（海洋生物学专业论文）光棘球海胆myp基因非编码区序列及其snps分析.pdf

光棘球海胆m y p 基因非编码区序列及其$ n p s 分析 摘要 海胆的主要卵黄蛋白，因大量存在于海胆卵中而曾一度被归为卵黄蛋白原。但不同 于其它物种的雌性特有，m y p 同时存在于海胆精巢和卵巢中，为配子发生及胚胎发育 提供营养。比对发现，其c d n a 序列与其他物种卵黄蛋白原并无明显相似性，而与铁传 递蛋白具有更高的相似性。据其存在场所和合成时期的差异，m y p 可分为为c f m y p 和e g m y p ，二者均由同一基因编码。因其特殊性，国内外相关研究很多，并仍在持续 进行。 光棘球海胆不仅是我国重要的增养殖品种之一，且在发育生物学、遗传学、分子 生物学等学科均有很好的科研价值。本实验选用光棘球海胆，对其主要卵黄蛋白m y p 基因区域进行相关研究，旨在为m y p 的下一步研究奠定基础。 利用基因组步移方法，获得了m y p 基因上下游未知序列，并通过常规p c r 及克 隆测序等获得基因组9 个内含子的序列。在研究过程中，利用生物信息学对m y p 上 下游序列进行顺式作用元件分析。并选用基因下游，及内含子2 0 的核苷酸序列进行 s n p s 检测。 现将实验结果总结如下： 1 、经3 次步移及克隆测序，获得m y p 基因上游1 7 8 2 b p ，应用生物信息学预测了 其启动子，得到两条启动子序列p 1 和p 2 ，p 1 起始于9 6 b p ，p 2 起始于5 6 5 b p ，两条序 列均为5 0 b p 。在p 1 、p 2 序列中分别包含有g cb o x ，g a g a b o x 和c a a tb o x 。推测m y p 基因的两条启动子序列，在胚胎发育的不同时期分别对母源性卵黄蛋白( e g m y p ) 和 体腔卵黄蛋白( c f m y p ) 的表达具有不同的调控作用。 利用t f s i t e s c a n 软件，在m y p 基因上游区域发现含有多种顺式作用元件，如： a p l t r e 0 c 、n r eb o x lc s 、i r f e 、a s k - m p 4 等。这说明m y p 的表达调控方式复 杂，受多条信号通路的共同调节。 2 、经2 次基因组步移和一次常规p c r ，获得了m y p 基因下游共1 1 8 2 b p 的序列。 经c l u s t a l x 比对处理，得有效长度8 2 1 b p 。认为所得到的区域为光棘球海胆m y p 编码 前体m r n a 的d n a 序列，可被识别并转录形成前体m r n a ，但在前体m r n a 的后期 剪接过程中被除去，并不参与后期功能蛋白的合成。 经鉴定，在所获得的m y p 下游区域序列中，存在两种信号元件，效率元件( e e ) a t a t a t ( 5 9 b p 6 4 b p ) ，和定位元件( p e ) 1 陌兀t r r ( 3 4 7 b p 3 5 4 b p ) 。这些元件可能在 m y pm r n a 的后期剪辑、折叠、以及相关反式作用因子的识别与定位中起一定作用。 3 、m y p 下游区域序列中，存在一些s n p 突变位点，如6 2 2 位存在a _ g 转换， 6 4 8 位存在t 缺失等。这些突变可能影响到后期m r n a 的修饰，而导致功能蛋白质的差 异。 光棘球海胆m y p 基因非编码区序列及其s n p s 分析 4 、获得m y p 基因内含子5 、6 、1 1 、1 4 、1 5 、1 6 、1 7 、1 8 、及2 0 的全部序列，总 长5 0 3 6b p 。经网上进行b l a s t 发现，该九段序列均为新发现的未知序列。对部分内含子 进行s n p 检测，得内含子2 0 的1 8 9 位存在a - 突变，这些突变可能影响到前体m r n a 的处理与修饰，从而在蛋白质水平造成差异。 以上将为进一步研究m y p 基因的表达调控和全基因的s n p s 筛选奠定基础。 关键词：光棘球海胆；主要卵黄蛋白；基因组步移；单核甘酸多态性；生物信息学 光棘球海胆m w 基因非编码区序列及其s n p s 分析 a b s t r a c t 1 n h em a j o ry o l kp r o t e i n ( m y p ) i ns e au r c h i n sh a s h i s t o r i c a l l yb e e nc l a s s i f i e d a sa v i t e l l o g e n i nb a s e do ni t sa b u n d a n c ei nt h ey o l kp l a t e l e t s c u r i o u s l y , i ti sf o u n di nb o t hs e x e s o fs e au r c h i n sw h e r ei ti s p r e s u m e dt op l a y ap h y s i o l o g i c a lr o l ei n g a m e t o g e n e s i s ， e m b r y o g e n e s i s ，o r b o t h h o w e v e r , t h es e q u e n c eo ft h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fm y pa sp r e d i c t e d f r o mc d n a sb e a rn or e s e m b l a n c et oo t h e rk n o w n v i t e l l o g e n i n s i n s t e a dt h es e q u e n c es h a r e s i d e n t i t y t om e m b e r so ft h et r a n s f e r r i n s u p e r f a m i l y o fp r o t e i n s a c c o r d i n gt ot h e d i f f e r e n t i a t i o n so ft h eg e n e r a t e dt i m ea n df u n c t i o n s ，m y pc a l lb ed i v i d e di n t oa sc f m y p a n d e g m y 只w h i c ha r ec o d i n gb yt h es a m eg e n e u n t i ln o w , t h er e l a t e dr e s e a r c hi si n f u l ls w i n g a b r o a d ，a n da s c e n d a n td o m e s t i c n es t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u si sn o to n l ya ni m p o r t a n ta q u a c u l t u r es p e c i e s ，b u ta l s oh a sa g o o dv a l u ei nd e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , g e n e t i c s ，m o l e c u l a rb i o l o g ya n do t h e rs c i e n t i f i c d o m a i n s t h i sr e s e a r c hw a sa b o u tt h em y pu n k n o w n r e g i o n0 f n u d u s ri sc o n d u c t e dt o p r e p a r et h eg r o u n df o rt h ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o n so fm y p b yg e n o m ew a l k i n gt e c h n o l o g ya n dc l o n i n ga n ds e q u e n c i n g ，t h eu n k n o w ns e q u e n c e s o fu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mo nm y p g e n ew a so b t a i n e d t h ec o n v e n t i o n a lp c ra p p l y e df o r a c g u i r i n gt h e9i n t r o n s p r o m o t e ra n do t h e rc i s a c t i n ge l e m e n ts e q u e n c e su p s t r e a ma n d d o w n s t r e a mo ft h em y pw a sa n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sa n ds o f t w a r e so n l i n e t h es n p p o l y m o r p h i s mi nt h ed o w n s t r e a mo ft h eg e n ea n di n t r o n2 0w a sd e t e c t e d t h er e s u l ts h o w e d ： 1 、d u r i n gt h r e et i m e so fg e n o m ew a l k i n ga n dt h ec l o n i n ga n ds e q u e n c i n g , t h eu p s t r e a m s e q u e n c eo fm y p w a sg e t t e da s1 7 8 2b p p r o m o t e rs e q u e n c ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c s s h o w e dt h a ti th a dt w op r o m o t e r sp 1a n dp 2 t h ef o r m e rs t a r t e da t 9 6b pa n dt h el a t t e r s t a r t e da t - 5 6 5b p t h eb o t hw e r e5 0b pa n dh a dg cb o x ，g a g ab o xa n dc a a tb o x s e p a r a t e l y i n v i e wo f p r e v i o u ss t u d i e s ，t h et w op r o m o t e r sm a yb ee x p r e s s e da n d r e g u l a t e d na td i f f e r e n ts t a g e so fe g m y p a n dc f m y p r e s p e c t i v e l yd u r i n gt h ee m b r y o n i c d e v e l o p m e n t s o m e c i s - a c t i n ge l e m e n t sa sa p l - t r e 0 c 、n r eb o x lc s 、i r f e 、a s k m p 4w e r e f o u n db ye m p l o y e do ft f s i t e s c a n t h e s ef i n d i n g si m p l i e dt h ec o m p l e x i t ya n dd i v e r s i t yo f m y p g e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o n 2 、a f t e rt w ot i m e so fg e n o m ew a l k i n ga n dac o n v e n t i o n a lp c r ，t h ed o w n s t r e a mr e g i o no f m y pw a sg e t t e da s1 18 2b p ，a n dt h ee f f e c t i v el e n g t hw a s8 2 1b p t h ea c q u i r e dd n a s e q u e n c ew a ss u p p o s e dt oe n c o d et h ep r e c u r s o rm r n af o rs t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u s ，b u t t o w a r d st h es p l i c i n go fp r e c u r s o rm r n aw a sb e e nr e m o v e da n dw a sn o tc o n c e r n e dw i t h t h es y n t h e s i so ft h ef u n c t i o n a lp r o t e i n t h e r ew e r et w os i g n a lc o m p o n e n t se x i s t e da s e f f i c i e n c ye l e m e n t 饵e ) a t a t a ta n d p o s i t i o ne l e m e n t ( p e ) 1 厂r t l t 丌i nd o w n s t r e a mr e g i o n ，t h eo r i g i n a t i o na n dt e r m i n a t i o n i i i 光棘球海胆m y p 基因非编码区序列及其s n p s 分析 o ft h et w ow e r e5 9b p 一6 4b pa n d3 4 7b p - 3 5 4b pr e s p e c t i v e l y i tw a s s p e c u l a t e dt h a tt h e y m a yp l a yar o l eo nt h ee d i t i n g ，f o l d i n ga sw e l la st h ei d e n t i f i c a t i o na n dl o c a t i o no ft h e t r a n s a c t i n gf a c t o r s 3 、t h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r es o m es n p se x i s ti nt h ed o w n s t r e a mr e g i o no f m y es u c ha st h ea gc o n v e r s i o no n6 2 2b pa n dtd e l e t i o no n6 4 8b p t l i l e s em u t a t i o n s m a ya f f e c tt h el a t t e rm o d i f i c a t i o no fm r n a , w h i c hm a yr e s u l t e di nd i f f e r e n c ei nt h e p r o t e i nl e v e l o na c c o u n to ft h es m a l l e rn u m b e ro fi n d i v i d u a l s ，t h er e s u l t sn e e dt ob e i d e n t i f i e da f t e r t i m e 4 、t om a k et h ew h o l es t r u c t u r eo fm y p g e n ec l e a r e r , c o n v e n t i o n a lp c r a n ds e q u e n c i n gw e r e u s e dt oo b t a i nt h es e q u e n c eo fi n t r o n5 ，6 ，1 1 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ，1 7 ，1 8 ，a n d2 0 ，a n dt h et o t a ll e n g t h w a s5 0 3 6b p b yb l a s tt h r o u g ht h ew r e b ，f o u n dt h a tt h en i n ei n t r o n sw e r ea l ln e w l y d i s c o v e r e ds e q u e n c e s t 1 l ed e t e c t i o nf o u n dt h a tt h e r ew a sa na - cc o n v e r s i o no nt h e18 9 b p ，w h i c hm a ya f f e c tt h ep r o c e s s i n ga n dm o d i f i c a t i o no ft h ep r e c u r s o rm r n a ，a c c o r d i n g l y r e s u l t e di nd i v e r s i t yi nt h ep r o t e i nl e v e l t h e s er e s u l t sw i l ll a yt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo ft h ee x p r e s s i o n ，r e g u l a t i o na sw e l l a st h es e l e c t i o no fs n p si nm y p g e n e k e yw o r d s ：s t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u s ；m a j o ry o l kp r o t e i n ( m y p ) ；g e n o m ew a l k i n g ；s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p s ) ；b i o i n f o r m a t i c s 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者躲壑墼指剥币签名捋虏披 签名日期： ，汐歹年月岁日 光棘球海胆m y p 基因非编码区序列及其s n p s 分析 第一章文献综述帚一早义陬综怂 一j l 刖吾 海胆( s e au r c h i n ) 在生物科学史占有极其重要的作用，目前已经有一个多世纪的研 究历史，它是最早被使用的模式生物之一，其胚胎研究对早期发育生物学的发展有举足 轻重的作用。紫色球海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u sp u r p u r a t u s ) 基因组计划研究结果表明，海 胆遗传基因有7 0 与人类相同，从基因水平来看，海胆比果蝇和线虫更接近人类。海胆 这些基因功能面纱的逐步揭开，必将大大推动海胆及其它相关生物的发育生物学及分子 遗传学的发展，为我们全面认识生物从生殖细胞的发生到受精、从胚胎到形态发生和器 官形成乃至发育成一个完整的生命个体，直至衰老和死亡的整个过程提供强有力的帮 助，同时帮助我们从根本上认识生物的遗传变异以及系统进化的过程。 光棘球海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u s ) 隶属于棘皮动物门( e c h i n o d e r m a t a ) ，游在 亚门( e l e u t h e r o z e a ) ，海胆纲( e c h i n o i d e a ) ，正形目( c e n y r c h i n o d a ) ，球海胆科 ( s t r o n g y l o c e n t r o t i d a e ) ，是我国北方地区最主要的海胆增养殖品种之一。因此，海胆 无论作为增养殖品种，还是进行发育生物学、遗传学、分子生物学等学科的基础研究， 都是很好的材料。 海胆的主要卵黄蛋白( m a j o ry o l kp r o t e i n ，m y p ) 是在海胆卵中发现的最丰富的一种 蛋白，因此得名。与其他卵生动物仅雌性拥有v g 或y p s 不同，海胆的卵巢和精巢都含有 m y p 。最初的研究表明，m y p 属于糖蛋白类，有选择地储存在卵母细胞的卵黄小体、 卵和胚胎中，占总卵细胞蛋白的1 0 1 5 。由于其外源性合成、经体腔液运送到卵巢、 被卵母细胞以内吞作用吸收、并且包装储存到卵黄小体等类似于卵黄蛋白原( v g ) 的特 性，历史上曾被划分到v g 一类。经比对发现，海胆m y p 的c d n a 序列，与其他物种的卵 黄蛋白原序列并不具有同源性，而是与一些铁传递家族蛋白具有较高同源性。由于海胆 m y p 有异于其他物种的特殊性，以及其在配子形成和胚胎发育时期的重要作用，我们有 理由相信，m y p 对于各种海胆亲缘关系及系统发生树的构建、海胆优良品种的选育、环 境监测的生物标记，以及激素调控与基因表达的关系等等均有很好的研究价值和研究意 义。 1 海胆概述及研究背景 1 1 海胆的生物学地位及研究意义 海胆( s e au r c h i n ) 是一类较常见的海洋无脊椎动物，属棘皮动物( e c h i n o d e r m a t a ) 海 胆纲( e c h i n o i d e a ) ，是生物科学史上最早被使用的模式生物之一。海胆的胚胎对早期发育 生物学的发展有举足轻重的作用1 1 1 ，早期研究主要集中在受精机制、实验胚胎学和分子 胚胎学等基础理论上【2 圳，目前已有一个多世纪的研究历史。 1 光棘球海胆m y p 基因非编码区序列及其s n p s 分析 世界现存海胆种类约8 5 0 种，全部为海产：中国发现的海胆约1 0 0 种【5 1 ，其中能形成规 模性渔获产量并具有一定经济价值的种类不足1 0 种，北方有光棘球海胆 ( s t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u s ) 、中间球海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u si n t e r m e d i u s ) 、海刺猬 ( g l y p t o c i d a r i sc r e n u l a r i s ) ，南方有紫海胆( a n t h o c i d a r i