 、 脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) 和非专性毒素( n o n s p e c m ct o x i n s ) 。其中肝毒 素在淡水蓝藻中撮常见，可见有微囊藻、鱼腥藻、节球藻、念珠藻、颤藻等产生， 主要有微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，m c ) 、节球藻毒素( n o d u l a r i n ) 和简胞藻毒素 ( c y l i n d r o s p e 珊o p s i n ) 三种。在已发现的各种藻毒素中微囊藻毒素分布最广，对入 的危害也最大。 微囊藻毒素( m i c m c y s t i n ，m c ) 是一类在蓝藻水华中出现频率最高、造成危害 最严重的藻毒素。m c 是一组七肽单环肝毒素，相对分子量都在1 0 0 0 【4 】左右，其基 硕士学位论文 m a s t er 1st h e s i s 本结构由7 个氨基酸组成的环状多肽，由于多肽组成中氨基酸种类的变化，导致了 该类毒素的多样性。m c 可以形成多种不同的异构体，到目前为止在淡水中已发现 6 0 多种j 。其中含量较多，存在较普遍，毒性较大的是l r 、r r 和y r 。 m c 是藻细胞内毒素，当藻细胞衰老、死亡后，毒素被释放到水体中。大面积 严重的藻类水华发生会使水体中的毒素浓度达到m g l “水平1 5 。 由于已有许多研究表明微囊藻毒素对动物和人类都具有明显的毒性效应，因 此，m c 对人和动物的饮用水安全、以及水生态系统的稳定均已构成严重的威胁， 水体m c 污染已成为我国以及许多其它国家水环境的突出问题之一【6 】。 研究表明，含一定浓度藻毒素的水体可使鱼卵变异，蚤类死亡，鱼类行为及生 长异常，水华暴发更可使大量水生生物死亡；另外，在水生脊椎动物及无脊椎动物 体内积累的藻毒素，包括鱼、贝和浮游动物等，有可能通过食物链的累计效应而危 害人体健康1 7j 。而且含毒素的蓝藻细胞在水体中的迁移，如与粘土共沉淀，或被水 生生物捕食后随其颗粒排泄物沉淀等途径，使毒素积累并滞留在底质中，对水环境 可能产生影响。部分毒素还随藻细胞和悬浮物沉淀进入沉积物中，有报道指出底泥 中吸附的毒素可达1 3 m g l 2 4m g l d 【g 】。 蓝藻毒素能引起哺乳动物、鱼类、鸟类等中毒甚至死亡，从而对畜牧业和水产 养殖业造成很大的经济损失，更为严重的是，它能够通过多种方式影响人类自身的 健康。如皮肤接触含藻毒素的水体可引起敏感部位和皮肤过敏；少量饮用可引起急 性肠胃炎：长期饮用则可能引发肝癌。我国对蓝藻毒素曾作过相关的调查，结果表 明南北几个省市的各种水体均有不同程度的m c 污染，其中以沟塘水、河水、水库 水较为严重，对我国肝癌高发区江苏海门和启东两地进行了饮水与肝癌的病例对照 和前瞻性研究，结果显示饮河沟水居民患肝癌的危险较饮井水或自来水居民高，有 学者认为蓝藻毒素是引起我国南方肝癌高发的主要危险因素之( u e n o y l 9 9 6 ) 9 】。 1 9 9 6 年巴西一透析中心，因透析液遭蓝藻毒素污染，导致1 3 0 名病人中有1 1 6 人出 现异常症状，并有2 6 人最终死亡。世界卫生组织制定了饮用水中蓝藻毒素的控 制标准为l g l 【1 ”。 2 目前水华治理的主要方法 2 1 化学方法 化学方法主要是通过筛选和合成化学药剂也称杀藻剂来控制水中藻类的繁殖。 2 硕士学位论文 m a s t er st h e s i s 其机理一方面通过金属离子抑制藻类的正常代谢而达到杀灭藻类的目的，另一方面 则通过金属离子的絮凝作用沉降藻类而达到去除藻类的目的。有机溴杀藻剂、铜盐 f 硫酸铜、氯化铜) 、高锰酸钾等是应用较多的杀藻剂。其中硫酸铜是最为常见的杀 藻剂，铜离子作用于蓝藻藻胆体，抑制其对光能的吸收和传递，从而具有较强的杀 藻效果。但铜离子容易富集并且硫酸铜能使藻毒素从藻细胞内释放入水中 12 】。铝离 子和铁离子都有较强的絮凝作用，滇池在对聚铝和聚铁的测试中其除藻率分别为 5 3 8 和8 4 9 ”。化学除藻法能立卡t 见影，但它不可避免地将造成环境污染或破 坏生态平衡，所产生的负面效应非常严重，而且难以消除，可以说这是一种短视行 为或是一种权宜之计且在水源水体中施用杀藻剂后，死藻仍留在水体中，营养物质 不能移出水体，必须连续间歇加注，因此耗药量大，且费时费力。 2 2 物理方法治理水华 物理法主要采取截流、疏浚、稀释和污水分流等措施。物理方法有费时、费钱、 操作困难的缺点。向水中播洒粘土清除蓝藻水华也是比较有效的方法，m 0 0 y o u n g h a n 1 等利用轨道分析法从水动力学和粒子之间作用力的角度研究了粘土对 水华蓝藻的清除效率，发现粘土颗粒大小与藻华相近时的清除效率最高，并且认为 水中的离子作用力对藻类水华的清除起了关键的作用。 2 3 生物学方法 蓝藻水华是由水体富营养化所造成的，是一个典型的生态问题，生态问题只能 用生态学方法去解决。控制和治理藻华的关键是找到一种能够直接有效杀死或者抑 制藻类生长的因子，经济而便于大规模使用，而且不会造成二次污染。而生物控藻 因子则不会产生类似阀题，是一种很有前景的控藻因子。自然界中有很多生物都可 以抑制藻类的生长，它们主要包括：蓝藻病毒( 噬藻体) 、原生动物、真菌、高等水 生生物、溶藻细菌等。 2 3 1 蓝藻病毒防治水华 根据宿主的不同，藻类病毒可为原核藻病毒和真核藻病毒，原核藻病毒即蓝藻 病毒，它们与噬菌体的形态、结构、分子组成以及对宿主的感染方式极为相似，被 归于噬菌体一类，因而也被称作“噬蓝藻体”或“噬藻体”【1 5 i 。而真核藻病毒或病 毒类粒子( v i m s l i k ep a r t i t l e s ，v l p s ) 则一般为多面体的粒子，它们是完全不同于蓝藻 病毒或噬藻体的病毒类型，所以有关藻类病毒学的研究，通常是将它们分开进行的。 硕士学位论文 m a s t er ，st h e s i s 早在七十年代就进行了原核藻病毒或噬藻体比较细致的研究，如感染l y n g b y a ， p l e c t o n e m a ，p h o r n l i d i u m 三类藻的、分布最广的“l p p 型”噬藻体，和感染 a n a c y s t i s n i d u l a l l s 和s y n e c h o c o c c u 、的“a s 型”噬藻体，已经有了多年的研究积累； 而真核藻病毒或vl p s 虽然自七十年代初发现至今已经多年了，但是对它们的研究 要微弱得多，可以说尚停留在很表面的层次上，除了感染与革履虫p a 础1 e c i 哪 b u r s a r i a 管内寄生的“p b c v ”型之外，其它的真核藻病毒或v l p s 的定性和感染宿 主的情况所知甚少。 病毒或vl p s 不仅广泛存在于各种水环境中，同时也是浮游生物的活跃的成员 1 1 6 ；病毒或v l p s 在海水中的浓度高达1 0 4 1 0 9 粒子m 1 ，大大超过了传统的推断【1 7 】。 淡水中的含量也高得惊人，例如对挪威r a u l l e f i o r d e n 湖春季硅藻水华期间的病毒粒 子含量的测定，水华前为1 0 5 个，m l ，水华高峰期间为1 3 l o7 个r n l 【1 8 】。因此病毒 或vl p s 在浮游生物群落演替中可能具有极其重要的作用，是通过特异性溶解宿主 来维持种群关系平衡的关键因子”。病毒或v l p s 对浮游植物群落及初级产物的影 响也有不少报道。例如、协e n e n 等人2 0 】对自然水体中的p b c v 效价进行了测定， p b c v 在c h l o r e l l a 藻苔上的噬藻斑单位( ( p f u ) 高达4 1 0 4 n 1 l 水。最近已有病毒溶 解水华的报道。如1 9 8 5 年以来，美国纽约的罗德岛( r h o d ei s l a l l d ) 附近的海湾每年 夏季都发生一种叫做“褐潮”( b r o w n t i d e ) 的大水华，高峰时藻密度高达到10 9 个m l 。 尽管这种水华来势凶猛，但是总是突然地消失。经研究发现，这种由金藻的彳 “地d c o c c “s 硎印 螋腮旭n s 引起的水华之所以突然地消退，是由于藻的细胞中出现 了大量的病毒，这些病毒特异性地在该藻的细胞中繁殖，并目传染性极强，所以很 快将整片水华溶解掉。 由于在水华和产毒蓝藻中常发现藻细胞中含有病毒和v l p s ，病毒和v i p s 也许 能用于对水华的控制和抑制有毒藻类的生长op r o c t e r 和f u m a l l 认为，病毒或 病毒类粒子是潜在的海洋生态的重要调节因子；病毒造成的藻溶解明显地导致微藻 群落的消亡，并且病毒作为藻种群的显著的控制因素一如调节藻种群的遗传基因库 忙“、有机溶解物质的水平的保持者，受到了越来越广泛的关注和认可。 有的病毒或v l p s 有“共专一的宿主”( c o s p e c 墒ch o s t ) ，特异性地感染亲缘关 系近邻的一些藻1 2 3 ”】，因此这类病毒可用作转移致死基因的载体，杀死有害或不需 要的藻类。 病毒在海水中含量相当高，通常高于细菌含量，一般是细菌含量的1 0 倍左右【2 5 1 。 n a g a s a k i m l 等研究了赤潮异弯藻( 正把f p 阳j 细眦d 如s 办f w o ) v i r u sc l o n e0 1 ( h a v 0 1 ) 病毒 生长特性，初步探讨了采用h a v 0 1 来治理赤潮异弯藻中的潜伏期为3 0 3 3 h ，在自然 4 硕士学位论文 m a s t er ，st h e s i s 环境中，该病毒具有很高的增殖速度。h a v 0 1 的严格专一性，使其不会对其他生物 产生任何影响。这一研究初步表明，采用病毒治理水华和赤潮在理论上是可行的。 病毒作为控藻因子是安全的，但是病毒对其宿主的侵染具有很高的特异性；病 毒能迅速降低水体中特定的藻类的数量：病毒的复制周期很短，如k p - h e i l l l e s 在德 国c o n s t a n c e 湖中的研究发现，发生水华后的水体中病毒数量增加了7 0 3 8 0 ，估 计每个宿主藻可以释放2 1 1 2 1 个子代病毒。但是，它也有局限性如病毒的专一性使 得病毒不能裂解多种藻类，而且现在的研究还处于理论阶段，还没有实际应用。 2 3 2 真菌防治水华 真菌对藻类的直接影响主要有两个途径：一是释放抗生素或抗生素类的物质， 一是寄生溶藻。 青霉素是青霉菌分泌的种已广泛用于医药和科研的抗生素，青霉素不仅抑制 细菌的生长，而且对藻类也有很强的毒性。k l 珊a r 2 4 l 用青霉素测试蓝藻的敏感性， 发现浓度仅o 0 2 “1 m l 的青霉素就足以抑制组囊藻4 刀口瑚出 确z 肠瑚的生长。早在 6 0 年代就己知头孢菌素c ( c 印向口肠印d ，加c j 是由几个支顶孢真菌爿伽研口珂咖珑 c h ，畛明p “m 的品系及一些丝胞壳属e m 8 r f c p f f d j 竹括的种类【27 j 产生的。头孢菌素c 与 青霉素一样，都是p 一内酞胺( p ，a c t 锄) 类型的抗生素，其作用机制也可能同青霉素一 致；通过抑制粘肤合成的后期酶活性，和阻止初生粘肤与既有的完整粘肤上侧链相 联接，来阻止蓝藻细胞壁中的粘肤层( l 2 层) 的形成。由于失去了主要骨架结构的粘 肽层支持，细胞变形，大多数的细胞变成球形体或原生质体，随后被溶解掉。r e d h e a d 和州g h t 【2 8 j 用头孢菌素c 以及支顶孢属的a c r e m k i l i e n s e ( a l f _ 6 2 ) 的滤液作用于水 华鱼腥藻之后，在电镜下观察到了球形体和原生质体的形成。他们还对头孢菌素c 的致敏浓度进行了测试，发现只使用0 0 2 m l 的浓度为1 0 “g m l 头孢菌素溶液，水 华鱼腥藻的周围就形成了溶藻圈。 真菌在藻类的寄生是比较普遍的，报道最多的寄生的宿主是水绵属印i 彬口妒 的藻类。寄生物有卵菌纲q o m y c e t e s f 2 9 】；细长腐霉尸y 胁f ”研g r 口c 妇；噬藻丝水霉 却 d 胛d 仰彬船p 厅弦印 f ，淞和星状水霉脚加确聊胁甜f e 阳p 向。旭等真菌。、d o n k 和 尉n g e l b e 培在冬季及早春的硅藻水华中发现有壶菌寄生。其中浮游接根壶菌 勿g d 砌拉砌“脚咖”细月耙“脚对美丽星杆藻爿s 据，f d ，z p 砌加，m 口有很强的寄生溶藻效 果，是所记录到的最高感染的例子。例如，在合适的环境条件下，它在美丽星秆藻 中的寄生和繁殖使该藻的生长受到强烈的抑制并使藻水华很快消失。 2 3 3 原生动物防治水华 原生动物是水生食物链中的重要环节，很多原生动物可以取食藻类，有些甚至 硕士学位论文 m a s t er ，st h e s 【s 以藻类为惟一食物，在湖泊和海洋水生态系统中，藻类生物量的下降往往伴随着原 生动物数量的急剧增加【3 0 】。原生动物广泛存在于各种水体和潮湿土壤中，并可共栖、 共生或寄生在动植物及其它微生物的体内或体表。而且原生动物具有取食范围广、 物食量大等优点。但是由于原生动物种类繁多，身体结构各具特点，以及不同种类 对环境条件的要求千差万别，故没有一种采集、分离、培养、固定和观察方法适合 所有的原生动物口” 2 3 4 高等水生生物防治水华 水生植物主要从营养竞争、沉降污泥和释放抑藻素三个方面来影响藻类的种 群。水生植物对营养盐与光照竞争上比藻类有优势。在武汉东湖进行了水浮莲净化 富营养化湖泊的试验研究。研究结果表明：水浮莲对富营养化湖泊中b o d 的去除 率在7 0 以上，总氮去除率6 0 以上，总磷去除率7 0 以上( 邵林广2 0 0 1 ) 【3 孙。1 9 4 9 年h a s l 钉等首次发现了水生植物对藻类的抑制作用。k o g a l l 等( 1 9 7 2 ) 3 3 l 对五刺金鱼 藻进行了研究，发现对蓝藻有非常好的效果。孙文浩等( 1 9 9 0 ) 【3 4 】发现风艰莲对藻类 的抑制除了争夺营养素及光照外，其本身而非根际微生物分泌的克藻物质对藻有明 显的克藻作用，王为东( 2 0 0 1 ) 认为芦苇地下根状茎形成的根孔提供了一个良好的 污染物吸附转化界面，使大量的氮磷污染物在该界面得以截留，水质得到显著净化， 藻类得到有效控制”“。 但是风眼莲是世界上漂浮型水草危害最严重，蔓延最广泛的杂草之一。大量凤 眼莲在水面漂浮堆积在一起，严重堵塞航道，影响水渠排灌，并消耗大量水中氧气， 直接威胁鱼类的生存。在风眼莲侵入并泛滥成灾的淡水域，那里的生物多样性遭到 严重的破坏，一些当地的物种几乎濒临灭绝。所以，凤眼莲本身就对环境和生态造 成了严重危害。其它的水生生物，如水花生、水浮莲、满江红和浮萍等都能分泌物 质抑制藻的生长，但是对于抑藻物质都没有进行精确的测定，如果能从水生生物的 分泌物中分离纯化抑制藻类的物质，既可以避免水生生物本身对环境造成的危害， 又可以控制藻类水华，这可能是今后需要深入研究的重点。 2 4 细菌防治水华 在众多的治理方案中，溶藻细菌( a l g i c i d a lb a c t e r i a ) ，作为水生生态系统中生物 种群结构和功能的一个重要组成部分，对水华和赤潮的控制、维持藻类生物量的平 衡有非常重要的作用1 3 7 。特别是细菌对藻类生长影响的机理研究，更是被人们所关 注。有文献包道：在水华的发生、发展和消亡的过程中，细菌以及细菌和水华藻类 的相互作用是影响藻类生长的关键性的调空因素”1 。而且溶藻细菌直接分离于自然 硕士学位论文 m a s t er st h e s i s ! 竺! = ! 竺! ! ! ! ! ! ! 苎! 兰皇! ! 竺= ! ! ! ! ! ! ! = ! ! ! ! ! ! = ! = = ! ! ! ! = = ! = = ! = ! = = = = = = = = = ! ! ! = = = = = = = = = = = = = = 界，因此使用这些生物控藻，不会像营养源控制和“生物操纵( b i o m a i l i p u l a t i o n ) 那样 对湖泊生态系统产生根本的改变。 藻菌关系在水生态系统的碳循环和营养再生中起重要的作用，而筛选对水华藻 类有特异抑制作用的细菌已经引起了广泛的关注，许多研究人员已经把溶藻细菌作 为缓解有害藻类水华的一种潜在的生物o “3 。不少国外研究者认为：溶藻细均普遍 存在于水生生态系统中，水华的迅速消退很可能与溶藻细菌的感染有关“3 1 。随 着全球水体富营养化的加剧，水华的爆发同趋频，而由水华所造成的环境和经济问 题日益引起人们的重视，在利用物理、化学和其它生物学方法防治水华不理想的情 况下，溶藻细菌作为水华防治的可能生物，引起了众多研究人员的关注。 3 溶藻细菌治理水华的研究 3 1 溶藻细菌的研究概况 溶藻细菌是在天然水体中大量存在，并对水体里的藻类具有抑制或致死作用的 一类细菌的总称。溶藻细菌的研究在国外已有数十年历史。早在1 9 2 4 年，g e i t l e r 报道一种粘细菌p o l y a l l 西u m p a r a s i t i u m 寄生在剐毛藻c k 幽p 矗o r 口上，使藻死亡【4 4 1 。 溶藻细菌在国内外文献中陆续有一些报道，主要有：粘细菌( 坳c 0 6 口c 把r ) ”5 。”、噬胞菌 属( o 卸 q g 口) 【4 8 4 9 1 、纤维弧菌属( 枷f 6 r f d ) 、节杆菌口r 抽m 6 日c 船，) 【5 0 】、屈挠细菌属 ( 用职f 6 口c 纪一、蛭弧菌( b d e l l o v i b r i o b a c t e r i o u s ) 、杆菌f 驸) 、黄杆菌属 ( 胁v 0 6 口c 把r f “m ) 、弧菌( v i b r i o ) 川、腐生螺旋体属( s 印阳印f r 口) 、假单胞菌 ( n p 砌聊d ”船) 、鞘氨醇单胞菌属( 印 j 馏d 删d 月甜) 【5 2 l 、交替单胞菌( 爿加加m d 行) 【5 3 】、 交替假单胞菌( n 口“如口，据，口m d 即傩) 【5 4 】等。这些细菌多为革兰氏阴性菌，它们的作用对 象比较广泛，既有蓝藻也有硅藻和甲藻垆钾。 3 2 溶藻细菌的分离方法 溶藻细菌的分离一般可分为液体感染分离法和固体感染分离法，液体感染分离 法适用范围广，但过程比较复杂，工作量大；固体感染分离法虽然简单、直观，但 是仅能筛选在固体培养基中生长的细菌。 3 2 1 液体感染法筛选溶藻细菌 利用液体感染方法筛选溶藻细菌，h a y a s h d as 5 印和y 0 s h i k a w ak 等首先采用随 机分离方法，即先从水样中分离细菌，获得纯培菌株，然后将纯培菌株分别加入藻 类的培养物中进行共同培养，通过检测能够导致藻类生物量下降或藻细胞溶解的菌 株即为溶藻细菌f 4 7 】。但是这种方法劳动量较大，如果水样中不含有溶藻细菌，前期 的工作就成了无用功。因此研究者一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，确认水样 中含有溶藻细菌后在进行分离筛选。利用液体感染方法分离溶藻细菌。一般采用了 下述程序：水样的采集及预处理，水样和藻类的共同培养，黄化培养体系中 优势细菌的分离，溶藻细菌的筛选。 3 2 2 固体感染法分离溶藻细菌 采用固体培养基分离溶藻细菌主要利用空斑形成( p i a q u ef 0 衄a t i o n ) 的方法进 行。主要有涂布平板法、软琼脂顶层平板法( s a o i ) 。涂布平板法即将宿主藻在琼 脂培养基中预培养至藻落出现，然后将水样涂布藻落上继续培养，待出现扩展的溶 藻空斑后，从单个空斑取样，转入细菌培养基，最后划线获得溶藻菌株。由于涂布 接种的方法易于机械性损伤藻类，同时也难以分离一些抑制藻类生长细菌，效果不 太理想，目前采用者甚少。 获得细菌溶藻空斑的另个方法是s a o i t 法，1 9 6 4 年s a 腩1 1 a n 首先采用 s a o l l 法分离和检测蓝藻病毒，1 9 7 0 年s h i l o 始用于分离检测溶藻细菌i ”】，后经许 多研究者的不断发展和完善，目前己成为一种分离溶藻细菌，尤其是淡水生态系统 中溶藻细菌的常用方法【5 ”。其基本操作思路如下：制备两种藻类固体培养基，琼脂 培养基( a g a r m e d i u m ) 和软琼脂培养基( s o 缸a g a r m e d i u m ) ，以琼脂培养基作底层平板， 水样、预培养的藻和熔化并冷却至4 7 的软琼脂培养基混合均匀迅速倾注到底层平 板，琼脂固化后进行培养，至扩散的溶藻空斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株。 3 3 溶藻细菌的作用方式 溶藻细菌作用方式，一般分为下列2 种情况：直接溶藻，即直接进攻宿主， 它需要细菌与藻细胞直接接触，甚至侵入藻细胞内；间接溶藻，即间接进攻宿 主f 5 卵，主要包括细菌同藻竞争有限营养【4 4 或细菌分泌胞外物质溶藻。近年来，文献 报道较多的是细菌分泌胞外物质到环境中抑制藻的生长，导致藻细胞的溶解。 3 3 1 直接溶藻 粘细菌是最早被报道和报道较多的溶藻细胞s h i l o 5 7 】，d r a f i 【4 6 】，李勤生和黎尚 豪分别报道粘细菌同蓝藻细胞相互接触，导致藻细胞溶解，但是这种溶藻仅发生于 宿主的营养细胞，对异形胞、静息孢子不产生影响。y a m a r n o t o 从土壤中分离株 细菌m y - 1 通过直接方式溶解鱼腥藻( 包括异形胞和静息孢子) 。m a r i a g c 从发生水 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华的铜绿微囊藻中分离一株类似蛭弧菌的细菌，这种细菌能够侵入铜绿微囊藻的细 胞内并溶解宿主。细菌可内生于不同种类的淡水或海洋藻类中，它们既可存在于细 胞核中也可存在于细胞质内，甚至细胞器中，但是这种寄生并不引起宿主的溶解。 因此能够侵入宿主细胞并溶藻就有特殊的意义。m i t s u t a n i ，i m a i l 分别报道噬胞菌 ( 咖 删a 5 y 和j 1 8 疗虹0 1 ) 的培养物对硅藻有强烈的溶解作用，而无菌滤液则 不起任何作用。i m a ii 观察到2 株交替单胞菌( 爿抛，o 州o n 口s 护口栩ra 1 1 ds ) 也可通过直 接方式溶解某些藻类。 3 3 2 间接溶藻 通过间接方式溶藻是细菌溶藻的主要方式。细菌可以通过释放特异性或非特异 性的胞外物质：糖脂类，如x i u l i nw a f l g 【删等研究表明鼠李糖脂在o 4 m g l 。1 的浓度对 具齿原甲藻有较强的溶藻效果，蛋白质，羟胺，抗生素，多肽，氨基酸等杀死藻细胞。 这类细菌常见的有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、交替假单胞菌等。 3 4 溶藻细菌的生态学作用 溶藻细菌，作为水生生态系统中生物种群结构和功能的重要组成部分，对多 种微型藻类具有溶解作用，在自然生态系统中能够将微型藻类种群密度调节到一 个适当的程度，对维持藻类生物量的平衡具有非常重要的作用，它们对浮游藻类 的溶解作用可能是调节水生生态系统中初级生产力的个重要因素。不少国外研 究者认为：水华和赤潮的迅速消退可能与溶藻细菌的感染有关。有文献报道：在水 华和赤潮的发生、发展和消亡过程中，细菌以及细菌和藻类的相互作用是影响藻 类生长的关键性的调控因素”“。但是藻菌关系在水华和赤潮的种群动力学中是否 起关键作用，是怎样起作用的以及究竟通过什么机制起作用，却尚未得到透彻的 研究。 3 ，4 1 溶藻细菌对藻类生长的影响 在自然水体中，某段时间( t ) 内某一区域某种浮游藻类的种群生长符合下列 方程： n t = n 0 e ( k + k i k a k m k s k g ) t 其中，n t 代表该浮游藻类种群的生长率；k 代表藻类细胞增长率；k j 代表系统 外迁入率；k a 代表流出( w a s h o u to rf l u s h i n g ) 的藻类种群净损失率；k m 代表死亡 率：k s 代表沉降率；代表捕食率。溶藻细菌通过分泌细胞外生长抑制物质或溶 藻物质，或者是直接攻击宿主藻类细胞，从而影响k 和k m 的值，进而影响浮游藻 类的种群生长。尽管多数的溶藻细菌往往有广泛的宿主范围，但是某些细菌的次生 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 代谢产物能够以物种特异性的方式影响或者终止藻类的繁殖。细菌和藻类在细胞水 平上的这种相互关系，能够调节水华和赤潮的种群动力学，同时也能够影响藻类群 落中优势物种的演替m 。 3 4 2 溶藻细菌对水华种群动力学的影响 在水生生态系统中，细菌和微藻是数量最多分布最广的生物。在海洋生态系 统中，细菌和藻类种群的时空分布特征和相互作用已得到很好的研究，结果表明， 一个种群的生物( 细菌或藻类) 分泌的次生代谢产物对另一个种群的生物( 细菌或 藻类) 可能有益，也可能有害。物种间这种相互拮抗能力提供了一个潜在的反馈 机制，这种机制在控制藻类的种群演替和种群动力学中超重要作用“。f u r u k i 的研究表明，当针胞藻( c h a t t o n e l l a a n t i q u a ) 将要达到最大的细胞浓度时，周围 环境中的菌群能够促进针胞藻的生长；相反地，当针胞藻水华消亡时，周围环境 中的菌群又能够抑制该藻的生长。因此细菌和藻类之间的关系是复杂多变的，水 华的不同发展阶段，可能有不同的细菌对藻类起作用“”。在很大程度上，溶藻细 菌对水华藻类和一些与水华藻类共存的其他浮游藻类都有强烈的抑制作用。 f u k a m i 等从水华消退期分离1 株黄杆菌( f l a v o b a c t e r i a u m5 n 一3 ) 对水华藻类 g y r n o d i n i u m 有强烈的抑制作用，但是对当地水体中其他藻类没有抑制作用，这 表明某些细菌对水华藻类具有特异性的溶解作用“。因此，不管细菌溶藻是通过 何种方式，已经鉴定的许多种溶藻菌株有的能够溶解多个种属，有的只能溶解单 个种属，甚至某一种的藻类，这种情况表明细菌能够影响浮游藻类的种群演替， 即当溶藻细菌选择性抑制优势藻类的生长时，导致其他藻类种群占优势，引起水 华和赤潮的爆发和演替。 3 4 3 细菌影晌水华种群动力学的可能作用模式 根据溶藻细菌和藻类是否直接相互接触对溶藻细菌进行分类是很重要的。d o u c e t t e 根据自己的研究结果，提出了一个溶藻细菌影响水华种群动力学的可能作用 模式该作用模式是建立在对1 株溶藻细菌( c y t o p h ag a 4 ld b g 2 ) 和它的宿主裸甲藻 ( g y m n o d i n i u m ) 之间的相互作用研究的基础上，并且得到了野外研究工作的支持。 这个概念性的模式由4 个基本的阶段组成，各个阶段及其之间的相互演变关系如下： 1 ) 初始阶段溶藻细菌作为其特异性宿主周边微生物群落中的组成部分，数量 很少，宿主藻类细胞密度很低或者基本没有宿主细胞；1 ) 一2 ) 水华发生时，藻类密 度增加，藻类分泌的有机物也随之增加，导致水体中有机营养物质增多，周边环境 中细菌总数同步开始增加：2 ) 一3 ) 水华开始发展时，宿主藻类细胞数迅速增加，溶 藻细菌能够优先利用藻类分泌的有机物，其绝对数量( 即溶藻细菌的总数) 和相对数 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 量( 即在细菌群落中的比例) 增加，溶藻细菌杀死宿主细胞，释放有机物质。这导致 了一个反馈机制：进一步刺激周边细菌群落中溶藻细菌的生长和活性；3 ) 一4 )