（发育生物学专业论文）盐地碱蓬ssnced1基因的克隆及其功能研究.pdf

独创声明 y 5 9 8 8 6 2 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或 证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名x 需錾 导师签字： l 弧 签字日期：2 。4 年如月讶日 签字曰期：2 旋兹 盐地碱蓬曲n c e d i 基因的克隆及其功能研究 盐地碱蓬s s n c e d l 基因的克隆及其功能研究 中文摘要 脱落酸( a b a ) 是一种植物激素，它在调节植物的生长、发育、种子的休眠以及植 物对逆境胁迫的适应中起到重要的作用，因此调节高等植物a b a 的生物合成对于植物 来说具有重要的意义。在高等植物a b a 的生物合成中，生化与遗传研究表明，9 顺式一 环氧类胡萝b 素二加氧酶( n c e d ) 催化的反应被证明是关键步骤，它催化的底物来自 于玉米黄素环氧化酶( z e p ) 催化产生的环氧类胡萝h 素，裂解生产a b a 的前体物黄 质醛，黄质醛经进一步的氧化生成a b a 。 拟南芥基因组中有9 个编码n c e d 的基因( 表1 ) ，按催化裂解位点可分为两类， 一类催化9 顺式类胡萝h 素在c 1 1 和c 1 2 位置的裂解的n c e d ( 如拟南芥的a t n c e d 3 ) ， 产生a b a 的前体物黄质醛；另一类是催化类胡萝b 素在c 9 和c l o 或c 9 ，和c 1 0 ，双键的氧 化断裂( 如拟南芥的a t n c e d l ) ，它所产生的产物并不是a b a 的前体物质。本实验从 4 0 0 m m 处理真盐生植物盐地碱蓬( s u a e d as a 血a ) 地上部分构建的e d n a 文库中随机测 序得到的1 0 0 0 个e s t s 中得到了两个编码n c e d ，根据已测的序列设计引物以c d n a 文 库为模板进行p c r 扩增，得到了全长的e d n a 序列，全长为全长为1 , 9 7 2b p ，5 和3 u t r 区长度分别为7 2b p 和2 2 9b p ，编码5 6 6 氨基酸残基，分子量约为6 2 5k d a 。b l a s t x 和 进化树分析发现它与拟南芥a t n c e d l 在氨基酸水平上的一致性高达7 7 ，这说明 s s n c e d i 属于n c e d 基因家族中的第二类基因。n o r t h e r n 杂交分析发现，盐和甘露醇 处理可以诱导s s n c e d l 在根和地上部分中的表达，高温也诱导该基因在地上部分和根 中的表达，这表明s s n c e d l 是个与逆境相关的基因。s o u t h e r n 杂交分析表明，s s n c e d l 在盐地碱蓬的基因组中存在多个拷贝。 为了进一步确定s s n c e d l 的功能，我们用过量表达策略将s s n c e d l 导入拟南芥， p c r 和s o u t h e r n 杂交分析该基因已整合到拟南芥基因组中，n o r t h e r n 杂交分析表明赊 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱莲曲n c e d i 基闻的克隆及其功能研究 9 2 3 株系表达不明显外，其它株系均可正常地表达。通过对转基因株系的生理分析发现， 过量表达s s n c e d l 并没有增加拟南芥对盐、干旱等胁迫的耐受性，也没有延迟转基因 植株种子的萌发，酶联免疫法测定a b a 的含量发现导入的s s n c e d l 没有改变转基因植 株的幼苗的和种子中的a b a 含量，这说明该基因在植物的耐逆和a b a 的生物合成中并 不起作用，但是转基因植株的类胡萝b 素的含量比野生型拟南芥的低，这可能是由于它 所催化的反应与a t n c e d l 类似，其催化产物并不是a b a 的前体物质，该基因编码的 蛋白只是在类胡萝h 素的代谢中起作用。令我们无法解释的一个现象是过量表达 s s n c e d l 增加了转基因植株对外源a b a 的敏感性。 在的g e n e b a n k 库中，与拟南芥a t n c e d l 同源的基因注册的数目越来越多，目前 已有1 3 个，并且有些基因是从地上组织构建的c d n a 文库中克隆得到的f 如鳄梨的 p a n c e d 2 ) 。尽管我们还不清楚它们的功能，但它在植物体内的作用可能是很重要的。 它在植物生长发育过程中的作用机制我们还不清楚。 关键词：盐地碱蓬脱落酸 生物合成9 顺式环氧类胡萝b 素二加氧酶 中图分类号：q 7 8 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基因的克隆及其功能研究 m o l e c u l a r c l o n i n g a n df o u n c t i o n a l a n a l y s i so f s s n c e d l g e n e i n s u a e d as a l s a a b s t r a e t a b s c i s i ca c i d ( a b a ) i sa p h y t o h o r m o n ew h i c hp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t ，s e e d sd o r m a n c y , a n dp l a n tr e s p o n s e st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s b e c a u s em a n y o ft h e s e p h y s i o l o g i c a lp r o g r e s s e s a r ec o r r e l a t e dw i t ht h e e n d o g e n o u sa b al e v e l t h e r e g u l a t i o no fa b ab i o s y n t h e s i si s t h ek e ye l m e n tf a c i l i t a t i n go u t r u n d e r s t a n d i n go ft h e s e c h a r a c t e r i s t i c s i nh i g h e rp l a n t s ，t h ea b a b i o s y n t h e s i sp a t h w a yp r o c e e d sf r o mc a r o t e n o i d st o x a n t h o x i nv i as e v e r a l s t e p sc a t a l y z e db yz e a x a n t h i n e p o x i d a s e ，9 - c i s e p o x y c a r o t e n o i d d i o x y g e n a s e ，a n dm o c o r e q u i r i n ga l d e h y d eo x i d a s e t h e r ea r en i n e g e n e se n c o d i n gt h e9 - c i s e p o x y e a r o t e n o i d d i o x y g e n a s ei na r a b i d o p s i s g e n o m e ( t a b l e1 ) ，n a m e da t n c e d l - 9 ，r e s p e c t i v e l y a t n c e d 3w a sd e m o n s t r a t e dt ob et h e k e yf a c t o ri n v o l v e d i na b a b i o s y n t h e s i su n d e re n v i r o n m e n t a ls 仃e s s e s ，w h i l ea t n c e d1m a v n o ti n v o l v e di na b a b i o s y n t h e s i sb e c a u s ei tc a t a l y z et h e9 - 1 0 ( 9 一1 0 ) c l e a v a g er e a c t i o n sb u t n o t1 1 - 1 2 c l e a v a g er e a c t i o n s i n0 1 2 1 e x p e r i m e n t s ，o u to f t h e1 , 0 0 0e s t so b t a i n e df r o ml a r g e s e q u e n c i n gt h er a n d o m s e l e c t e de d n ac l o n e sf r o man a c l t r e a t e dc d n a l i b r a r yo fs u 口e d a s a l s a ，w ef o u n dt w oe s t se n c o d i n g9 - c i s - e p o x y c a r o t e n o i d d i o x y g e n a s e w eo b t a i n e di t s 如i l - l e n g t he d n a s e q u e n c e sb yp c r m e t h o d s t h e1 9 7 2b pf u l l l e n g t hc d n a h a sa l lo p e n r e a d i n gf r a m eo f1 , 6 9 8b pa n de n c o d ea6 2 5k d ap r o t e i nw i t h5 6 6a a t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e so fs s n c e d lh a sah i g hi d e n t i t i e so f7 7 w i t ha t n c e d lf r o m a r a b i d o p s i s b v n o r t h e r nb l o t t i n g a n a l y s i s ，w ef o u n d t h a tt h em r n a l e v e lo f s s n c e d li n c r e a s e db v n a c la n d m a n n i t o lt r e a t m e n ti nr o o ta n di na r i e a lp a r tt i s s u e s ，a n dh i g h t e m p e r a t u r ea l s ou p r e g u l a t et h e e x p r e s s i o no f s s n c e d ib o t hi na r i e a lp a r tt i s s u e so f s s a l s a 3 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d l 基因的克降及其功能研究 t o s t u d y t h ef u n c t i o no fs s n c e d l ，w ep r o d u c e dt h e t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i s w i t h o v e r e x p r e s s i o n o fs s n c e d l g e n e m e d i a t e d b ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s p c r a n d s o u t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i si n d i c a t e dt h a ta l ll i n e sh a db e e ni n t e r g r a t e do fs s n c e d l ，a n d n o r t h e mb l o t t i n ga n a l y s i sr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fe x p r e s s i o no fs s n c e d ti n t r a n s g e n i c l i n e s ，e x c e p t9 - 2 3t r a n s g e n i cl i n e a f t e rw em e a s u r e ds o m ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i s ，w ef o u n dt h a to v e r e x p r e s s i o no fs s n c e d ld i dn o ti n c r e a s et h ep l a n t r e s p o n s et on a c ia n dm a r m i t o ls t r e s s e s ，n o rd i dt h ee n d o g e n o u sa b ac o n t e n tc h a n g ei nr o o t ， a r i e a l p a r t a n ds e e d s b u t i n t e r e s t i n g l y , t r a n s g e n i cp l a n t s s h o w e d m o r es e n s i t i v et o e x t r o g e m o u sa b a a n dl e s sc a r o t e n o i dc o n t e n tt h a nw i l dt y p ea r a b i d o p s & a l lt h e s ed a t a s h o w e dt h a ta l t h o u g hs s n c e d l b e l o n g st on c e dg e n e sf a m i l y , i tm a yn o tb ei n v o l v e di n a b a b i o s y n t h e s i s ，b u ti n v o l v e di nc a r o t e n o i dc a t a b o l i s m w i t hi n c r e a s i n gn u m b e r so fg e n e e n c o d i n g t h eh o m o l o g yo f a t n c e d li no e n e b a n k d a t a b a s e ，m o r ea n dm o r es t u d i e ss h o u l db e c a r r i e do ni t k e y w o r d s ：s u a e d as a l s aa b a b i o s y n t h e s i s 9 - c i s e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学预：i = 学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基因的克隆及其功能研究 第一部分文献综述 植物激素a b a 是一个具有广泛生理效应的激素，它在在植物的生长发育、种子的 休眠和植物对逆境协迫的反应中都具有重要的作用。但它与植物耐逆( 盐、干旱) 的关 系，多年来一直受到广泛的关注，这是因为大多数植物在盐和干旱等胁迫条件下均可以 或多或少、或快或慢积累a b a ，而外且源施加的a b a 又可以提高了植物对环境胁迫 的耐受性。大量的生理学实验证实了a b a ( 包括外源a b a ) 可以诱导气孔的关闭进而 降低蒸腾失水【2 】，随后的分子生物学研究表明a b a 可以诱导系列盐、干旱等相关基 因的表达，在此基础上，s h i n o z a k i 提出了植物体中依赖a b a 的信号传导途径和不依赖 a b a 的信号传导途径 3 1 。a b a 为一个c 1 5 骨架倍半萜类化合物，传统认为它的很成前体 为甲羟戊酸，即“直接途径”，它主要发生在一些真菌中；但大量a b a 缺陷突变体和同 位素示踪实验【4 】表明高等植物a b a 的前体为b 类胡萝h 素，即“间接途径” 5 1 ，目前 有关于a b a 生物合成的酶及其基因已经得到了分离和鉴定，包括玉米黄素环氧化酶 ( z e a x a n t h i ne p o x x i d a s e ，z e p ) ，它催化玉米黄素的的环氧化产生环氧类胡萝h 素 ( a n t h e r a x a n t h i n ) ；9 - 顺式一环氧类胡萝h 素二加氧酶( 9 一c s e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e n c e d ) ；它催化环氧类胡萝h 素的氧化裂解产生c 1 5 中间体黄质醛；脱落醛氧化酶，它 可以将脱落醛氧化成脱落酸。 在依赖于a b a 的传导途径中，a b a 作为信号分子介导了植物对逆境胁迫的反应， a b a 诱导了第二信使如三磷酸肌醇( i n o s i t o l1 , 4 ，5 t r i p h o s p h a t e ，i p 3 ) ，磷脂酸 ( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) ，c a = + ，以及最近发现的过氧化氢( h 2 0 2 ) 的表达和增加。这些 信使诱导了相应的反式作用因子的表达，如a b l 5 同源的b z i p 转录因子，与a b l 3 v p l 同源的具有b 3 结构的转录因子和m y b m y c 转录因子。这些转录因子诱导相应耐逆基 因的表达以及植物对逆境胁迫和生理的反应。下面就a b a 的生物合成、逆境下a b a 的 信号传导以及a b a 的生理作用进行简要的论述。 1 高等植物体内a b a 的生物合成和降解 近十多年来，大量a b a 缺失突变体的发现以及同位素示踪技术3 的研究证明高等 植物a b a 是通过“间接途径”而合成的，即是由b 一类胡萝h 素( c 4 0 ) 裂解生成的。 a b a 的生物合成包括三个阶段( 如图1 ) ：( 1 ) 9 顺式新黄素( 9 - 砒7 x a n t h o p h y l l s ) 的生 成：( 2 ) 9 - 顺式环氧类胡萝p 素二加氧酶( 9 一c s e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e n c e d ) 催化的裂解反应；( 3 ) a b a 的生成【6 】。 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基冈的克隆及功能研究 1 19 - 顺式新黄素的形成 a b a 生物合成的第一步是玉米黄素( z e a x a n t h i n ) 在玉米黄素环氧化酶( z e a x a n t h i n e p o x i d a s e ，z e p ) 的催化下经过两次环氧化反应依次生成环氧玉米黄素和全反式紫黄质 ( a 1 1 t r a n s v i o l a x a n t h i n ) ，而紫黄质去黄氧化酶( v i o l a x a n t h i nd e e p o x i d a s e ，v d e ) 催化 了z e p 的逆反应，这三种物质之间的相互转化被称为新黄素循环( x a n t h o p h y l lc y c l e ) ， 该循环对高光强下造成植物叶绿体的氧化伤害起到重要的保护作用 7 o 全反式紫黄质又 转换成9 顺式紫黄质( 9 一c i s - v i o l a x a n t h i n ) 和全反式新黄质( a l l t r a n s - n e o x a n t h i n ) ，全反 式新黄质又转换成9 顺式新黄质( 9 一c i s - n e o x a n t h i n ) ，这样就形成了9 顺式一新黄素，即 9 顺式紫黄质和9 顺式新黄质( 如图1 ) 。但是到目前为止，催化9 顺式紫黄质和9 ，顺式 新黄质形成的酶还没有分离得到，而有关于全反式紫黄质向二者之间的异构转换只是通 过同位素示踪发现的。 图i 。6 高等植物脱落酸的生物合成过程。 f i g 1 a b a b i o s y n t h e s i si nh i g hp l a n t 6 山素师范大学硕士学位论文 盐地碱莲凸n c e d i 基l 捌的克隆及其功能研究 烟草( n i c o 盯a n ap l u m b a g i n i f o l i a ) 的z e p 是在研究a b a 生物合成过程中最先被发 现的酶f 8 】t 它是由烟草a b a 2 编码的。之后，该基因又在番茄( l e z e p ) p j 和拟南芥 ( a b a l l o s 6 ) 【9 i o , “1 等植物中被克隆得到。通过表达分析发现，z e p 基因在地上组织 叶中并不受渗透胁迫的诱导，只是在根中受诱导，这可能是由于绿叶中含有足够多的环 氧类胡萝h 素( e p o x y c a r o t e n o i d s ) ，z e p 并不能对a b a 在这些组织中的生物合成起到重 要的调控作用：然而，在根和种子中，由于类胡萝h 素含量很少，z e p 基因的表达量增 加却与a b a 含量的增加起到正相关作用；过量表达n p z e p 并没有增 加a b a 的含量，却增加了种子的休眠【l ”。这些实验结果表明，z e p 调控的环氧类胡萝 h 素的含量只在根中的a b a 合成中起到调控作用。此外，研究n p z e p 和l e z e p 的表 达模式发现，它们的表达具有昼夜节律性3 1 。 1 2n c e d 催化的氧化裂解反应 n c e d 催化c 4 0 的9 顺式紫黄质和9 顺式新黄质的裂解，产生了c 1 5 的a b a 的前体 物质黄质醛( x a n t h o x i n ) 和一个c 2 5 化合物，n c e d 在底物上发生氧化裂解的为点 位于c 1 】和c 1 2 之间州( 如图2 ) 。大量的实验数据表明，该步反应是催化a b a 生物合 成的关键反应，它的催化反应发生在质体中。 n c e d 基因最初是在玉米( z e a m a y s ) 的a b a 缺失突变体v i v i p a r o u s l 4 ( v p l 4 ) 中 克隆得到的【l ”，通过体外的生化酶活分析发现，它可以特异地氧化裂解9 顺式紫黄质和 9 顺式新黄质而产生黄质醛，而并不催化其它种类的类胡萝h 素氧化裂解。番茄的 n o t a b i l i s 也是n c e d 缺失的突变体【旧。随后，该基因又在菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 、 豇豆( f i g n au n g u i c u l a t a ) 1 17 1 、w 蝶( p e r s e aa m e r i c a n a ) 1 1 明以及拟南芥( 彳，如f 如踯括t h 口l i a n a ) ”9 】等植物中得到克隆，在这几种植物中检测发现，n c e d 基因都包含一个小的基因家族。 过量表达l e n c e d 3 ，a t n c e d 3 ，p v n c e d l 都导致了转基因植物内源a b a 含量的增加， 并且提高了植物的耐干旱的能力2 0 , 2 ”，以及a b a 分解代谢产物红花菜豆酸含量的增 加。 在拟南芥的基因组中，共有9 个与编码n c e d 相关的基因( 如表1 ) 。除了a t n c e d 4 的功能未知之外，其余的8 个基因的功能均得到鉴定。尽管有5 个基因( a t n c e d 2 ，3 ，5 ， t9 ) 所编码的n c e d 都具有在c 1 1 和c 1 2 之间催化裂解底物的活性，但只有a t n c e d 3 被证明在植物的叶组织中的a b a 合成通路中起关键的作用1 9 ，列。利用其启动子与g u s 的融合实验表明，这5 个基因的产物都定位在质体中矧。而a t n c e d l ，7 ，8 的催化底物 山东师范大学硕士学位论文 赫地碱蓬s s n c e d l 基因的克降及其功能研究 氧化裂解位点在c 9 和c i o 之间，它们所催化形成的产物是一类c 1 4 或c 1 3 的物质，而不 是a b a 的前体物质 2 4 】，而且它们反应的底物比较广泛，并不仅限于9 顺式环氧类胡萝 h 素，因而这类基因产物可能并不在a b a 的合成途径中起作用。通过序列比较发现， a t n c e d l 与a t n c e d 3 的氨基酸序列的一致性只有3 8 ，与a t n c e d l 同源的这类蛋白 质氨基酸序列比与a t n c e d 3 同源的蛋白质序列短5 0 一7 0 个氨基酸，这是因为用c h l o r o p 软件预测发现，与a t n c e d 3 同源的蛋白质的n 端都有4 0 个氨基酸左右的叶绿体前导 肽，如豇豆的v u n c e d l ( 与a t n c e d 3 同源) 的前导肽序列可以将绿色荧光蛋白定位 在叶绿体1 7 1 ，在渗透胁迫下，a t n c e d 3 的诱导强度明显地比a t n c e d l 大。 表1 t 拟南芥n c e d 基因家族各基因的比较。 t a b l e1 ，t h e n c e d g e n ef a m i l yi n a r a b i d o p s i sg e n o m e 尽管与a t n c e d l 同源的蛋白质的功能并不参与a b a 的生物合成，但是在目前的 g e n e b a n k 中大量存在该类基因。用保守引物或其它方法进行克隆n c e d 家族基因时， 总有与a t n c e d l 同源的基因的出现，如鳄梨的p a n c e d 2 ，菜豆的p v n c e d 2 ，水稻和 拟南芥中分别有3 个类似的基因。植物中存在如此多的该类基因说明了它的重要性，但 是关于它的研究非常的少。它究竟调节了植物生长发育的哪一个方面我们还不清楚。 1 3a b a 的生成 当n c e d 催化产生黄质醛之后，黄质醛便转移到细胞质中，经过两步催化反应生产a b a 。 在植物中存在三种可能的途径1 6 】( 如图1 中的( 1 ) ，( 2 ) ，( 3 ) ) ：在途径( 1 ) 中，黄质醛首先 山东师范大学硬士学位论文 盐地碱蓬s x n c e d i 基因的克隆厦其功能研究 被短链脱氢还原酶( s h o r tc h a i nd e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e ) 原成脱落醛( a b s c i s i ca l d e h y d e ， a b a i d ) ，a b a l d 然后被醛氧化酶氧化为a b a ，这种醛氧化酶需要铝因子的激活。该途 径被证明在a b a 的生物合成中起主要的作用，这是因为目前已发现大量对该途径缺失 的突变体，如拟南芥a b a 2 2 5 1 ，g i n l l 2 6 1 ，口3 【2 7 】，s r e 和s a h 2 8 】，这些突变体不能催化黄质醛 生成a b a i d ，但是可以将a b a l d 转换成a b a ，这说明突变体缺失了短链脱氢还原酶， 克隆鉴定发现，这些突变体对应的基因都是与短链脱氢还原酶相关的基因。番茄s i t i e n s 突变体是醛氧化酶缺失【2 9 1 的，它不能将a b a l d 氧化成a b a ，但是拟南芥a 6 订1 2 5 】，烟草 a b a l t 3 0 】及番茄刀d 口突变体3 1 1 也是有关于醛氧化酶损伤的突变体，与拟南芥a b a 2 具有相同的表形，a t a b a 3 编码钼因子硫化酶( m o l y b d e n u mc o f a c t o rs u l h t r a s e ) 3 2 , s s l ， 这说明醛氧化酶是依赖于钼因子的氧化酶。 a 敬“ 强 尉 一酗 l 西p 气族 上、，代 拳上- 童p 圈2a t n c e d l 和a t n c e d 3 所催化的氧化裂解反应。a 和b 分别代表a t n c e d l 和a t n c e d 3 的 催化反应。 f i g 2s c h e m e f o rt h er e a c t i o n sc a t a l y z e db yt h er e c o m b i n a n ta t n c e d l p r o t e i na n da t n c e d 3p r o t e i n aa n db r e p r e s e n tt h er e a c t i o n sc a t a l y z e db ya t n c e d la n da t n c e d 3 ，r e s p e c t i v e l y 在途径( 2 ) 中，黄质醛是通过黄质酸转交成a b a 。尽管从化学结果上来看，黄质酸 是最容易转化成a b a 的化合物【3 4 1 ，但是有关于该途径的基因还没有被克隆得到，改途 径只是被推测出来的。在番茄f l a c c a 突变体1 3 4 ，虽然缺少醛氧化酶的活性，但是人们仍 检测到了有极少量c 标记的黄质醛转变成a b a ，这说明可能存在另外的途径转化威 9 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基因的克隆及其功能研究 a b a 。拟南芥中醛氧化酶的一些同工酶可以氧化黄质醛。这可能是将黄质醛氧化成黄质 酸。 在途径( 3 ) 中，脱落醛被还原成脱落醇，脱落醇再被氧化成a b a 。有关于脱落醛首 先被还原的反应是在茄f l a c c a 突变体发现的，外源施加的脱落醛可以在该突变体中转化 成脱落醇，这说明可能存在经过脱落醇向a b a 转化的途径口5 1 。 1 4a b a 的分解代谢 植物体内a b a 含量的升高可以诱导a b a 的分解代谢加速。目前，在植物体内主要 有3 条分解代谢途径( 如图3 ) ：8 位甲基的羟基化的代谢途径 3 6 , 3 7 ；9 位甲基的羟基化 的代谢途径：和a b a 的酯化降解途径。a b a 在细胞色素p 4 s o 型单氧化酶催化下生成8 羟基a b a ( 8 - o h a b a ) ，8 - o h a b a 在环化酶的催化下生成红花菜豆酸( p h a s e i c a c i d ) ， 红花菜豆酸又可以被还原成而氢红花菜豆酸( d e h y d r o p h a s e i ca c i d ，d p a ) 【3 8 】；9 位甲基 的羟化途径是最近才发现的，它的中间产物是9 羟基a b a ( 9 o h a b a ) ，最后生成新 红花菜豆酸( n e o p h a s e i ca c i d ，n e o p a ) 3 7 】：a b a 代谢另一种途径是a b a 的羧基与葡萄 糖发生酯化反应生成脱落酸葡萄糖酯( a b a g l u c oe s t e r , a b a g e ) 【3 9 】。其中，a b a 8 ， 位甲基的羟化途径是a b a 分解代谢的主要途径 舯4 ”，在拟南芥中过量表达p v n c e d l 也提高了a b a 降解产物红花菜豆酸的积累增加 2 “。此外，a b a 的降解还有其它的一些 途径，如a b a 直接被还原成a b a 二醇( a b al 4 - d i o l s ) ：a b a 的7 位甲基的羟基化 反应等但有关于这些途径的研究很少。 2 环境胁迫下植物体内a b a 的信号转导 在逆境胁迫下，植物体内的a b a 含量迅速提高，a b a 通过诱导相应基因的表达、 调节气孔的关闭，调节植物适应不利的环境。a b a 作为信号分子诱导了基因的表达以 及气孔的关闭，种子的成熟和休眠等生理效应。尽管a b a 作用的受体至今没有找到， 但有关于a b a 的信号转导过程仍得到了相对充分的研究。此外，a b a 的信号转导还与 乙烯、生长素等的信号转导相互串话( c r o s s - t a l k ) 1 4 2 ，这是因为这些信号转导之间共用 一些相同的信号分子。 2 1a b a 介导的转录调控机制 有4 类顺式作用元件参与a b a 信号转导途径，它们分别是a b r e s ，r y s p h 元件， c e 3 类似序列，m y b m y c 识别的元件h 3 1 。a b r e s 和r y s p h 元件分别被含有b z i p s 和 b 3 结构域的转录因子所识别。在拟南芥基因组中，共有8 1 个编码b z i p s 的基因【4 4 1 ，但 山东师范大学硬士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基因的克隆及其功能研究 只有一个b z i p s 基因的亚家族编码的转录因子参与了信号转导，这包括a b l 5 ，a b r e s 结合因子( a b f s 或a r e b s ) 和拟南芥d c 3 启动子结合因子( 彳t h a l i a n ad c 3p r o m o t e r b i n d i n gf a c t o r , a t d p f s ) 。a b l 5 在a b a 介导的种子萌发后生长抑制起着重要的调节作用， 它通过与启动子区域的a b r e s 结合调节e m 基因( 一种l e a 蛋白) 的表达控制调节的 成熟和萌发。通过酵母单元杂交在拟南芥中发现了4 个与a b r e s 结合的转录因子【4 5 1 ， 依次命名为a b f l ，2 ，3 ，4 ，其中a b f 2 和a b f 4 分别是原来所克隆的a r e b l 和a r e b 2 1 4 6 。 同时过量表达a b f 3 和a b f 4 增加了转基因植株对a b a 的敏感性，并且降低了植株的蒸 腾作用，提高了植株的耐干旱的能力1 4 7 】。 n e o p h a s e i ca c i d 。卜衲扣mp i 啾 - 瑚f d 叫 图3a b a 的分解代谢途径。 f i g 3 t h et h l em a i n p a t h w a y so f a b a c a t a b o l i s mi nh i 曲p l a n t 在拟南芥中有4 3 个编码含有b 3 结构域转录因子的基因l ，其中有1 4 个与 a b l 3 v p l 同源的亚家族参与了a b a 的信号转导。拟南芥a b l 3 突变体与a b l 5 具有相似 的表形，同时过量表达a b l 3 与a b l 5 发现，二者可以共同作用于基因的启动子区域调节 种子的萌发和对脱水的耐受机, ! j t 4 8 1 ，a b l 3 作用于a b l 5 的上游 4 9 】。a b l 4 编码a p e t a l a 2 转录因子，它可能与a b l 3 和a b l 5 共同作用调节e m 基因的表达【5 0 】。m y b m y c 是一 类参与a b a 信号转导的转录因子，它对植物在非生胁迫的调节比b z i p s - - a b t l e s 慢， 这可能需要从头合成m y b m y c 蛋白质，该系统主要是调节对渗透胁迫的慢适应过程。 2 2 a b a 信号转导中的第二信使 1 i 山东师藏丈学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d l 基因的克隆及其功能研究 尽管a b a 作用的受体还没有找到，但大量的研究证明一些信号分子，如i p 3 ，p a ， h 2 0 2 和c a 2 + 在a b a 诱导基因表达和气孔关闭过程中起到重要作用。i p 3 是由磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ) 分解p i p 2 产生的，拟南芥有6 个编码p l c 的基因，但只有a t p l c i 的表达受a b a 的诱导。通过过量表达和反义r n a 实验证实，a t p l c l 对a b a 在调节 种子的萌发、生长以及基因( 如r d 2 9 a ，k i n l ，r d 2 2 等) 的表达是非常必要的1 5 2 。最 近发现的在i p 3 分解代谢缺失的拟南芥突变体f i e r y l ( f r y ：) 对a b a 具有超敏感性，这 说明i p 3 在介导a b a 的信号转导具有重要作用i s 3 1 。p a 是由磷脂酶d ( p h o s p h o l i p a s e d 、 p l d ) 作用产生，a b a 可能通过g 蛋白介导的途径诱导大麦糊粉层细胞微粒体中p l d 的活性升高【5 4 】。尽管拟南芥中1 1 个编码p l d 的基因都受不同程度胁迫的诱导，并且定 位在不同组织中，但只有p l d a 的活性受a b a 的诱导，反义抑制p l d a 减缓了a b a 和 乙烯诱导的离体叶的衰老【5 ”。c a 2 + 浓度的变化在a b a 诱导的气孔关闭过程中起着重要 作用，不论外源施加c a 2 + 还是刺激内源c a 2 + 的释放都可以导致气孔的关闭。细胞质主要 是通过细胞膜c a 2 + 通道的激活和细胞质钙库的c a 2 + 释放来增加细胞质c a 2 + 的浓度 ( 【c a 2 + 】c y t ) 。i p 3 可以促进c a 2 + 从钙库中的释放，而a b a 激活膜c a 2 + 通道是通过促进活 性氧物质，如h 2 0 2 的产生而实现的0 5 6 l 。在拟南芥a b a 不敏感g c a 2 5 7 1 突变体中，保卫 细胞中h 2 0 2 激活的c a 2 + 通道被阻断，a b a 诱导的气孔关闭也得到了抑制，但a b a 诱 导的h 2 0 2 的产生仍然存在，这说明h 2 0 2 在a b a 介导的气孔关闭过程中起着重要的作 用。 2 3 a b a 信号转导通路的磷酸化事件 m a p k 磷酸化包括三个连续的蛋白激酶，即m a p k k k ，m a p k k 和m a p k ，上一 个激酶通过磷酸化激活下一个激酶【5 8 1 ，最终使目标蛋白磷酸化行使功能，因而它在植物 的生长，发育以及植物对逆境胁迫的适应中都起到重要的作用。外源施加的a b a 和 h 2 0 2 可以诱导a t m a p k 3 和a t m a p k 3 在拟南芥中的表达和蛋白活性的升高 5 9 1 。目前有 实验表明，a b a 诱导的p a 含量的升高，激活了大豆中m a p k s 通路【6 0 。拟南芥的口b i l 基因编码p p 2 c ，它受到a b a 和r o s 的诱导和氧化还原调节，因此它所作用的底物的 磷酸化和去磷酸化也可能参与了a b a 和r o s 介导的信号通路。除m a p k s 介导的磷酸 化通路外，c a 2 + 依赖的蛋白激酶( c d p k s ) 也参与了a b a 的信号转导。 2 3a b a 在气孔关闭中的作用机制 气孔主要的作用是在进行气体的交换( 如光合作用中c 0 2 的吸收) 和蒸腾作用的水 山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬s s n c e d i 基因的克隆及其功能研究 分蒸发 6 2 1 ，因而气孔的开闭对应调节植物生长发育以及在胁迫下保持植物体内的水分具 有重要意义。a b a 可以调节气孔的关闭，它可以激活保卫细胞中p l d 的活性、h 2 0 2 和 c a 2 + 】。“的升高、胞质p h 值的上升以及蛋白激酶的活性1 6 2 1 ，这些被激活的组分又进一 步激活c a 2 + 通道和胞质钙库中c a 2 + 的释放， c a 2 + 】。y 【的升高抑制了胞质中k + 的吸收，p h 值的升高促使了阴离子( 如c 1 和m a l a t e 。) 的释放，从而导致保卫细胞膨压降低，细胞 因失水而关闭气孔。拟南芥正b 和a b l 2 编码蛋白磷酸酶2 c ( p p 2 c ) ，拟南芥的a b i l 一1 和a b i 2 1 是由于点突变造成的功能获得性突变体，它对a b a 具有不敏感性，但它的完 全缺失突变体是对a b a 超敏感的，因此它在a b a 信号转导通路中的起着显性的负调节 ( d o r m i n a n t - r e g u l a t e ) 作用【6 3 1 ，它们的显性突变体是对a b a 不敏感的，并抑制了a b a 引起的气孔关闭。外源施加h z o e 和c a 2 + 可以引起a b i l j 和o s t i 突交体气孔的关闭，但 突变体本身却阻断了a b a 诱导的h 2 0 2 在胞质中的形成【5 7 ，“6 5 1 。而拟南芥g c a 2 突变体 阻断了r o s 对保卫细胞中c a 2 + 的诱导”1 ，因此a b a 诱导的气孔关闭过程是依次经过 a b a ，a b l l ( p p 2 c ) ，o s t i ，r o s ，g c a 2 ， c a