（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕假想基因bmp312的克隆表达及其定位研究.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 llyllllll1llll7lll4ll17lllll3lll111l14llll! y 17 4 7 3 1 4 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：嘲凯次 日期：沙o 年乡月纠日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 四 日期：沙o 年乡月多日 浙江理工大学硕士学位论文 本研究由张耀洲教授主持的 国家重点基础研究发展规划( 9 7 3 计划) ( n o 2 0 0 5 c b l 2 1 0 0 6 ) 国家8 6 3 计划课题 ( n o 2 0 0 7 a a 0 217 0 3 ，2 0 0 7 a a l0 0 5 0 4 ) 浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供资助 浙江理工大学硕士学位论文 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i - t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： z h 金uk a i x u a n s u p e r v i s o r ： m a j o r ： c o l l e g e ： s u b m i s s i o nd a t e ： m a l2 q 1q 单位代码! q 兰兰墨 研究生学号qz 2q 2q 堇! q 量 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 从本实验室构建的家蚕蛹c d n a 文库中筛选获得一条阅读框为8 7 0b p ，编码2 8 9 个氨 基酸残基的基因，g e n b a n k 登陆号为：d n 2 3 7 5 6 0 ，在n c b i 上对该序列进行同源性比对 后初步确定其为家蚕中的一未知基因( 假想基因) ，并命名为b i n - p 3 1 2 ( b o m b y x m o r i p 3 1 2 ) 。将家蚕b m - p 3 1 2 序列与家蚕基因组序列比对，结果表明该基因由一个外显 子组成。从n c b i 数据库中利用b l a s t 检索，发现b m p 3 1 2 蛋白与已知蛋白没有同源性，与 其他假想或者预测蛋白的同源性都低于3 0 ，说明b m p 31 2 蛋白是一个结构和功能未知 的蛋白。 我们根据开放阅读框设计上下游引物，p c r 扩增目的基因，将扩增到的b m - p 3 1 2 基 因经e c o ri 和x h oi 双酶切插入到融合表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的相应酶切位点，构建了 重组融合蛋白表达质粒p e t - 2 8 a ( + ) b m p 3 1 2 ，经p c r 、酶切鉴定验证重组成功。将重组 质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经终浓度1m m 的i p t g 诱导工程菌表达后，s d s p a g e 分 析表明在3 7k d 左右的位置有一条特异性蛋白条带，与预期值3 7 1k d ( 融合标签分子量 3 8k d ，b m p 3 1 2 蛋白理论分子量3 3 2 7k d ) 相符，重组蛋白主要存在于可溶的形式( 菌 上清) 中。 通过镍柱亲和层析法纯化了重组蛋白，并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制各多 克隆抗体，e l i s a 检测抗体效价大于1 ：1 2 8 0 0 ，w e s t e r nb l o t t i n g 检测抗体特异性较好。以 家蚕b m 5 细胞进行免疫细胞化学实验，结果显示，b m p 3 1 2 蛋白主要分布在细胞质中。 利用荧光定量p c r 的方法，对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期，以及五龄 幼虫各组织中b m - p 3 1 2 的m r n a 转录水平进行比较，分析发现在蛹期和生殖器、头部中 转录水平较高。提取家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期及五龄幼虫各组织的总蛋 白，进行免疫印迹实验，结果显示，b m p 3 1 2 蛋白在家蚕的蛹期以及生殖器、头部、丝 腺中有较高量表达，转录和表达情况相对比较一致。 通过以上研究，我们证实b m - p 3 1 2 基因在家蚕生殖器中转录水平和表达水平都是最 高的，结合b m p 3 1 2 蛋白在家蚕卵巢表皮细胞b m 5 中亚细胞定位的结果，我们推测该蛋 白可能在家蚕的生殖发育过程中发挥一定作用。上述实验结果为将来对该蛋白功能和结 构方面的进一步研究奠定了基础。 关键词家蚕；b m - p 3 1 2 基因；假想蛋白；荧光定量p c r ；免疫细胞化学；免疫印迹。 浙江理工大学硕士学位论文 m o l e c u l a rc l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dl o c a l i z a t i o na n a l y s i so fa h y p o t h e t i a lg e n eb m - p 3 1 2g e n ef r o ms i l k w o r m ( b o m b y xm o r i ) a b s t r a c t w es c r e e n e dan o v e lg e n e 谢也a l lo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f8 7 0b pe n c o d i n g2 8 9 a m i n oa c i d sr e s i d u e sf r o mt h es i l k w o r mp u p a ee d n al i b r a r yc o n s t r u c t e db yo u rl a b o r a t o r y t h eg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ri sd q 2 3 7 5 6 0 a f t e rb l a s t i n gt h es e q u e n c eh o m o l o g yi nt h e n c b id a t a d a s e ，w ei d e n t i f i e di tw a sa l lu n k n o w ng e n e ( h y p o t h e t i c a lg e n e ) i nt h eb o m b y xm o r i a n dn o m i n a t e dt h eg e n ea sb m - p 3 1 2 ( b o m b y xm o r i - p 3 1 2 ) w ea l s ot a k eg e n o m ea l i g n m e n t b e t w e e nb m - p 3 1 2e d n aa n ds i l k w o r mg e n o m e ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h i sg e n e i n c l u d e so n l yo n ee x o n a f t e rt h e b l a s tb a s e do i ln c b id a t a b a s e ，w ef o u n dt h ep r e d i c t e d a m i n oa c i ds e q u e n c e so fb m - p 312s h a r en os i m i l a r i t yt ok n o w np r o t e i na n do n l yw i t hl o w h o m o l o g o u s t oc e r t a i nh y p o t h e t i c a lp r o t e i no ru n k n o w np r o t e i n a c c o r d i n gt ot h eo r fo fb m - p 3 1 2 ，t w op r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oo b t a i nt h ec o d i n g r e g i o no fb m - p 3 1 2g e n e b m - p 3 1 2g e n ew a sa m p i f i e da n dc l o n e di n t op e t 2 8 - a ( + ) v e c t o r d i g e s t e d 丽t 1 1e c o ri a n dx h oi t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p c ra n dd i g e s t i o nw i t he c o ri x h ois h o w e dt h a tt h ed e s i g n e df r a g m e mw a s i n s e r t e dc o r r e c t l y r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ib l 21 ( d e 3 ) i n d u c e db yi p t g 、耐t ht h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no flm m t h ea n a l y s i so fs d s p a g es h o w e d t h a tt h ef u s i o np r o t e i nh i s - b m - p 31 2w a se x p r e s s e di nb l 2 1w i t l l3 7k d ( i n c l u d i n g3 8k d h i st a ga n d2 6 9k db m - p 312p r o t e i n ) t h a tw a sa c c o r d e d 、析廿1t h et h e o r yv a l u ea n dt h em o s t r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sm a i n l ys o l u b l e t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sp u r i f i e db ym e t a l - c h e l a t i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sg e n e r a t e db yi m m u n i n gn e wz e a l a n dr a b b i tw i t hr e c o m b i n a n t p r o t e i na n dt h et i t e rw a sl a r g e rt h a n 1 ：12 8 0 0 ，m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e r nb l o o t i n g v a l i d a t e dt h ea n t i b o d yw a ss p e c i f i c w el o c a t e dt h eb m p 312b yi m r n u n o c y t o c h e m i s t r yi n b m 5c e l l sa n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nm a i n l ye x i s t e di nt h ec y t o p l a s m w ea n a l y z e dt h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fb i n - p 3 1 2m r n ai nd i f f e r e n ts t a g e so fs i l k w o r m a n dd i f f e r e n tt i s s u e so ft h ef i f t hi n s t a rl a r v a t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tb m p 312h a dah i g h n 浙江理工大学硕士学位论文 t r a n s c r i p t i o nl e v e li ns i l k w o r m sp u p a , g e n i t a lg l a n d sa n db r a i n t h et o t a lp r o t e i n sw a s e x t r a c t e df r o md i f f e r e n ts t a g e so fs i u o v o r ma n ds o m et i s s u e so ft h ef i f t hi n s t a rl a r v a ef o r i m m u n o b l o t t i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb m p 312p r o t e i nh i g h l ye x p r e s s e di np u p a 、g e n i t a l g l a n d s ，b r a i na n ds i l kg l a n d t h e s et w or e s u l t sh a da no b v i o u sc o n s i s t e n c y a c c o r d i n gt o t h e e x p e r i m e n t ，w ep r o v e dt h a tb m - p 3 1 2g e n eh a st h eh i g h e s t t r a n s c r i p t i o n a la n de x p r e s s i o nl e v e li nt h eg e n i t a lg l a n d so fb o m b y xm o r i c o n s i d e r i n gt h e r e s u l to fi t ss u b c e l l u a rl o c a l i z a t i o ni ne p i d e r m a lc e l lo fo v a r yo f b o m b y xm o r i w ep r e s u m e d t h a tb m - p 312p r o t e i nm a yp l a ys o m er o l e s i n t h er e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n tp r o c e s so f b o m b y xm o r i t h e s er e s u l t sl a i dag o o df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d i e so nb m p 312 s t r u c t u r ea n df u n c t i o n k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i ；b m p 3 1 2g e n e ；h y p o t h e t i c a lp r o t e i n ；r e a lt i m ep c r ； l m m u n o c y t o c h e m i s t r y ；i m m u n o b l o t t i n g i i i 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 目录 i a b s t r a c t 缩略语 第一部分文献综述与实验设计 第一章假想基因的研究方法 l 前言3 2 假想基因之生物信息学研究3 2 1 假想基因的筛选4 2 1 1 表达序列标签( e s t ) 技术应用于假想基冈的筛选4 2 1 2 基冈表达序列分析( s a g e ) 技术应用于假想基冈筛选4 2 2 生物信息预测应用丁假想基因研究5 3 假想基因之实验方法研究5 3 1 定位技术应用于假想基因研究5 3 2 蛋白互作应用于假想基冈研究6 3 2 1 酵母舣杂交技术6 3 2 2g s t ( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ) - p u l ld o w n 技术7 3 2 3 免疫共沉淀( c 0 i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) 一7 3 3 结晶技术应用于假想基因研究8 4 展主星8 第二章实验设计方案 9 1 实验目的和意义9 2 研究内容9 3 实验流程图1 0 第二部分研究论文 第一章生物信息学分析 l l 1 2 l 生物信息学= 具1 2 2 分析流程及结果1 2 2 1b i n - p 3 1 2 基冈序列的分析1 2 2 2 疏水性分析1 3 2 3 信号肽和跨膜区预测1 4 2 4 二级结构预测l5 2 5 功能位点预测1 6 2 6 亚细胞定位预测1 7 2 7 氨基酸序列同源性分析1 7 2 8 进化树分析1 9 浙江理工大学硕士学位论文 3 讨论1 9 第二章家蚕b i n - p 3 1 2 基因的克隆与原核表达。2 1 1 材料与试剂2 1 1 1 材料- 2 l 1 2 订购试剂2 l 1 3 白配试剂2 1 2 方法2 4 2 1 动力尸3 _ ，2 基冈的克隆2 4 2 1 1p c r 扩增占切- 尸3 j 2 。2 4 2 1 1 1 特异性引物的设计与合成2 4 2 1 1 2p c r 扩增2 5 2 1 2 凝胶回收、纯化p c r 产物2 5 2 1 3 质粒的小量制各2 6 2 1 4 目的片段与p e t - 2 8 a ( + ) 载体双酶切与回收2 6 2 1 5 连接反应2 6 2 1 6c a c l 2 法制备e c o l it g l 感受态细胞2 6 2 1 7 连接产物的转化2 7 2 1 8 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m - p 3 1 2 的筛选与鉴定2 7 2 1 8 1 挑斑与质粒抽提2 7 2 1 8 2p c r 鉴定2 7 2 1 8 3 双酶切鉴定。2 7 2 1 8 4 序列测定2 8 2 2b m p 31 2 融合蛋白的表达2 8 2 2 1c a c l 2 法制备e c o l ib l 2 1 感受态细胞2 8 2 2 2 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m p 3 1 2 的筛选与鉴定2 8 2 2 - 3 融合蚩白在大肠杆菌中的表达2 8 2 2 4 蛋白凝胶电泳检测2 9 3 结果3 0 3 1p c r 扩增目的基冈3 0 3 2 重组质粒p c r 和酶切鉴定3 1 3 3 重组质粒测序结果31 3 4 融合蚩白的表达3 1 2 i 讨论3 2 第三章重组蛋白的纯化及多克隆抗体制备 l 材料与试剂3 4 1 1 材料与仪器3 4 1 2 订购试剂3 4 1 3 白配试剂3 4 2 方法。3 6 2 1 重组蛋白h i s b m - p 3 1 2 的纯化3 6 v 浙江理工大学硕士学位论文 2 1 1 大量重组蛋白的表达与样品制备3 6 2 1 2n i - n t a 柱纯化融合蛋白3 7 2 1 3b r a d f o r d 法检测蛋白浓度3 7 2 2 多克隆抗体的制备一3 7 2 2 1 抗原的制备3 7 2 2 2 免疫新西兰大白兔3 8 2 2 3 多克隆抗血清的制备3 8 2 3 抗体的纯化3 8 2 4 间接e l i s a 方法测定抗体效价3 9 2 5w e s t e r nb l o t t i n g 检测抗体特异性4 0 3 结果4 0 3 1 融合蛋白的纯化4 0 3 2 多克隆抗体的纯化4 1 3 3 间接e l i s a 方法测定抗体效价4 1 3 4w e s t e r nb l o t t i n g 检测抗体的特异性4 2 z l 讨论z 1 3 第四章免疫细胞化学4 5 1 材料与试剂4 5 1 1 材料4 5 1 2 订购试剂4 5 1 3 自配 式荆4 5 2 方法4 5 3 结果4 6 4 讨论4 7 第五章家蚕b i n - p 3 1 2 基因的转录和表达水平分析 l 材料与试剂4 8 1 1 材料。4 8 1 2 订购试剂4 8 1 3 白配试剂4 8 2 方法4 9 2 1 总鼬畸a 的提取4 9 2 2 总r n a 的d n a s ei ( r n a s ef r e e ) 酶解5 0 2 3 合成c d n a 第一链5 1 2 4 荧光定量p c r 引物的设计5 1 2 5 荧光定量p c r 5 2 2 6 荧光定量p c r 数据分析5 2 2 7 总蛋白质的提取及定蕈5 3 2 8w e s t e r nb l o t t i n g 检测b m p 3 1 2 蛋白在家蚕各发育时期和组织的分布5 3 3 结果5 3 浙江理工大学硕士学位论文 3 1b i n - p 3 1 2 基冈在家蚕不同发育时期的转录和表达水平分析5 3 3 1 1b m - p 3 1 2 基冈在家蚕不同发育时期的转录水平分析5 3 3 1 2b i n - p 3 1 2 基因在家蚕不同发育时期的表达水平分析一5 5 3 2b m - p 3 1 2 基冈在家蚕五龄幼虫各组织中的转录和表达水平分析5 5 3 2 1b m - p 3 1 2 基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平分析5 5 3 2 2b i n - p 3 1 2 基| 灭l 在家蚕五龄幼虫各组织中的表达水平分析5 8 4 讨论5 8 结论 参考文献 致谢 v h 6 0 6 l 6 5 浙江理工大学硕士学位论文 缩略语 姆a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸铵 b m p 3 1 2 b o m b y xm o r ip 31 2家蚕p 3 1 2 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 d a p i 4 - 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e4 , 6 联咪一2 苯基吲哚 e d l 、a e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附实验 h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 f c a f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t弗氏完全佐剂 异丙基硫代- p d 一半 i p t g i s o p r o p y l t h i o - 1 3 - d - g a l a c t o s i d e 乳糖苷 k a n k a n a m y c i n卡那霉素 n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c l m o l o g y美国国立生物技术信 n c b i i n f o r m a t i o n息中心 o p d 0 - p h e n y l e n e d i a m i n e 邻苯二氨 0 r f o p e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p m s f p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l ya c r y l a m i d e十二烷基硫酸钠聚 s d s p l a g e g e le l e c t r o p h o r e s i s丙烯酰胺凝胶电泳 n ，n n ，n 一四甲基乙 t e m 匝d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 二胺 浙江理工大学硕士学位论文 第一部分 文献综述与实验设计 2 浙江理工大学硕士学位论文 1 前言 第一章假想基因的研究方法 家蚕系鳞翅目完全变态昆虫，是重要的经济昆虫，被广泛应用于蚕丝工业生产，中 国的家蚕工业经济产值于2 0 0 6 年已达至1 j 1 7 7 亿美元【1 1 。由于其复杂的新陈代谢和丰富的突 变机制，其被广泛应用于生物化学，分子遗传学和基因组学研究，是鳞翅目昆虫的主要 模式生物【2 】。 2 0 0 4 年，向怀仲院士等绘制完成世界第一张家蚕基因组框架图，通过对家蚕全基因 组基因的鉴定，得知家蚕基因组框架图覆盖家蚕全基因组5 9 倍，预测家蚕基因组大小为 4 2 8 7m b ，估计有1 8 5 1 0 个基因( 0 8 年宣布实为1 4 7 0 0 左右) ，其中绝大部分为新发现基 因1 3 j 。2 0 0 6 年，西南大学国家蚕桑学重点实验室成功研制了家蚕基因芯片与表达图谱， 这是家蚕基因研究领域取得的又一项重大进展1 4 】。2 0 0 8 年，向仲怀院士等绘制完成世界 首张家蚕基因组精细图谱，使对家蚕基因组的研究又迈进一大步。2 0 0 9 年1 0 月，向仲怀 院士等又绘制完成了世界上第一张基因组水平上的蚕类单碱基遗传变异图谱“4 0 个蚕类 基因组遗传变异图”，此研究成果对家蚕驯化及性状形成机理揭示、家蚕品质改良以及 昆虫害虫防治等领域的研究具有重要的生物学意义【5 j 。 我们研究所构建了家蚕蛹e d n a 文库，包括了2 4 0 9 条独立的e s t s ( s i n g l e t o n ) ，除 去酶，核糖体蛋白，线粒体d n a ，这些基因产物包括了7 9 种类型。e d n a 序列与g e n b a n k d a t a b a s e 和s i l k w o r mc d n ad a t a b a s e 中的家蚕基因组相比较，发现了7 1 7 个新的e s t s ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ) ，与相似物种进行了o i 疆c o m p l e t em r n a 序列比对，鉴定了 1 6 5 9 条全长c d n a l 6 j 。目前本所己对部分基因进行了克隆表达及其功能初步研究，取得 了许多重要的进展，丰富了对家蚕生长和发育等相关过程的认识和了解1 7 _ u j 。本所鉴定 得到基因中有大部分属于未知基因或假想基因，假想基因是指在其它物种中不能找到同 源性且无法预测其功能的基因，这些基因目前只在c d n a 文库中记录i l 。目前，很多物 种的基因组已鉴定完毕，其中假想基因所占的比例都在3 0 一5 0 左右i l 引。因此，深入 研究这些假想基因的功能机制对家蚕的功能基因组研究具有重要意义。 2 假想基因之生物信息学研究 浙江理工大学硕士学位论文 2 1 假想基因的筛选 2 1 1 表达序列标签( e s t ) 技术应用于假想基因的筛选 e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 指的是不同组织或细胞e d n a 中的部分序列，一个 e s t 可以代表生物某一时期的某种细胞或组织的一个表达基因。在整个基因组c d n a 中， 表达基因仅占3 5 t 13 1 。1 9 9 1 年，a d a m s 1 4 1 等首次利用表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g ，e s d 技术应用于人类新基因的寻找，通过此技术他们发现了3 3 7 条新的人类基因， 其中4 8 条与其余物种有显著的同源性。e s t 一般技术路线为：1 构建高质量c d n a 文 库；2 随机挑选e d n a 克隆测序；3 序列生物信息学分析；4 确定e s t 序列；5 将获得 的e s t 序列进行首尾拼接，获得新的连接序列；6 以连接序列反复对目的物种e s t 数 据库进行b l a s t 检索、拼接，尽可能获得大片段连接序列或全长e d n a ；7 分析所得序 列的基因特征，如o r f ，推测编码的氨基酸序列并与其他物种进行同源比对，确定为新 基因或假想基因；8 克隆全长c d n a ，利用蛋白表达、定位等技术深入研究基因功能【l5 1 。 到2 0 0 3 年，家蚕e s t 数据库共包含了3 5 0 0 0 条e s t s ，包含了3 6 个不同组织和时期的 e d n a 文库，其可分组为大约11 0 0 0 条平均长度为1 2 5k b p 的无冗余的e s t s ，与f l y b a s e 数据库序列比对，表明现有的e s t s 覆盖了大于5 5 的家蚕基斟1 6 1 。目前对家蚕组织及 细胞e s t 已有大量报道，如蚕卵、血球、性腺、五龄幼虫各组织等，将大量的e s t 数 据经生物信息学分析后，可分离鉴定一些功能未知的新基因以便进行深入研究。通过对 不同发育期、不同组织的e s t 数据进行差异性分析，可找出调节、控制家蚕生长发育的 一些关键基因；通过对雌雄分开建库分析的e s t 作比较分析，可以找出一些特异性表达 的基因，用来研究雌雄的个体差异。随着e s t 序列库的逐步丰富和家蚕基因组序列信息 完善，e s t 序列信息在家蚕基因组的研究上将发挥更为广泛的作用【1 3 】。 2 1 2 基因表达序列分析( s a g e ) 技术应用于假想基因筛选 1 9 9 5 年，v e l c u l e s c u 1 7 j 等提出了基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i so fg e n e e x p r e s s i o n ，s a g e ) 技术，其主要用于基因表达频谱的分析，也可应用于新基因的发现。 s a g e 的主要依据有两个。第一，一个9 - - 1 0 碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信 息，能够唯一确认一种转录物，因为9b p 碱基顺序( 4 9 ) 从理论上说己足够代表任何一 个物种的转录产物；第二，多个短标签集中于于一个克隆中进行测序，将得到的短标签 以连续的数据形式输入计算机中处理，就可以同时分析数以千计的m r n a 转录物。通 4 浙江理工大学硕士学位论文 过分析得到上千种基因表达产物的标签序列以及丰裕度【1 8 1 。我们运用结合标签的基因序 列延伸( g e n e r a t i o no fl o n g e re d n af r a g m e n t sf r o ms a g et a g sf o rg e n ei d e n t i f i c a t i o n , g l g i ) 技术把9 1 0b p 的短t a g 通过p c r 扩增成数百碱基对，从中可以得到很多新的 数百碱基对的y e s t 序列，进而应用于假想基因的筛选【朋。1 9 9 7 年，v e l c u l e s c u p 9 等运 用s a g e 技术分析了酵母基因组的基因表达，他们从6 0 6 3 3 个转录物中发现了4 6 5 5 个 基因，其中有1 9 8 1 个已知功能基因，2 6 8 4 个为未知功能基因，构建了酵母的s a g e 库。 我们相信，s a g e 和g l g i 技术相互结合，将有助于我们在家蚕中发现那些大量的未知基 因。 2 2 生物信息预测应用于假想基因研究 生物信息学预测目前已广泛应用于假想基因的研究，利用生物信息学预测软件可以 预测蛋白质在理化方面的特征，如：等电点，分子量，氨基酸组成和蛋白稳定性，疏水 性，同源性搜索，信号肽预测，亚细胞定位预测，结构生物信息预测，保守区域，膜蛋 白预测等，进行此类预测的程序和数据库主要有：n c b id a t a b a s e 、e b id a t a b a s e 、s m s ( 蛋白基本理化性质) 、p s o r ti i ( 亚细胞定位) 、s i g n a l p3 0s e r v e r ( 信号肽) 以及 t m h m m ( 膜蛋白) 、r a c c ( 稀有密码子) 和p h d ( 一- 级结构) 、s w i s s m o d e l ( 同 源性) 、c o n s e r v e dd o m a i nd a t a b a s e ( c d d ) 等【2 0 】。我们还可以通过功能位点、比较基因 组学、蛋白蛋白相互作用、三级结构预测、基因聚类、g e n o m ec o n t e x tm e t h o d s 等方法 来预测假想基因功能【2 1 2 2 1 ，相关的软件和数据库有：p r o s i t e ( 功能位点) 、s w i s s p r o t d a t a b a s e 、c l u s t e r so fo