（水生生物学专业论文）油茶籽饼水浸液对鲤毒性效应的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 摘要 本试验的研究目的是为了评价植物灭螺药物一油茶籽饼对鲤( c 缈觑淞c a r p i o ) 的毒性效应，从而为油茶饼灭螺的合理使用提供一定的科学依据。利用毒性试验、 生理生学、石蜡切片等方法进行以下几方面的研究：油茶籽饼水浸液对鲤胚胎孵化 的影响；对鲤不同发育阶段的急性毒性；对鲤血液生理生化指标的影响；对鲤外周 血红细胞的致突变效应；以及中毒鲤及组织病理变化。试验结果如下： 1 油茶籽饼水浸液对鲤胚胎孵化有一定影响：浓度大于2 0 0m g l 时，胚胎孵 化率随药物浓度的增加而显著降低，在5 0 0m e n 时，胚胎在出膜前全部死亡；但 对鲤胚胎孵化时间无影响，无致畸效应。 2 油茶籽饼水浸液对鲤急性毒性随鲤的发育而逐步增强：幼鲤( 3 0 9 ) 对药物最 敏感，胚胎期最不敏感。鲤胚胎、初孵仔鱼、幼鲤的9 6 hl c 5 0 值依次3 6 1 5m g l 、1 1 1 m g l 和1 0 9 8m g l ；油茶籽饼对鲤不同发育阶段均为低毒。 3 油茶籽饼水浸液对鲤( 1 0 0 9 ) 进行亚急性毒性试验表明：在不同低浓度油茶籽 饼水浸液( 4 8 hl c 5 0 值的1 1 0 、1 6 、1 4 、1 3 、1 2 ) 染毒2 1 d 情况下，鲤( 1 0 0 9 ) 血 液生理生化指标、外周血红细胞微核率以及组织病理学的均变化明显。 4 染毒情况下，鲤血液生理生化指标变化显著：与对照组相比，浓度组鲤r b c 数量、h b 含量减少，有贫血症状；外周未成熟红细胞增多，红细胞变小；血清n a + 、 c a 2 + 浓度显著降低，电解质平衡破坏；血清t p 、g l u 含量明显降低，b u n 含量升 高，物质代谢受到影响；血清g o t 、g p t 和创旧酶活性显著增高，表明组织损伤 明显；s o d 酶、g s h p x 酶活性初期显著激活而随染毒加重而抑制，机体o r f 浓度 升高，组织过氧化损伤。血液生理生化指标在染毒第3 d ，各指标变化不明显，第7 d 及以后，逐渐与对照差异显著，高浓度组最明显。 5 油茶籽饼水浸液对鲤有一定的致突变效应：高浓度、长时间染毒的情况下， 鲤外周红细胞微核率显著上升。 6 油茶籽饼水浸液对鲤鳃、肝、肾组织影响显著。中毒鲤鳃上皮细胞增生，相 邻鳃小片融合形成；鳃小片变形，间隙形成局部血肿；鳃丝血管扩张充血，毛细血 管裸露。肝脏组织：肝细胞肿大，空泡变性，形成局部坏死区域；病变逐渐由边缘 组织向中部扩散。肾组织：肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性；部分上皮细胞溶解、 脱落；肾小球萎缩。高浓度组在染毒第7 d 便表现出明显的组织损伤，其程度随染毒 时间的延长而愈发严重：而低浓度组在试验结束时，组织病理变化仍较轻微。 关键词：油茶籽饼水浸液；鲤；胚胎孵化；急性毒性；亚急性毒性 a b s t r a c t c a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k ew a su s e da sap l a n tm o l l u s c i c i d et oc o n t r o lo n c o m e l a n i a h u p e n s i s t h ea i m so ft h ep r e s e n ts t u d yw e r et oa s s e s st h et o x i c o l o g i c a le f f e c to fw a t e r e x t r a c tf r o mc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k eo nc o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i o ) i tw a sas a f e e v a l u t i o no fc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k et oc o m m o nc a r p f u r t h e r m o r e ，w et r i e dt o p r o v i d et h es c i e n t i f i ce v i d e n c et ou s ec a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k ek i l l i n go n c o m e l a n i a h u p e n s i s i nt h et o x i c i t yt e s t s ，w a t e re x t r a c tf r o mc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k ew a su s e da s t h ee x p e r i m e n t a lt o x i c a n ta n dc o m m o nc a r pa st h ee x p e r i m e n t a lc r e a t u r e t h em a i n c o n c l u s i o n sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w ： w a t e re x t r a c to fc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k eh a dac e r t a i ne f f e c to nt h eh a t c h i n go f c o m m o nc a r pe m b r y o s t h eh a t c h i n gs u c c e s ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nr e s p o n s et o c o n c e n t r a t i o n so ft h et o x i c a n ti n c r e a s i n g , a b o v e2 0 0m g l 1 w h e na t5 0 0m g l 1 ，a l lt h e e m b r y o sd i e db e f o r et h e yw e r eh a t c h e d t h e r ew a s n oe f f e c to nt h et i m et oh a t c ha n d v i s i b l et e r a t o g e n i ce f f e c t t h ea c u t et o x i c i t yt e s t so nt h ed i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e so fc o m m o nc a r p s h o w e dt h a t ：t h ef r i e s0 0 9 ) w a st h em o s ts e n s i t i v et ot h et o x i c a n t ，t h ee m b r y o sw a st h e o p p o s i t eo n e t h e9 6 hl c s ov a l u e sf o rc o m m o nc a r pe m b r y o s ，t h en e w l yh a t c h e dl a r v a e a n dt h ef r i e sw e r ee s t i m a t e da t3 6 1 5 ，11 0a n d1 0 9 8m g l 1 ，r e s p e c t i v e l y s ow a t e re x t r a c t f r o mc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k ew a sc o n s i d e r e da sl o w l yt o x i c ，a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e so fc o m m o nc a r p t h es u b a c u t e t o x i c i t yt e s t ( e x p o s e d2 1d a y s ) s h o w e dt h a t ：i n d i f f e r e n t 】o w c o n c e n t r a t i o no ft h et o x i c a n t ( 1 l o ，1 6 ，1 4 ，1 3a n d1 2o f4 8 hl i 岛o ) ，t h ee f f e c t so n h a e m a t o l o g i c a ib i o c h e m i c a li n d i c e s ，f r e q u e n c i e s o fm i c r o n u c l e ii n e r y t h r o c y t e sa n d p a t h o l o g i c a lc h a n g e so f c o m m o nc a r p ( 1 0 0 9 ) w e r eo b v i o u s c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ， t h ee f f e c to ft h et o x i c a n to nh a e m a t o l o g i c a lp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li n d i c e sw e r e s i g n i f i c a n t t h er b c n u m b e r sa n dh bc o n t e n tr e d u c e d ，a p p e a r i n ga n a e m i a e r y t h r o c y t e s b e c a m es m a l l e r , b e c a u s eo fi m m a t u r ee r y t h r o c y t e si n c r e a s i n gi nt h ep e r i p h e r a lb l o o d n a + a n dc a z + c o n c e n t r a t i o n si ns e h l md r o p p e do b v i o u s l y , s ot h eb a l a n c eo fs e r u me l e c t r o l y t e i n t e r r u p t e d t o t a ls e r u mp r o t e i n ( t p ) a n dg l u c o s e ( g l u ) c o n t e n t sd e c r e a s e d ，b u tb l o o d u r e a n i t r o g e n ( b u n ) i n c r e a s e d w h i c ha f f e c t e dt h em e t a b o l i t e i ns e r u m g l u t a m i c o x a l a c e t i ct r a n s a m i n a s e ( g o t ) ，g l u t a m i c p y r u v i ct r a n s a m i n a s e ( g p l ) a n d a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) a c t i v i t i e si n c r e a s e dn o t a b l y , w h i c hi n d i c a t e dp a t h o l o g i c a l c h a n g e sw e r eo b v i o u s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g s h - p x ) a c t i v i t i e sw e r e , s l i 曲t l ya c t i v a t e da tt h eb e g i n n i n ga n dt h e nr e s t r a i n e d ，e s p e c i a l l yi nt h e h i g h e rc o n c e n t r a t i o ng r o u p s ，w h i c hc a u s e da c t i v eo x y g e nd a m a g e a tt h e3 坩d a y ，t h e i n d i c e sd i d n tc h a n g eg r e a t l y ，b u ts i n c et h e7 md a y ，m o s to ft h e mc h a n g e dn o t a b l y , e s p e c i a l l yi nt h eh i ，g h e s tg r o u p t h et o x i c a n th a dac e r t a i nm u t a g e n i ca c t i v i t yo nc o m m o nc a r p e x p o s i n gi nh i g h e r c o n c e n t r a t i o na n dw i t hl o n g e rt i m e ，t h ef r e q u e n c i e so fm i c r o n u c l e ii ne r y t h r o c y t e s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 1 1 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 t h er e s u l t so fr o u t i n et i s s u ed y e i n ga s s a yi n d i c a t e dt h a tp a t h o l o g i c a lc h a n g e si n d i f f e r e n tt i s s u e sw e r eo b v i o u s h y p e r a e m i a ，s w e l l ，c u r v e ，h y p e r p l a s i af o r m e dc e l ls p l a t e a n ds l o u g hi nt h eg i l ll a m e l l ae p i t h e l i u m b l o o dv e s s e l so ft h eg i nl a m e l l ac o n g e s t e d ，a s w e l la sb l o o d e d s w o l l e ni ns o m ea r e a s s w e l l ，f a t t ya n dv a c u o l a rd e g e n e r a t i o ni nt h el i v e r c e l l s a n dp a r t i a lp u t r e s c e n c eo fl i v e rt i s s u e t h ea r e ao ft h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e si nl i v e r t i s s u eb e g a nf r o mm a r g i nt ot h ec e n t r a l h y p e r e m i a ，s w e l l ，v a c u o l a ra n dd e s q u a m a t e d d e g e n e r a t i o ni nt h en e p h r i ct u b u l a re p i t he p i t h e l i u m a n dt h ea t r o p h yo fg l o m e r u l u s p a t h o l o g i c a lc h a n g e sw e r en o t a b l yi nt h eh i g h e s tg r o u pa tt h e7 md a y ；a n dt h ei n f l u e n c e s b e c a m es e v e r i t yw i t ht h et i m ee x t e n d i n g t h el o w e rg r o u p sw e r en o to b v i o u s ，e v e n t h o u g hi nt h ee n do ft h et e s t k e yw o r d ：a q u e o u se x t r a c tf r o mc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k e ；c y p r i n n sc a r p i o ；h a t c h i n g ； a c u t et o x i c i t y ；s u b a c u t et o x i c i t y i l l 但丽：油茶籽饼水浸液对鲤毒性效应的研究 l c 5 0 r b c h b k - n a + c r c a 2 + b u n t p g l u 煳 g o t g p t s o d 主要缩略语表 5 0 l e t h a lc o n c e n t r a t i o n半致死浓度 r e db l o o dc e l l s 血红细胞 h e m o g l o b i n 血红蛋白 k a l i u mi ns e r u m s o d i u mi ns e r u m c h l o r i n ej ns e r u m c a l c i u mi ns e r u m b l o o du r e an i t r o g e n t o t a lp r o t e i n g l u c o s ei ns e r u m 血清钾 血清钠 血清氯化物 血清钙 尿素氮 总蛋白 血糖 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e碱性磷酸酶 g l u t a m i c o x a l a c e t i ct r a n s a m i n a s e 天冬氨酸氨基转移酶 g l u t a m i c p y r u v i ct r a n s a m i n a s e 丙氨酸氨基转移酶 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e g s h p xg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e 0 f r a e c o x y g e nf r e er a d i c a l s 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶 氧自由基 a q u e o u se x t r a c tf r o mc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k e i v 油茶籽饼水浸液 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 目 是否保密 疋 如需保密，解密时间 纱8 年6 月7 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究2 t _ 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：伦确 时同：缸埘多年月尹日 学位论文作者签名：倪砀 导师签名：琴爱谚茬 签名日期：影年多月9 日 签名日期：哆卯舀年f6 月 9 日 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 前言 1 1 药物灭螺研究概述 钉螺( o n c o m e l a n i ah u p e n s i s ) 是日本血吸虫( s c h i s t o s o m aj a p o n i c u m ) 唯一的中间寄 主，控制钉螺的孳生是预防血吸虫病传播有效的方法之一。目前，杀灭钉螺的方法很 多，有物理、生态、药物等方法( 彭卫平等，1 9 9 5 ；沈礼卿，1 9 9 8 ) ；而药物灭螺是 消灭或减钉螺感染和传播最有效的方法之。从5 0 年代至今，我国常用的灭螺药物有 生石灰、敌百虫、五氯酚钠、氯硝柳胺、溴乙酰胺等化学制剂。五氯酚钠在国内一直 沿用了3 0 多年，虽然灭螺效果良好；但对非靶生物尤其是鱼虾等养殖类具广谱毒性， 造成严重的环境污染已列为禁用品，被氯硝柳胺、溴乙酰胺等药品取而代之( 张兵等， 2 0 0 1 ) 。氯硝柳胺灭螺药效长，但水溶性差，作用速度慢，且使用时钉螺有上爬现象； 此外，其价格昂贵，因而难以大面积推广应用( 戈文兰等，2 0 0 0 ) 。溴乙酰胺是1 9 8 0 年由中国预防医学科学院寄生虫病研究所研制而成，有较好的灭螺效果，用量少、易 溶于水、对鱼虾毒性低，是目前最为理想的化学灭螺药物( 朱达培等，1 9 9 8 ) 。 虽然，化学药物灭螺快捷、有效，但为了减轻药物对人、畜、鱼等非靶生物的 毒害、减少在水域、陆地生态环境中的残留，以及克服钉螺对化学药物的耐药性等 诸多潜在问题，人们仍致力于植物灭螺药物的研制和开发。 1 1 1 植物灭螺药物研究现状 植物药物灭螺，是指对于某些含灭螺有效成分的植物资源，通过提取有效成份 或直接水浸进行的灭螺活动。自1 9 3 3 年，a r c h i b a l d ( 1 9 3 3 ) 首次报道利用b a l a n i t e s a e g y p t i c a 果实进行灭螺实验以来，迄今为止，大约已有10 0 0 余种植物被用于灭螺活 性实验，并筛选出对钉螺具有较强毒杀作用或对其繁衍有抑制作用的植物。但这些 灭螺植物主要用于杀灭分布在欧洲、非洲及美洲地区的几种水栖型螺蛳b o a n p h a l a r i a g l a b r a t a 和b u l i n u st r a n c a t a $ ；而对分布在我国及亚洲地区的水陆两栖钉螺的杀灭作用 研究较少。近年来，在我国已发现有数十种植物对钉螺有强烈毒杀作用，如盾叶薯 蓣( d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s ) 、黄果茄( s o l a n u mx a n t h o c a r p u m ) 、羊蹄( r u m e x j a p o n i c u s ) 、 商陆( p h y t o t a c c aa c i n o s a ) 、樟树( c i n n a m o m u r nc a m p h o r a ) 、枫杨( p t e r o c a r y a s t e n o p t e r a ) 、夹竹t 眺( e r i u mi n d i c u m ) 、乌桕( s a n p i u ms e b i f e r u m ) 、紫云英( a t a g a l u s s i n i c u s ) 、禾叶山麦冬( l i r i o p eg r a m i n i f o l i a ) 等植物( 靡留西等，1 9 9 7 ；冯新港等，2 0 0 2 ) ， 这些植物按适当浓度浸杀、喷洒或撒粉，都对钉螺有一定致死效应。 从化学物质上看，灭螺植物含有的杀螺有效成分，主要有皂甙、生物碱、硫甙、 黄酮等物质。含有皂甙类植物如薯蓣科的盾叶薯蓣( 俗名黄姜) 中含的薯蓣皂甙( 崔 天义等，1 9 9 8 ) ；商陆科的商陆根中提取商陆皂甙( 李桂玲等，1 9 9 8 ) ；百合科的知 母含甾体化合物、知母皂甙；山茶科的油茶茶籽中含有的茶皂素( 王根法和宋庚明， 1 9 9 5 ) 。生物碱类灭螺的植物如从麻风树种子中提取的麻风树素( 程忠跃等，2 0 0 0 ) ； 但丽：油茶籽饼水浸液对鲤毒性效应的研究 茄科植物黄果茄中富含的多种生物碱皂甙( 魏风华等，2 0 0 0 ) ；豆科植物决明含的 吡咯里西啶型生物碱。硫甙类物质灭螺的植物有十字花科植物油菜含有的硫甙类物 质( 冯新港等，2 0 0 2 ) ，以及利用黄酮类、异黄酮类灭螺的植物( h m a m o u c h i ，1 9 9 9 ) 。 目前研究的灭螺植物中，有效成分含多皂甙类物质居多。 1 1 2 植物灭螺的局限性及前景 2 0 世纪3 0 年代至今，大量植物进行了灭螺实验的研究，但到目前尚未能研究出 一种较好且能推广的植物灭螺药物，主要原因在于： 其一，灭螺药效缓慢； 其二，灭螺植物分布受地域局限： 其三，有效成分含量有限，提取过程繁琐、成本高； 其四，植物水浸液易造成的环境污染。 尽管如此，加快灭螺植物资源的研究、开发仍具有重要意义：一方面，植物灭 螺制剂具有自然降解能力，对非靶生物毒害小，环境污染程度低，正好弥补化学药 物此方面的不足：另一方面，植物灭螺有效单体的结构确证，能为进一步研究新型 的化学合成灭螺药物提供线索。此外，植物灭螺药物中，一些植物有效成分可用作 灭螺的增效剂，与化学或植物灭螺药物合用能显著增强灭螺药效，降低用药剂量， 如从棕榈科植物槟榔种子分离出的摈榔碱( c s h l 3 n 0 2 ) ，本身杀灭钉螺作用弱，但与 五氯酚钠等药物配伍使用，大大降低投药量，增效作用明显( 李桂玲等，2 0 0 1 ) 。 可见，对灭螺植物的研究，能充分利用我国得天独厚的灭螺植物资源优势，研发高 效低毒的植物灭螺药物，为血吸虫防治作出一定贡献。 1 1 3 油茶籽饼作为植物源灭钉螺药物的优越性 油茶( c a m e l l i ad 跆沈m ) 是山茶科( 刀z 印c 翻e ) 山茶属( c a m e l l i a ) t l 茶亚属油茶组植物， 其种子含油量很高，是著名的木本油料植物( 张宏达和任善湘，1 9 9 8 ) 。油茶籽饼是油 茶种子经榨油后的残渣，又称茶饼、茶枯、枯饼。我国湖南、江西、广西等地盛产油 茶，有着极其丰富的油茶籽资源( 陈国生，2 0 0 1 ) ；我国油茶籽资源分布见表1 1 。 表1 1 全国油茶籽资源分布 t a b l e l - 1d i s t r i b u t i o no fc a m e l l i ao l e i f e r as e e d c a k ei no u rc o u n t r y 2 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 油茶籽饼中成分复杂，含有水分约1 0 - 1 4 ，粗脂肪约5 ，粗蛋白1 2 一1 5 ，糖 类3 0 一3 5 ，皂甙1 0 - 1 5 ，纤维素5 - 6 ，咖啡碱0 9 5 一1 ，其它约2 一1 0 ( 靳燕 等，2 0 0 0 ) 。油茶籽饼中丰富的植物蛋白源可以作为畜牧、水产养殖的优质饲料， 茶皂素具有多种活性，也是灭螺的药效成分。与其它植物灭螺药物相比，油茶籽饼 灭螺有以下优点： 作为农副产品，油茶籽饼来源广泛，疫区能够因地制宜、就地取材； 茶皂素含量高； 直接浸杀、泼洒，不需经过繁琐的前处理，操作简单； 茶皂素在较短时间内能自然降解，而解除毒害作用，对环境残留及生物积累 毒害小。 这些优点克服了其它植物及化学药物的弊端，是开发、利用的重要前提。 1 2 茶皂素研究概况 皂素又名皂苷、皂甙，是一类结构比较复杂的糖苷类化合物，广泛存在于自然 界9 0 多科5 0 0 多属的植物( s p a r g e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。根据天然葡萄糖苷酸类型可以分为类 固醇皂苷( t h es t e r o i d a ls a p o n i n s ) 和- - 萜类皂苷( t h et r i t e r p e n o i ds a p o n i n s ) 。茶皂素是山 茶科山茶属植物皂素的统称，是一类结构相近的齐墩果烷型五环三萜类皂苷的混合 物。对茶皂素的深入研究始于上个世纪3 0 年代，但进展缓慢，直至0 1 9 5 2 年，日本学 者石馆守三和上田杨才首次从茶籽中分离出茶皂素的结晶；此后，多位学者对对茶 叶皂素和茶籽皂素做了大量的研究，基本上搞清了茶籽皂素的组成和结构特点( 方 幼兰等，1 9 9 0 ；金继曙等，1 9 9 3 ) 。近2 0 年来，随着分离、鉴定技术的进步，茶皂 素的化学组成、结构研究取得了一些突破性的进展。 1 2 1 茶皂素的化学结构及性质 茶皂素的基本结构由配基、糖体、有机酸三部分组成，其配基一苷( 甙) 元是 b 一香树素f b a m y r i n ) 衍生物，基本碳架为齐墩果烷( o l e a n a n e ) ：糖体主要有阿拉伯糖、 木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等；有机酸主要有当归酸、惕各酸、醋酸、肉桂酸等； 有机酸和配基的结合形式是配基上的羟基与有机酸形成酯，平均分子式c 5 7 h 9 0 0 2 6 。 茶皂素一般的分子结构见图1 - 1 。 目前已分离鉴定出茶籽皂素7 种苷元，茶叶皂素4 种苷元( 赵世明，1 9 9 8 ) 。从茶 籽皂素中分离的7 种皂苷配基分别是茶皂苷元a 、茶皂苷元b ( 玉蕊精醇c ) 、茶皂 苷元c ( 山茶皂苷元c ) 、茶皂苷元d ( 山茶皂苷元a ) 、茶皂苷元e 、山茶皂苷元b 及山茶皂苷元d 。这七种皂苷配基，均为齐墩果烷的衍生物，区别仅在于a 环上c 一2 3 、 c 2 4 及e 环c 2 1 所接的基团不同。茶皂苷元a 、b 分别见图1 2 、图1 3 。由于不同 配基与配糖体连接、不同有机酸与配基的连接以及连接方式的差异，所以由皂苷配基、 糖体和有机酸按一定方式连接组成的茶皂素，是一类结构相似的混合物。 3 但丽：油茶籽饼水浸液对鲤毒性效应的研究 ho t - i 图1 1 茶皂素分子结构式 f i g 1 - 1t h e s t r u c t u r a lf o r m u l ao ft h e a s a p o n i n s 图1 2 茶皂苷元a f i g 1 2 t h e a s a p o g e n o la 图1 3 茶皂苷元b f i g 1 - 3t h e a s a p o g e n o lb 茶皂素的复杂多样，其分离和结构鉴定是一个富有挑战性课题。近几年来由于 高效液相色谱( h p l c ) 、反相高效液相色谱( r p h p l c ) 成为分离皂素的常用方法；各 种核磁共振技术、质谱技术等的应用使得使茶皂素的单体分离和结构研究进入了一 个新的发展阶段，目前已经分离和鉴定出了十多种新型皂素。 1 9 9 4 年，s a g c s a k a 等( 1 9 9 4 ) 在茶叶( c a m e l l i as i n e n s i sv a r - s i n e n s i s ) r 和发现一种新的 葡萄糖苷酸型皂素，确证了茶叶皂素b 1 的结构。 1 9 9 8 年，k i t a g a w a 等( 1 9 9 8 ) 从茶树( c a m e l l i as i n e n s i sl o k u n t z e ) 种子中分离出两 种新的酰化的齐墩果烷型三萜类皂甙，茶皂素e 1 和e 2 的结晶，并且分别从化学和物 理化学的角度阐明了e 1 e 2 的结构。 1 9 9 9 年，m u r a k a m i 等( 1 9 9 9 ) 从茶籽( c a m e l l i as i n e n s i sl v a r a s s a m i c ap i e r r e ) 中分 离出的具有肠胃保护功能的茶皂素成分，并证明- j a s s a m s a p o n i n s 中a 、b 、c 、d 、 e 的结构。 4 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 0 0 0 年，l u ( 2 0 0 0 ) 等从茶树( c a m e l l i as i n e n s i sv a ra s s a m i c a ) 根中分离出三种具有 三环五萜结构的茶皂素单体，命名为r t - s a p o n i n s ab ，c ，并分别鉴定其结构。 1 2 2 茶皂素性质 目前茶皂素分类没有同一标准，可以根据品种来源或提取部位不同，细分为油 茶籽皂素( s a p o n i nf r o mt h es e e do f c a m e l l i ad 彪睁，口) 、茶籽皂素( n e as a p o n i n ) 、茶叶 皂素( s a p o n i nf r o mt h el e a fo ft h e a s i n e n s i s 工) 、茶树根皂素( r t - s a p o n i n so fc a m e l l i a s i n e n s i sv a r ) 等。对于油茶籽皂素的研究，国外尚未见有详细报导，国内对油茶籽皂 素理化性质的研究也较少。方幼兰等( 1 9 9 0 ) 将油茶籽皂素与其它茶皂素理化特性进 行比较，瓜及u v 分析证明：油茶籽皂素与茶籽皂素、白皂素属于同一类型的糖甙化 合物；同样具有水溶性好、抗硬水能力强、泡沫持久性好等特点。金继曙等( 1 9 9 3 ) 对油茶籽饼中抗真菌活性成分进行红外光谱分析，其有效成分经酸、碱水解后所得 到的三个主要皂苷元，用红外光谱分析的碳氢吸收峰均显示齐墩果烷型五环三萜化 合物的典型特征，证明油茶籽皂素属齐墩果烷五环三萜皂苷。虽然，油茶籽皂素与 茶籽( 或叶) 皂素理化特性有相似性，属于同一类型的糖甙化合物；但在u v 光谱分 析中吸光强度等方面还存在着差异。工业产品、研究文献往往忽略不同类茶皂素理 化特性间的细微差别，将茶饼中提取的皂素统称为“茶皂素。 纯化的茶皂素是一种无色的微细柱状结晶体，熔点为2 2 4 一2 2 5 ，味苦辛辣， 有很强的起泡力和溶血作用；不溶于乙醚、氯仿、丙酮、苯、石油醚等溶剂，易溶 于含水甲醇、含水乙醇、正丁醇及冰醋酸、醋酐和吡啶中；具有催化酯水解的作用 ( 刘理中，1 9 9 5 ；黄冬梅等，2 0 0 3 ) 。 1 2 3 茶皂素应用研究 茶皂素的分子中具有亲水性的糖体和疏水性的配位基团，是一种性能优良的非 离子型天然表面活性剂，具有乳化、分散、润湿、去污、发泡、稳泡等多种表面活 性，广泛应用于建材、日用化工、纺织、农药及食品工业在建筑工业，用茶皂素 作为发孔剂制造微孔分布均匀的阻燃轻质建筑材料；以及加气混凝土工业的气泡稳 定剂、纤维板生产中的石蜡乳化剂( 田洁华和王路，1 9 9 5 ) 。在日化行业，利用茶 皂素对蛋白质、纤维类的无损伤性，来开发洗发剂，毛、丝、羽绒等洗涤剂等化工 产品( 马世宏和张卫明，1 9 9 4 ) 。在农药工业领域中，茶皂素作为固体型农药中的 湿润剂与悬浮剂；乳油型农药的增效剂与展着剂；除草剂类农药或稍溶于水农药 的助溶剂( 王小艺和黄炳球，1 9 9 8 ) 。 茶皂素的生物活性则表现抗菌、杀菌、消炎、抗氧化、抗癌等方面。茶皂素或 油茶皂素对白色念珠菌、红色癣菌、紫色癣菌等皮肤常见致病真菌；青霉菌、单细 胞真菌啤酒酵母等食品腐败菌；小麦纹枯病菌、棉花黄萎病菌等植物病原真菌均有 较强的抑菌、杀菌作用( 金继曙等，1 9 9 3 ；侯如燕等，2 0 0 6 ) 。s a g e s a k a 等( 1 9 9 6 a ， 5 但丽：油茶籽饼水浸液对鲤毒性效应的研究 1 9 9 6 b ) 发现茶叶皂素对由角叉胶诱发的大鼠足浮肿有显著的抑制作用。s u r ( 2 0 0 0 ) 从 茶根提取物f t r e ) 中分离出两组茶皂素t s l 、t s 2 ，经体外实验证明有抗氧化和抗炎 作用。黄起壬( 2 0 0 3 ) 研究发现油茶皂苷具有抗心肌缺血大鼠氧自由基和脂质过氧化 的作用。c h a u d h u r i ( 1 9 9 8 ) 研究发现t r e 对小鼠3 m e t h y l c h o l a n t l l r i n e 诱导的固性肿瘤具 有良好的治愈作用。 此外，茶皂素的生物活性还表现在具有驱虫、杀虫、杀软体动物等作用。茶皂 素对菜青虫具有一定的胃毒和较强的忌避作用，对莱粉蝶、小菜娥等鳞翅目幼虫具 有较强的拒食和抑制生长发育的作用( 胡绍海和胡卫军，1 9 9 7 ) 。茶皂素对危害水 稻的福寿螺，危害蔬菜的细钻螺、琥珀螺、蜗牛、蛞蝓、钉螺等多种有害螺类均有 较好的毒杀效果( 夏春华等，2 0 0 0 ) 。 1 2 。4 茶皂素提取工艺研究概况 随着茶皂素应用研究的发展，茶皂素提取工艺，先后历了水浸提、有机溶剂法、 水提一醇萃法等提取工艺( 方幼兰和张永祥，1 9 9 3 ；黄冬梅等，2 0 0 3 ) 。 水提法是利用茶皂素溶解于热水的性质，将粉碎的茶籽饼用热水浸泡，然后过 滤、浓缩、脱色、再浓缩、再脱水后干燥即可得粗茶皂素粉料。该方法工艺简单、 成本低、投资少、见效快。不足之处是水溶液蒸发量大，能耗高，生产周期长，且 提取的茶皂素纯度低、颜色深、质量差，再纯化比较困难。用这种茶皂素产品只能 用作农药、沥青乳化剂，不能用于化妆品及作为化学化工添加剂。 有机溶剂法是用含水甲醇或乙醇等有机溶剂作为浸提液。由于甲醇毒性的限 制，大多选用乙醇作为浸提溶剂。该法能耗小，产品颜色浅，收率高，纯度高，便 于生产粉剂，易再纯化，产品可用作生化试剂和医药原料，但生产中使用大量溶剂 造成浸泡渣中溶剂回收量大，且乙醇的汽化耗热大，生产成本高。 此后有水提一醇萃法、水提一沉淀法等改良的提取工艺虽然能克服前面方法的 在纯度、回收瓠色泽以及能耗等多方面的不足，却在无形中增加了工艺流程和成 本，不能从根本上解决所存在的问题，因此离生产实践还有一定的距离。可见，茶 皂素的生产工艺虽在不断改进，但至今未有较大的进展。 近年来开始兴起的大孔树脂法、超滤膜法等方法对茶皂素的纯化提供了新的思 路( 赵斌和张文，2 0 0 1 ) ，但在技术上的细节，如水提液的过滤方法，超滤膜的易 堵塞等问题，未能很好的解决，使茶皂素精制阶段的工艺没有大的突破；传统的柱 层析、薄层层析只能用于分析而不适宜工业化生产。 1 2 5 茶皂素对鱼虾毒性作用 茶皂素作为的“清池剂”，在水产养殖中有着广泛的应用。梁亚金等( 1 9 9 2 ) 对茶 皂素和油茶皂素作为海水对虾养殖的“清池剂”进行研究，发现这两种茶皂素对纹缟 缎虎鱼、鲈鱼、梭鱼等野杂鱼具有较强的鱼毒活性，而在致死浓度范围内试验对虾 6 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 均具有较高的耐受力。罗毅志等( 2 0 0 4 ) 对茶皂素作为淡水甲壳类养殖的清塘剂进行 研究，药物浓度为2 5m g l 时，对麦穗鱼、鲐鱼、鲫鱼等鱼类具有较强的致死毒性； 而对淡水青虾、罗氏沼虾和河蟹即使浓度达1 8m g l 也都能正常存活；对青虾的生 长无不良影响。朱全芬等( 1 9 9 3 ) 对茶皂素的鱼毒作用进行了研究，发现其毒害作用 首先是破坏鱼鳃上皮细胞，使鳃微血管外露，茶皂素进入循环系统，从而造成红细 胞溶血。虾、蟹等甲壳类虽然也是以鳃为呼吸器官，但由于其血液中携氧蛋白结构、 鳃的组织构造等方面的差异，使得甲壳动物对茶皂素具有较高的耐受性。 茶皂素的鱼毒活性与水质的盐度、水温、p h 值等多种环境因素有关。水质的盐 度能促进茶皂素的鱼毒活性，因而对海水鱼类，其致死浓度一般小于1m g l ，而对 于淡水鱼类，致死浓度较高，约为5m g l 。水温的升高能增强茶皂素的鱼毒活性， 水温高时鱼死亡速度加快。p h 值能够改变茶皂素的化学结构，从而影响鱼毒活性。 茶皂素在碱性条件会水解，茶皂素不稳定苷元与有机酸相接的酯键断裂分解成原皂 草精醇a 和有机酸，其鱼毒活性自然降解而失去( 夏春华等，2 0 0 0 ) 。此外，不同 来源的茶皂素，其鱼毒活性存在差异( 梁亚金等，1 9 9 2 ) 。 1 3 研究目的和意义 油茶是重要的木本油料植物，在我国湖南、江西、浙江、湖北、安徽、广西等 地广泛种植。试验证明：油茶籽饼对血吸虫的中间寄主钉螺具有较好的杀灭作用 ( 2 0 0 4 1 0 于洪湖市新滩镇野外试验) 。作为植物制剂，油茶籽饼不仅具有易降解、 环境污染小的优点；而且同其它灭螺植物相比，有来源广、茶皂素含量高f 灭螺操 作简单等特色，使其开发为一种植物灭螺药物成为可能。在使用油茶籽饼灭螺的同 时，结合黄鳝( m o n o p t e r u sa l b u s ) 、克氏原鳌虾( p r o c a m b a r u sc l a r k i a ) 、鲤( c y p r m n s c a r p i o ) 等能够摄食钉螺的水生动物的共同作用( 张世萍等，2 0 0 1 ) ，效果更好。此 外，鲤鱼是我国水产养殖的主要对象，也是o e c d ( 1 9 9 2 ) 推荐的作为淡水鱼类毒性试 验标准物种之一，对评价油茶籽饼对水域环境的安全具有广泛的代表性和实践意义。 试验中以鲤( c y p r i n n sc a r p i o ) 为试验动物，以油茶籽饼水浸液作为药物，通过直 接浸泡染毒，研究油茶籽饼对鲤毒性效应。论文通过鲤胚胎孵化，鲤不同发育阶段 的致死效应，中毒鲤血液生理生化指标的变化、外周血红细胞微核率及组织病理变 化等方面综合分析油茶籽饼对鲤的毒性影响，评定药物使用的安全性，为开发油茶 籽饼作为植物灭螺药物，建立生物防治与植物灭螺药物共同作用的灭螺方式，提供 一定的科学依据。 7 但丽：油茶籽饼水浸液对鲤