（植物学专业论文）植物防卫反应中的单线氧及小g蛋白ran.pdf

、王1 0 1 0 3 7 摘要 植物防卫反应中的单线氧及小g 蛋白r a n 植物在自然界生长过程中经常要遭受外界环境对它的危害和胁迫，主要可以分为生 物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要有病原微生物( 包括真菌、细菌和病毒) ，动物及 杂草等。非生物胁迫包括光照、土壤、水质、空气等环境条件对植物造成的危害。高等 植物为了抵抗这些危害，形成了许多复杂的防御机制。除了自身具有的组成型保护系统 ( 如细胞壁、腊质、尖状物、角质层等) ，建立在对外界危害成功识别基础上的植物防 卫反应对于植物的生存非常重要。 关于植物防卫反应中的信号分子以及信号转导，已经取得了很多重要的结果。然而 还有许多重要的问题尚未解决，尤其是高等植物对非生物胁迫的反应机制方面。我们以 人参悬浮细胞为实验材料，研究了真菌激发子诱导下单线氧的产生情况，进一步证明了 单线氧在植物防卫反应中作为信号分子的作用。此外，我们发现水稻中的o s p 啊n 2 基因 在非生物胁迫下，表达发生变化，过量表达o s r a n 2 基因的拟南芥种子在非生物胁迫下 萌发受到严重影响。实验主要取得如下结果 ( 1 ) 真菌激发子诱导人参悬浮细胞产生单线氧，释放乙烯以及皂甙合成的研究 单线氧是一种高能态的分子氧，是化学和生化反应中最活跃的媒介之一。它在植物 对紫外照射和强光的防卫反应中起着重要作用。c l e 是来自于真菌金瓜炭疽 ( c o l l e t o t r i c h u ml a g e r a r i u m ) 细胞壁的一种激发子。在我们的实验中，c l e 处理人参悬 浮细胞能够强烈诱导单线氧的产生，激活质膜n a d p h 氧化酶和a c c 氧化酶，继而释 放乙烯，增加皂甙合成。同时，皂甙合成途径中的关键酶一鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基 因转录水平提高，3 - 香树素合成酶蛋白水平积累增加。我们抑制c l e 诱导的单线氧的产 生或者乙烯的合成均能抑制皂甙的合成，而用单线氧或乙烯分别单独直接处理人参细胞 则可以诱导皂甙合成。这些结果显示，c l e 诱导产生的单线氧和乙烯对皂甙合成都是必 需的，并且单线氧可能作用于乙烯的上游。 ( 2 ) 非生物胁迫诱导水稻o s r a n 2 基因表达变化的研究 小g 蛋白r a n 是一种主要分布于细胞核内的蛋白质，分子量大约为2 5 k d 。分子结 构分析表明，该蛋白属于原癌基因r a s 大家族中的一员，因此得名r a n ( r a s r e l a t e dn u c l e a r p r o t e i n ) 。r a n 在核质间物质运输、有丝分裂中纺锤体的形成以及核膜的安装方面具有重 要作用。我们在实验中发现，将水稻小苗在黑暗中水平放置给予9 0 度重力刺激9 h 时 水稻根部以上叶鞘区约1 厘米长的区段( l s s ) o s r a n 2 基因的表达下降，并且仅在上 半部叶鞘区表达。用i a a ，a b a ，n a c l 分别处理时，水稻l s s 部位o s r a n 2 基因的表 达也同样下降。过量表达o s r a n 2 基因得到的转基因拟南芥种子，在用a b a ，n a c l p e g 处理时，其萌发受到严重影响。由此，我们推测，o s r a n 2 基因可能参与高等植物 中非生物胁迫诱导的信号转导。 关键词：激发子，单线氧，非生物胁迫，小g 蛋白r a n ，转基因 a b s t r a c t s i n g l e to x y g e na n ds m a l lg t p a s e r a ni np l a n td e f e n s er e s p o n s e x i a o j i ex u ( p l a n ts c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rw e i m i n gc a i p l a n t sm a ye x p e r i e n c es e v e r a ld i s t i n c ts t r e s s e se i t h e rc o n c u r r e n t l yo ra td i f f e r e n tt i m e s t h r o u g ht h eg r o w i n gs e a s o n t h es t r e s s e s c a nb ed i v i d e di n t ob i o t i cs t r e s s e sa n da b i o t i c s t r e s s e s b i o t i cs t r e s s e si n v o l v ep a t h o g e n i c ( i n c l u d ef u n g i ，b a c t e r i aa n dv i r u s ) ，a n i m a la n d w e e d s a b i o t i cs t r e s s e si n v o l v et h ee n v i r o n m e n tc o n d i t i o n ss u c ha si l l u m i n a t i o n ，a t m o s p h e r e m o i s t u r ea n ds o i lw h i c he n d a n g e rt h ep l a n t i no r d e rt or e s i s tt h e s es t r e s s e s ，p l a n t se m p l o y m a n yd e f e n s em e c h a n i s m s i na d d i t i o nt ot h ec o n s t i t u t i v ep r o t e c ts y s t e mi t s e l fp o s s e s s e s ( e g c e l lw a l l ，c e r o l i p o i d ，c u t i c u l ae ta 1 ) ，t h ep l a n td e f e n s er e s p o n s e sb a s e do nt h es u c c e s s f u l r e c o g n i t i o no fs t r e s si sv e r yi m p o r t a n tf o rs u r v i v a l s e v e r a ls i g n a lm o l e c u l e sa n dt h es i g n a lt r a n s d u c t i o nh a v eb e e nr e c e n t l yi m p l i c a t e di n p l a n td e f e n s er e s p o n s e b u ts o m ec r u c i a lp r o b l e m sh a v en o tb e e nr e s o l v e d ，e s p e c i a l l yt h e m e c h a n i s mo fp l a n t st or e s i s tt h ea b i o t i cs t r e s s w et o o kt h ec u l t u r e ds u s p e n s i o nc e l l so f p a n a xg i n s e n ga so u re x p e r i m e n t a lm a t e r i a l ，s t u d i e dt h eg e n e r a t i o no fs i n g l e to x y g e nw h i c h i n d u c e db yf u g a le l i c i t o r , t e s t i f i e dt h es i n g l e to x y g e na c t e da sas i g n a lm o l e c u l ei np l a n t d e f e n s er e s p o n s e s w ea l s of o u n da b i o t i cs t r e s si n d u c e do s r a n 2e x p r e s s i o nc h a n g ei nr i c e o v e r e x p r e s s i o no s r a n 2i na r a b i d o p s i s ，t h es e e d sw e r eh y p e r s e n s i t i v et oa b i o t i c s t r e s sa n d t h eg e r m i n a t i o nw a ss e r i o u s l ya f f e c t e d w es u s p e c t e do s r a n 2m i g h ti n v o l v et h es i g n a l t r a n s d u c t i o ni n d u c e db ya b i o t i cs t r e s s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) f u g a le l i c i t o ri n d u c e ds i n g l e to x y g e ng e n e r a t i o n ，e t h y l e n er e l e a s ea n ds a p o n i ns y n t h e s i si n c u l t u r e dc e l l so f p a n a xg i n s e n gc a m e y e r s i n g l e to x y g e ni sah i g h e n e r g ym o l e c u l a ro x y g e ns p e c i e s a so d eo f t h em o s ta c t i v e i n t e r m e d i a t e si n v o l v e di nc h e m i c a la n db i o c h e m i c a lr e a c t i o n s ，s i n g l e to x y g e n p l a y se s s e n t i a l r o l e si np l a n tr e s p o n s e st ou va n ds t r o n gl i g h t h e r e ，w er e p o r tt h a tc l e ，a ne l i c i t o rd e r i v e d f r o mf u n g a lc e l lw a l l s ，i n d u c e st h eg e n e r a t i o no fs i n g l e to x y g e ni nc e l lc u l t u r e so fg i n s e n g ， p a n a xg i n s e n g c l et r e a t m e n ta l s ot r i g g e r st h ea c t i v a t i o no f p l a s m am e m b r a n en a d p h o x i d a s ea n d1 。a m i n o c y c l o p r o p a n e 一1 一c a r b o x y l i ca c i do x i d a s e ( a c o ) ，s u b s e q u e n t l yl e a d i n gt o e t h y l e n er e l e a s ea n di n c r e a s e ds a p o n i ns y n t h e s i s ，a ss h o w nb yi n c r e a s e dm r n ae x p r e s s i o no f s q u a l e n es y n t h a s e ( s q s ) a n ds q u a l e n ee p o x i d a s e ( s q e ) ，a n da c c u m u l a t i o no f 3 一a m y r i n s y n t h a s e ( 1 3 - a s ) s u p p r e s s i o no f c l e i n d u c e ds i n g l e to x y g e ng e n e r a t i o no ri n h i b i t i o no f e t h y l e n ep r o d u c t i o nb l o c k ss a p o n i ns y n t h e s i s ，w h e r e a st r e a t m e n to f g i n s e n gc e l l sw i t h e t h y l e n eo rs i n g l e to x y g e ni n d u c e st h es y n t h e s i so f s a p o n i n t o g e t h e r ，t h e s er e s u l t si n d i c a t e t h a ts i n g l e to x y g e na l s oa c t e da sas i g n a lm o l e c u l ei np l a n td e f e n s er e s p o n s e ，c l e i n d u c e d p r o d u c t i o no f b o t hs i n g l e to x y g e na n de t h y l e n ei sr e q u i r e df o rs a p o n i ns y n t h e s i s ，a n dt h a t s i n g l e to x y g e nm a y f u n c t i o nu p s t r e a mo f e t h y l e n ed u r i n gc l e i n d u c e ds a p o n i ns y n t h e s i s ( 2 ) a b i o t i es t r e s si n d u c eo s r a n 2e x p r e s s i o nc h a n g e t h es m a l lg t p a s er a ni sa ne v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e de u k a r y o t i cp r o t e i n ，m a i n l y d i s t r i b u t e di nn u c l e a r ，h a v i n gm a s s e so f2 5k d t h ea n a l y s i so fm o l e c u l es t r u c t u r er e v e a l s r a ni so n en u m b e ro f t h es u p e r f a m i l yo f r a s ，s oi ti sn a m e dr a nf a a s r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n ) r a nh a sr o l e si nn u c l e a rt r a n s p o r t ，m i t o t i cs p i n d l ea s s e m b l ya n dn u c l e a re n v e l o p ea s s e m b l y w h e nt h er i c es e e d l i n g sw e r eg r a v i s t i m u l a t e db yp l a c e dh o r i z o n t a l l yi nt h ea b s e n c eo fl i g h t ， w ef o u n di nt h el e a f s h e a t hs e g m e n t ( l s s ) o s r a n 2e x p r e s s i o nd e c l i n e da n do n l ye x p r e s s e d i i i nt h et o pl e a fs h e a t h ( t l s s ) e x o g e n o u sn a ，a b ao rn a c la l s oi n d u c e do s r a n 2 e x p r e s s i o nd e c l i n e di nl s so f r i c es e e d l i n g s o v e r e x p r e s s i o no s r a n 2i na r a b i d o p s i s ，t h e s e e d sw e r eh y p e r s e n s i t i v et oa b a ，n a c la n dp e g ，t h eg e r m 、i n a t i o nw e r es e r i o u s l ya f f e c t e d s ow es u s p e c t e do s r a n 2m i g h ti n v o l v ei nt h es i g n a lt r a n s d u c t i o ni n d u c e db ya b i o t i cs t r e s s e s k e yw o r d s ：e l i c i t o r ，s i n g l e to x y g e n ，e t h y l e n e ，a b i o t i cs t r e s s ，o s t m n 2 ，t r a n s g e n e i i i 中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：徐盹杰 日期：聊6 年6 月6 日 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电予文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：硷整叁导师签名：趣! 至 日期：妒z 名 缩略讧j a b a a c c a o a 斟g 0 一a s b l s s c l e d w d p i f w i a a k t k m l s s m c p n o 0 a p c r p e g r a l l r b r r 缩略词 a b s c i s i ca c i d 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 一c a r b o x y l i c a c i d 2 - a m i n o x y a c e t i ca c i d 2 - a m i n o e t h o x y v i n y lg l y c i n e b a m y r i ns y n t h a s e b o t t o ml e a fs h e a t hs e g m e n th a l f c o l l e t o t r i c h u ml a g e r a r i u m d r yw e i g h t d i p h e n y l e n ei n d o n i u m f r e s hw e i g h t l n d o l ea c e t i ca c i d k i n e t i n k a n a m y c i n l e a fs h e m hs e g m e n t 1 - m e t h y l c y c l o p r o p e n e n i t r i co x i d e 0 k a d a i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr s a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l r a s r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n r o s eb e n g a l r u t h e n i u mr e d 脱落酸 a c c 合成酶的抑制剂 a c c 合成酶的抑制剂 1 3 香树素合成酶 下半部叶鞘区段( 水平放置) 一种来自真菌金瓜炭疽细胞壁 的激发子 干重 n a d p h 氧化酶抑制剂 鲜重 吲哚乙酸 激动素 卡那霉素 根上部叶鞘区约l c m 的区段 乙烯抑制剂 一氧化氮 蛋白激酶抑制剂 聚合酶链式反应 聚乙二醇 四碘四氯荧光素 胞内钙源抑制剂 缩略词 r ，r p c r s d s p a g e s q e s q s t l s s u b i r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s s q u a l e n ee p o x i d a s e s q u a l e n es y n t h a s e t o pl e a fs h e a t hs e g m e n th a l f u b i q u t i n 反转录聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺 凝胶电泳 鲨烯环氧酶 鲨烯合成酶 上半部叶鞘区段( 水平放置) 泛素 2 植物防n 反应中的单线氧发小g 蛋白r a n 第一章植物防卫反应中单线氧的产生及作用 前言 1 单线氧的概念及产生 1 1 单线氧的概念 1 2 单线氧的产生 2 单线氧的作用 2 1 单线氧作为信号分子的作用 2 2 单线氧在信号分子转导中的作用 2 3 单线氧在紫外光和高光强伤害中起作用 2 4 单线氧会引起细胞程序性死亡 结束语 堕塑堕兰垦生主塑望些墨垦! ：鱼里皇! 竺 一兰苎堡竺! 堡塑 前言 植物防卫反应中单线氧的产生及作用 植物在自然界的生长过程中经常要遭受外界环境对它的危害，主要分为生物危害和 非生物危害。生物危害主要有病原微生物( 包括真菌、细菌和病毒) ，动物及杂草等。 非生物危害包括光照、土壤、水质、空气等不利生存环境条件对植物造成的危害。 高等植物为了抵抗这些危害，形成了许多复杂的防御机制。其中植物本身具备的物 理或化学屏障构成第一道防御体系，这之后是一组诱导性的防卫反应，这些反应是建立 在植物对入侵危害的成功识别基础之上的。这种识别往往使植物体在危害入侵点周围出 现可见的细胞死亡和过敏反应。危害识别后最快的抗病反应就是所谓的活性氧迸发，形 成大量活性氧。总结起来，高等植物诱导性防卫反应的历程大致可以分为三个阶段：一 是植物细胞对入侵危害的识别；二是胞内识别信号的转换和传递；三是防卫反应的开启 和系统获得性抗性的产生。 活性氧是植物细胞防卫反应中的信号转导分子之一，活性氧主要包括过氧化氢、超 氧负离子、自由基以及单线氧。目前大多数报道主要集中在过氧化氢、超氧负离子以及 自由基在病原菌侵染或激发子的刺激下引起的植物防卫反应中的作用( a p e l 等2 0 0 4 ) ， 关于单线氧的研究仅仅是局限在紫外或者强光引起的植物防卫反应中( f r y e r 等2 0 0 2 ， h i d e g 等2 0 0 2 ，c a m p e r 等2 0 0 3 ) ，单线氧的具体作用以及与其它信号分子问的相互作 用的研究相对还比较少。本篇综述将着重总结单线氧在植物细胞防卫反应中的产生及作 用。 植物防n 反应中的单线氧发小g 噩白r a n 文献综述( 第一章1 1 单线氧的概念及产生 1 1 单线氧的概念 单线氧是一种高能态的分子氧，是氧分子的种特殊存在形式。单线氧属于激发态 氧分子，当氧分子被激发后，最高能量的自旋相反的2 个电子同占1 个n3 轨道，有1 个空 轨道，这就是氧分子的第一激发态，符号为g ( 1 0 。) ，即单线氧。它具有很强的生物活 性，是化学和生化反应中最活跃的媒介之一，它在植物对紫外和强光的防卫反应中起着 重要作用。 1 2 单线氧的产生 产生单线氧的方法可以分为物理方法和化学方法。 物理方法主要是光敏化方法和微波放电法。在光敏剂参加下发生的氧化反应通常被 称为光敏化氧化反应，在光照条件下的细胞中，当光敏剂吸收光子能量，p c h l i d e 将光 能传递到基态的分子氧，将其提升到激发单线态时，就会产生单线氧( g o l l n i c k1 9 6 8 ) 。 微波放电法是通过微波放电发生能量传递，从而产生单线氧。 化学方法有很多种，其中最常用的是0 2 一c l o 一法。单线氧可以通过过氧化离子0 ” 和各种局部被卤代的中间体反应而被得到。在生物体内，超氧负离子或者通过化学歧化 生成单线氧，或者通过超氧化物歧化酶( s o d ) 催化形成基态氧分子，因此生物体内单 线氧的重要来源之一可能就是超氧负离子的歧化。 2 单线氧的作用 单线氧能够迅速的与氨基酸、不饱和脂类以及其它细胞成分发生反应，所以单线氧 植物防卫反应中的单线氧及小g 蛋白r a n文献综述( 第一章) 在细胞中存在的时间非常短暂 l o o n s ，在细胞中也只能运输很短的距离 。在高强光下，当植物叶绿体吸收的光能超过光和能 力时，会产生单线氧( f r y e r 等2 0 0 2 ，h i d e g 等2 0 0 2 ，c a m p e r 等2 0 0 3 ) 。高光强下植 植物防卫反应中的甲线氧及小g 蛋白r a n文献综述( 第一章 物生长变得迟缓、代谢发生变异、诱导新基因表达等等可能都归因于活性氧的产生。在 拟南芥苗期时，单线氧的形成可能是致死的( w a g n e r 等2 0 0 4 ) 。单线氧能够特异地诱 导植物在光氧胁迫下的防卫反应中有关基因的上调( k r i e g e r - l i s z k a y2 0 0 5 ) ，从受侵染的 香蕉树中分离得到的植保菌素在光下诱导产生的单线氧的介导下，其抗菌能力会有所提 高( l a z z a r o 等2 0 0 4 ) 2 4 单线氧会引起细胞程序性死亡 尽管单线氧的生命如此短暂，并且与其直接反应的范n o n 止l 狭小，单线氧在一些医 学治疗以及动植物氧胁迫的反应中却具有非常重要的作用。单线氧的毒性通常会引起细 胞程序性死亡，目前单线氧的这一机理在光动力学方法治疗肿瘤中被应用，并且在紫外 辐射治疗皮肤癌中也被用到( o l e i n i c k 等1 9 9 8 ，m o r i t a 等1 9 9 7 ) 。 在植物体中，当黑暗中生长的突变体“植株恢复光照时，可以观察到两种主要的 胁迫反应：细胞死亡和强烈地生长抑制。恢复光照l h 后就能检测到突变体植株细胞的 死亡，2 3 h 后会出现可见的坏死斑，而野生型或者持续光照条件下的突变体没有这些表 现。突变体“植株在持续光照的情况下与野生型生长速度一致，当处于1 6 h 光照8 h 黑 暗的条件下时，“的生长显著受到抑制，当再次恢复持续光照后，伽的生长速度可以 恢复，这说明这种生长抑制是可逆的( o pd e nc a m p 等2 0 0 3 ) 。 结束语 总之，单线氧参与很多动植物体中胁迫诱导的反应，它在其中的作用很复杂，对于 我们人类来讲，有些时候它是有利的，有时则是有害的。关于其具体作用，还需要更多 植物防l ! 反应中的单线靴放小g 蛋白r a n文献综述( 第一章) 的直接证据来证明。在绝大多数情况下，我们并不清楚单线氧究竟是如何在细胞的某 位置上开始氧化反应，从而开始信号转导，引起基因表达，细胞凋亡，以及其他反应等 等，我们还需要进一步发展和应用新的技术手段来更清楚的解释这些基本问题，从而更 好的了解氧胁迫对动植物体的影响。 植物肪卫反庸中的单线氧及小g 蛋白r a n 文献综述佶；二章 第二章小g 蛋白r a n 的功能及在植物中的研究进展 前言 1 r a n 的基本生化特点 2 r a n 的活性调控 3 r a n 的功能 3 1r a n 在核质间物质转运中的作用 3 2r a n 在r n a 出核转运、r n a 合成和加工中的作用 3 3r a n 在有丝分裂中的作用 3 4r a n 在有丝分裂后核组装中的作用 3 5r a n 在胁迫反应信号转导中的作用 4 r a n 在植物中的研究进展 4 1 模式植物拟南芥中r a j 7 、，基因的同源性 4 2 植物中r a n 的表达与功能 4 3 植物中r a n 相关蛋白的功能 结束语 植物防卫反廊中的单线氧发小g 蛋白r a n 文献综述( 第二章) 前言 小g 蛋白r a n 的功能及其在植物中的研究进展 小g 蛋白是一类单体蛋白，分子量较小，一般为2 1 3 0k d ，为与异三聚体g 蛋白 区别，通常称之为小g 蛋白。在真核细胞中，小g 蛋白参与调控信号转导、细胞增殖、 细胞骨架构成以及胞内跨膜物质运输等过程。通常这些调控过程都是通过结合或水解 g t p ，从而使小g 蛋白处于“激活”或“非活化”状态之间的转换来完成的。小g 蛋白这 超级家族至少可分为五个亚家族，分别为：r a s ，r h o ，r a b ，a r f 以及r a n ( b i s e h o f f 等1 9 9 9 ， t a k a i 等2 0 0 1 ) 。r a b ，a r f 和r a n 亚家族在真核细胞中高度保守，并且直接参与真核特 有的细胞过程( t a k a i 等2 0 0 1 ) 。r a s 和r h o 在酵母和动物体中已被证实为传递外界信 f i g u m lp h y e n e t i cs t a rd i a g r a m s o fs m a l lg t p a s e so f a , g & l l i a n a 一5c e r h - i s i a e a n d hs a p i e n su n m o t e , ds l a g d i a g r a m s o b t a i n e du s i n g t h 。p r o g r a m ，c 1 u s t a m t i t h o m p s o n da 1 1 9 9 4 ) - s e q u e n c e s ds m a l l g l p a s e s o b t a i n e d f r e m a t h e _ ：q u e n c e dg e n o m e s o f l h e t h r e e i r l c l i c a t e d o r g a n i s m s u s i n gb l a s t ( a i l x h u le la i 1 9 9 7 1s e q u e n c es i m i l a t i l y h e sa g a i n s t c h a r a c ( e t i z e d g t p a s e si ne a c h 。s a n i s m d i s t i n c t f a m i l i e s l r * ，r 曲tr h d ，m dr a mc o u l db e d i 5 t i n g u l s h e d ，e x c e p t f o r a r a b i d o * i si nu h i r hn oa p p a 煳tr a sg t p a s ef a m l f tc o u l dk i d e n t f l i e d 号的信号蛋白( b o s 等2 0 0 0 ) 。尽管r a s 在动物和很多低等真核生物的细胞信号转导中 堕塑堕里垦壁! 塑墨垡塑墨! ：里堑鱼垦竺 壅堂堡堕! 笙三皇! 起着重要作用，在植物拟南芥的基因组序列分析中，却没有发现r a s 同源家族。在植物 拟南芥基因组中，预测编码9 3 个小g 蛋白，包括r a b ，r h o ，a r f ：nr a n 四个亚家族，它 们参与调节从囊泡运输到激素信号转导的许多过程( v e m o u d 等2 0 0 3 ) 。 小g 蛋白r a n 是一种主要分布于细胞核内的蛋白质，分子量大约为2 5k d 。1 9 9 0 年 d r i v e r s 等首次在人畸胎c d n a 中发现了r a n 的开放阅读框，随后b i s c h o f f 等从海 拉细胞( h e l a 细胞，宫颈癌组织细胞) 中分离纯化到与有丝分裂抑制调节蛋白r c c l ( r c c l 其后证明为r a n 的鸟苷酸交换因子) 形成复合物的r a n 多肽分子，其分子量为2 5 k d ，是细胞中含量最丰富的小g 蛋白。分子结构分析表明，该蛋白属于原癌基因r a s 大家 族中的一员，因此得名r a n ( r a s - r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n ) ( b i s c h o f f 和p o n s t i n g l1 9 9 1 1 9 9 1 ) 。 1 r a n 的基本生化特点 r a n 具有所有小g 蛋白都具有的从i 至4 个保守的结构域，这4 个结构域的共有序 列从i 到i v 分别为g x x x x g k s ( d 、d x x g 、n ( t ) k x d 和e x s a x 。其中i 和i i 的序列为 g t p 酶的活性部位，i i i 、i v 为g d p g t p 的结合部位。r a n 的同源物存在于所有真核细 胞中，序列高度保守，然而迄今尚未在原核细胞中发现其同源物。酵母和哺乳动物中的 r a n 具有8 0 的同源性( m a t s u m o t o 等1 9 9 1 ) ，而鼠和人类的r a n9 5 以上甚至完全同 源( 已发现n 的r a n 有两个亚型) ( c o u t a v a s 等1 9 9 4 ) 。人类的r a n 分子含2 1 6 个氨基酸 与r a s 家族的其它成员r a s ，r h o ，r a c 和r a b 蛋白有3 0 的同源性。同r a s 家族的其它成 员一样，r a n 蛋白内在的g t p 水解矛t 1 g d p 交换活性很低( k l e b e 等19 9 5 ) 。 但是r a n 又具有一些不同于其它4 , g 蛋白的特点。首先，r a n 不经过r a s 家族其它 植物防卫反应中的单线氧及小g 蛋白r a n 文献综述( 第二章1 成员膜定位所必需的翻译后脂酰化修 布( 1 i p i dm o d i f i c a t i o n ) ，这一修饰作用是i 扫r a s 、 r h o 、r a c 及r a b 等r a s 家族蛋白的c 末端含有脂酰化修饰的特异信号和位点( 含半胱氨 酸残基的某一部位，女n r a bc y s 2x 2 c y s 或c y s 2 c y s ) 所决定的，而r a n 蛋白含有酸性c 末端( d e d d d l ) ，这一序列突出于r a l l 分子的球状结构表面( s c h e f 也e k 等1 9 9 5 ) ，因此 r a n 不附着在膜上，其活性的发挥也无需脂质参与。 其次，r a n 不象其g r a s 蛋白那样分布于膜上或胞浆中，而是主要分布在核内f 占8 0 ) ，尽管r a n 并不含有核定位信号( r e n 等1 9 9 3 ) 。 2 r a n 的活性调控 r a n 的调节蛋白能够增强核苷酸交换和水解的速率，使r a n 循环于g t p 结合态( 活 性态) 年i g d p 结合态( 非活性态) ，r a n g t p 循环主要受r a n 的鸟苷酸交换因子( r a n g e f ) r c c l ( r e g u l a t o r o fc h r o m o s o m e c o n d e n s a t i o n 1 ) 和g t p 酶激活蛋白g a p l ( g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n i ，酵母的同源物为r n a i ) 的调控。 r c c l 是位于间期细胞核内与染色体结合的4 5k d 的蛋白，酵母的同源物为 p r p 2 0 p ，r c c l p r p 2 0 p 能够5 0 万倍地提高鸟苷酸交换的速率( o h t s u b o 等1 9 8 9 ) ，使r a n i ：t ：t g d p 结合态转变g t p 结合态，这显然是形成核浆r a n g t p a s e 浓度梯度的主要原 因之一，因此r c c i 的在细胞核内的定位是r a n 参与核质问物质转运的必要条件，此 外，r c c l 还参与了细胞周期的调节。 r a n 的g a p l r n a l 是主要位于间期细胞胞浆的6 5 k d 的同源二聚蛋白，可以1 0 力 倍地提高r a n 的g t p 水解速率( m a t t m i s 等1 9 9 6 ) ，使r a n 由活性的g t p 结合态转变为 非活性的g d p 结合态。 此外，一种含量丰富的具有r a n 结合域( r a n b d ) 的胞浆蛋白一r a n 结合蛋白( r a n 9 植物防 反应中的单线氧及小g 蛋白r a n 文献综述( 第一二章) b i n d i n gp r o t e i n ，r a n b p ) 也参与t r a n 活性的调节，哺乳动物有两类r a n b p ：r a n b p l 平i l n u p 3 5 8 ( 也i n r a n b p 2 ) ( f l o e r 等1 9 9 6 ) 。r a n b p l 具有1 个r a n b d ，n u p 3 5 8 具有 4 个r a n b d ，这些区域是含1 3 5 个氨基酸残基的高度保守区，具有与r a n g t p 结合态的高 亲和力，使r a n b p - 与r a n g t p 和进核因子( i m p o r t i n ) 形成三聚体( y o k y a m a 等1 9 9 5 ) 。 另外，r a nb p 可以通过促进r a n g a p 的水解作用，或者也可能通过抑带i r c c l 的活性而 加速r a n g t p 水解( b i s c h o f f 等1 9 9 5 ) 。 3 r a n 的功能 r a n 在核质f 刚物质运输、有丝分裂中纺锤体的形成以及核膜的安装方面起着重要作 用( c a r a z o s a l a s 等1 9 9 9 ，z h a n g 等1 9 9 9 ，h e t z e r 等2 0 0 0 ，q u i m b y 和d a s s o2 0 0 3 ) 。 与其他的小g 蛋白一样，r a n 以g t p 和g d p 两种结合方式存在( a v i s 和c l a r k e1 9 9 6 ) 。r a n 本身内在的g t p 酶活性很低，但它能够被r a n 的g t p 酶活化蛋白( r a n g a p ) 以及结合蛋 白( r a n b p l ) 强烈活化( m a t u n i s 等1 9 9 6 ) 。r a n 的鸟昔酸交换因子r c c l 负责r a n 与g t p 的结合。r a n g d p 和r a n g t p 的比例通过核外的r a n g a p 和r a n b p 与核内的r c c l 的比例 柬调节( g o r l i c h 和m a t t a j1 9 9 6 ) 。 在动物体中，r a n 和它的调控因子r a n b p s 、r c c l 以及r a n g a p 在整个细胞周期中 调控细胞核的步骤起着重要作用( c l a r k e 和z h a n g2 0 0 1 ) 。r a n 结合或水解g t p 与物质 入核或出核密切关联。 3 1r a n 在核质问物质转运中的作用 在间期细胞中，r a n 蛋白指挥着核质间物质的转运。人们对核质间物质转运进行了 广泛的研究，并且已经建立了一个相对被普遍接受的关于r a n 在核质问物质转运中作用 的模型，如图2 。简单来说，r a n 在核质问物质转运中行使作用的前提就是r a n g t p 和 植物防卫反应中的单线氧及小g 蛋白r a n文献综述( 第一二章) r a n g d p 分别不对称地分布在核内和胞质内( i z a u r r a l d e 等1 9 9 7 ) 。不论是转入受体还 是运出受体都与r a n g r i p 结合，而在出核时都与r a n g d p 相联系。在核内，运出受体 与运载物结合，并与r a n g t