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微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基冈克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 摘要 木聚糖是自然界存在的可再生的一种植物成分。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡 糖，在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木聚糖酶及木聚糖酶基因的研 究是当前酶学研究热点之一。目前主要集中在高产菌株的选育及木聚糖酶基因的克隆和表 达研究上。本研究对黑曲霉m c 0 6 2 的木聚糖酶基因进行了克隆与酿酒酵母表达。主要研 究结果如下： 从真菌黑曲霉中提取m r n a 合成c d n a 的第一条链，用p c r 方法扩增得到一个编码 e n d o 一 3 - 1 ，4 x y l a n a s e 的基因x y n 7 。利用简便的r t - p c r 方法克隆的木聚糖酶基因属于 g 1l 家族。该e d n a 序列与南非和波兰科学家克隆到的序列非常相似。 e d n a 片段的核酸序列含有一个6 3 l b p 的开放阅读框，编码2 1 0 个氨基酸残基。来源 于黑曲霉的编码木聚糖酶基因x y n 7 被克隆并在酿酒酵母i n v s c l 中表达。x y n 7 基因构 建在多拷贝穿梭载体p y e s 6 c t 上，在g a l i 启动子和c y c l 转录终止信号的控制下成功 在酿酒酵母中表达。半乳糖诱导2 4 h 时重组蛋白的表达量最大，酶活可达6 2 5 i u m l 。 酿酒酵母i n v s c l 中高效表达的重组酶最适温度为5 5 ，可有效地结合并水解可溶性 木聚糖。该木聚糖酶对硬木和谷物类木聚塘均有高水解活性。最适p h 为3 5 ，但在很宽的 p h 范围内都有活性。酶可被c 0 2 + 完全抑制，浓度为1 0m m lf e 3 + ，z n 2 + 和m 9 2 + 可对酶产生 较强的抑制( 残余的活性分别为3 1 9 9 6 ，4 1 2 和5 1 4 ) ，m i l 2 + 能产生弱的激活作用。s d s 是酶的强抑制剂。反应混合液中添加抗坏血酸可对酶产生极大激活作用。 关键词：木聚糖酶，p t p c r ，基因克隆，高效表达，酿酒酵母 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fa s p e r g i l l u sn i g e r x y l a n a s eg e n ei nt h ey e a s ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s u p e r v i s o r ：p r o f j i ax i n c h e n g m a s t e rc a n d i d a t e ：l i uy i n a b s t r a c tx y l a ni so n ek i n di n g r e d i e n to fp l a n tt h a tc a nb er e c y c l e di nt h e n a t u r e t h ex y l a n a s ec a nd e g r a d et h ex y l a nt ob e c o m et h ex y l o s eo rt h eo l i g o x y l o s e i th a st h ew i d e s p r e a du s ei nt h ef e e d ，t h ep a p e r m a k i n g ，f o o da sw e l la si nt h ee n e r g y i n d u s t r y t h er e s e a r c ho fx y l a n a s ea n dt h ex y l a n a s eg e n ei so n e h o ts p o t si nt h ef i e l d o fc u r r e n te n z y m o l o g y a tp r e s e n tm a i n l yc o n c e n t r a t e si nt h eh i g hp r o d u c t i o ns t r a i n s e l e c t i v eb r e e d i n ga n di nt h er e s e a r c ho fx y l a n a s eg e n ec l o n ea n de x p r e s s i o n t h i s r e s e a r c hh a sb e e nb a s e du p o na s p e r g i l l u sn i g e rm c 0 6 2 ，c l o n i n ga n dt h ee x p r e s s i o n o f x y l a n a s eg e n e m a i nf i n d i n g sa sf o l l o w s ： t h ex y n 7g e n ee n c o d i n ge n d o p l ，4 一x y l a n a s ew a sa m p l i f i e db yp c rf r o m f i r s t s t r a n de d n as y n t h e s i z e do nm r n ai s o l a t e df r o ma s p e r g i l l u sn i g e rm c 0 6 2 u s i n gr t p c rm e t h o d ，w ec l o n e dt h eg e n ef o ra ng 1lx y l a n a s ef r o ma s p e r g i l l u s n i g e r t h ee d n as e q u e n c ew a sv e r ys i m i l a rt o t h es e q u e n c ew h i c hc l o n e db y s c i e n t i s t sc o m ef r o ms o u t ha f r i c aa n dp o l a n d t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h ee d n a f r a g m e n tw a sv e r i f i e dt oc o n t a i na6 3 1b po p e nr e a d i n gf r a m et h a te n c o d e sa210 a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ex y n 7g e n ee n c o d i n gax y l a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rh a sb e e nc l o n e da n d e x p r e s s e di ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e i n v s c1 t h ex y n 7g e n e ，l o c a t e do n m u l t i c o p y s h u t t l ev e c t o r sp y e s 6 c t ，w a ss u c c e s s f u l l y e x p r e s s e di n t h ey e a s t s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eu n d e rt h ec o n t r o lo ft h eg a l ip r o m o t e ra n dc y c 1 t r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t i o ns i g n a l ，r e s p e c t i v e l y 2 4h o u r sa f t e rg a l a c t o s ei n d u c t i o n ， t h et o pe x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nh a sf u l l f i l e d ，x y l a n a s ea c t i v i t yw a s 6 2 5 i u m l t h ee n z y m ef o l l o w i n go v e r - e x p r e s s i o ni ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei n v s c l p r o d u c e da nr e c o m b i n a n te n z y m ew i t hat e m p e r a t u r eo p t i m u mo f 5 5 w h i c hc a n e f f i c i e n t l yb i n da n dh y d r o l y s ei n s o l u b l ex y l a n ，a n dt h i sx y l a n a s es h o w e dh i g ha c t i v i t y o nx y l a n sf r o mh a r d w o o d sa n dc e r e a l s t h ep ho p t i m u mo ft h ee n z y m ei s3 5 ，b u ti t i sa c t i v eo v e rab r o a dp hr a n g e m e t a l i o n sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f10m ma n d2m mo nx y l a n a s ea c t i v i t yw a s a l s od e t e r m i n e d t h ee n z y m ew a sc o m p l e t e l yi n h i b i t e db yc 0 2 + ，w h i l es t r o n g i n h i b i t i o nw a sc a u s e db yf e 3 + ，z n 2 + ，a n dm 9 2 + a th i g hc o n c e n t r a t i o no f10m m ( 31 9 ，41 2 ，a n d51 4 r e s i d u a la c t i v i t y ，r e s p e c t i v e l y ) m n 2 + p r o d u c e das m a l l s t i m u l a t i n ge f f e c t s d sw e r es t r o n gi n h i b i t o r so f t h ee n z y m ea c t i v i t y ，e i t h e ra t2a n d 10m m ae x t r e m ea c t i v a t i o nw i l lb e e ns a ww h e na s c o r b i ca c i dw a sb ea d d e dt ot h e r e a c t i o nm i x t u r e 微牛物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 k e yw o r d s ：x y l a n a s e ，r t p c r ，g e n ec l o n i n g ，o v e r e x p r e s s i n g ，s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 2 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 黑曲霉木聚糖酶基因的克隆及在酿酒酵 学位 硕士 文题目 级别 母中的表达 学 学生刘寅科 微生物学 导师 贾新成 姓名专姓名 业 学位论文 是否保密 是如需保密，解密时间2 0 0 7 年1 2 月3 1 日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 ， 研究生签名：幻l 臻导师签名：刁八一八。 日期：1 0 06 年f 月f 日 日期：6 年多月，j 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同力式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 、f 【，十拳簖右否刚吾士h 相志的沣缝害仵 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 勺r 守孓 研究生签名：函】宦 导师签名：暗锄八7 学院领导签名： 印建 久 。 日期：1 口o 年月ff 日 日期：，。彳年多月，日 日期：年月日 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 致谢 本文是在我的导师贾新成教授、张世敏老师的悉心指导下完成 的。除了在选题、查阅文献、实验技术、论文写作等多方面的具体指 导外，导师认真严谨、一丝不苟的治学精神使我受益非浅。 在实验过程中，吴建字教授、吴坤教授、邱立友教授、陈红歌副 教授、宋安东副教授就实验中出现的问题提出过不少建议。赵柏叶老 师、胡渝老师、赵玉萍老师、为实验的顺利进行提供了诸多便利。 从实验的开始到结束，和同学的互相合作，使实验工作顺利进行， 同时也和他们建立了深厚的友谊。任艳丽、赵玮莉师姐在实验初始阶 段给予很大帮助。史军伟、柴焕娜、王妍同学也在试验中做了不少的 工作。在和孙连海、李林珂、刘亚锋、康青浦、崔锦等同学三年的共 同学习和实验室工作中，得到他们很多的帮助。在此谨向关心和帮助 我的老师和同学表示衷心的感谢。 最后，谨将我的论文献给我的父母、师长和朋友。在我三年求学 生涯中，是他们无私的鼓励和支持使我顺利完成了学业，是他们帮助 我克服了许多困难。 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 1 文献综述 木聚糖是复杂的低分子质量的多糖，由1 3 d 木糖残基通过1 3 1 ，4 键连接成的主链和 携带的各种取代基组成。其侧链随来源不同各异( j o s e l e a ue ta 1 ，1 9 9 2 【l 】) 。完全降解这种 复杂的结构需要几种酶的作用，其中在解聚作用过程中至关重要的是内切1 3 1 ，4 木聚糖 酶 2 1 。内切1 3 1 ，4 木聚糖酶( 简称木聚糖酶 e c 3 2 1 8 ) 是真菌和细菌产生水解木聚糖 的糖苷酶 ( b i e l y ，1 9 8 9 【习) 。 1 3 木聚糖酶水解木聚糖主链内的1 3 1 , 4 糖苷键产生不同长度的木寡糖短链。大多数木 聚糖酶属于糖苷水解酶第l o 和第1 1 家族( h e n r i s s a ta n db a i r o c h ，1 9 9 3 4 1 ) 。第1 0 家族的木 聚糖酶被认为是可以消化天然的支链木聚糖生产低分子量的木寡糖的直接参与者( b i e l ye t a l ，1 9 9 3 5 1 ) 【6 】。木聚糖酶之所以在近十年内引起了人们更多的注意，是因为它们在工业上 潜在的应用价值，木聚糖酶主要应用于纸浆和造纸企业m 及食品工业【钔。如在牛皮纸浆漂 白中，应用酶前处理工艺可以使木质素的提取变得更容易，同时保留纤维素成分【2 】。这样 使得在随后的工艺中可以减少氯的浓度，降低可吸收有机卤素的水平，达到即环保又经济 的目的。木聚糖酶具有重要的商业价值，可应用于饲料工业、造纸工业和食品工业 ( c o u g h l a ne ta 1 ，1 9 9 2 1 9 ，1 9 9 3 1 0 】) 。 1 1 木聚糖酶概况 基于氨基酸序列和疏水簇分析，木聚糖酶在糖苷水解酶中被分成家族1 0 和家族ll 两 个家族( h e n r i s s a ta n db a i r o c h ，1 9 9 3 【4 】) 。家族1 0 包含高分子质量( 3 0 k d a ) 、酸性p i 值的 木聚糖酶( 和部分纤维素酶) 。有五种家族1 0 的木聚糖酶的三维结构已经明确，是( a 8 ) 8 的桶形折叠( d e r e w e n d a e ta l ，1 9 9 4 1 ) 。家族1 l 含有低分子质量( 小于或等于3 0 k d a 、 通常表现出碱性p i 值的木聚糖酶( 除一些真菌来源的木聚糖酶显示出酸性p i 值外) 。八 种家族1 l 的木聚糖酶的三维结构是一种“三明治”形状的折叠结构，包括一个q 螺旋和 两个1 3 片层，形成一个巨大的裂缝来容纳木聚糖多聚体( t 6 r r 6 n e ne ta l ，1 9 9 4 1 2 1 ) 1 2 。 系统发育树显示家族ll 木聚糖酶又分为6 个主要的亚群：真菌( b ，c ，d ) ，g + 细 菌( a ，e ) 和g 细菌( f ) 1 2 。 亚群a 包含由放线菌科和芽孢杆菌科家族、所有的严格好氧的g + 细菌所产生的酶。 唯一例外的是产自a c a r l a 的酶，它是弧菌科的一种g 。的兼性好氧细菌。这些酶联系紧密 并可能来自同一个原始基因：它们中的决大多数只有一个催化结构域。但是，s 1 i v i d a n s x l n b ( s h a r e c ke ta l 。1 9 9 1 1 3 1 ) ，t f u s c a ( i r w i ne ta l ，1 9 9 4 1 4 1 ) ，s t h e r m o v i o l a c e u s ( t s u j i b oe t a l 。1 9 9 7 1 1 5 1 ) ，c f i m i ( m i l l w a r d s a d l e re ta l ，1 9 9 4 t 1 6 】) 的蛋白质含有额外的木聚糖结合域或纤 维素结合域或二者皆有。 来自真菌的酶构成了b ，c ，d 亚群。亚群b 和c 的酶( 2 0 k d a ) 来自a s c o m y c e t a 和 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿洒酵母中表达的刘寅 b a s i d i o m y c e t a 亚群c 的酶显现出碱性p i 和典型的e g y ( 1 7 7 1 7 9 ) 组合。而亚群b 则显 示酸性p i ，在相应的位置有e x x 体。 亚群d 的木聚糖酶产自厌氧真菌，它们与亚群b 和c 的关联不强烈。这些3 0 - - 6 5 k d a 的蛋白质通常有非催化结构域( 1 0 4 5 k d a ) 。但是也有例外，例如f s u c c i n o g e n e s ，一种 来自b a c t e r o i d a c e a e 家族的g 厌氧细菌，产生一种双功能酶有两个催化结构域，也属于这 一亚群。 亚群e 的酶由严格厌氧g + 细菌产生，通常来自c l o s t r i d i a c e a e 家族，生活在瘤胃中。 这些高分子量的酶( 5 0 1 0 0 k d a ) 具有多个非催化结构域。来自好氧g + 细菌b p u m i l u s 的 木聚糖酶x y n a ( f u k u s a k ie ta l ，1 9 8 4 【1 7 1 ) 也位于这个亚群中。 亚群f 包含分别来自p f l u o r e s c e n s 和c m i x t u s 的x y l e 、x y l a ( 6 6k d a ) 的木聚糖酶。 1 2 微生物木聚糖酶的多态性 由于自然界中木聚糖结构不均一性，从而导致微生物木聚糖酶系统的多态性，使得各 种木聚糖酶具有各自特异性的功能，这可能是微生物高效利用木聚糖的一种策略。 许多微生物木聚糖酶存在多态性( d e l ( 1 ( e r ，e ta 1 ，1 9 7 9 【1 8 】；w o n ge ta 1 ，1 9 8 8 t 1 9 1 ) 。在黑 曲霉印n i g e r ) ll 中就发现有5 种不同特性不同的木聚糖酶( j o l l l le ta 1 ，1 9 7 9 1 2 0 1 ) ；在粪堆梭菌 ( c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m ) ，链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 3 1 3 7 ，脱叶链霉菌( s t r e p t o m y c e s e x f o l i a t u m ) m c1 ，木霉( zh a r z i a n u m ) e 5 8 ，里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) q m 9 41 ，气单 菌( a e r o m o n a ss p ) 2 1 2 ( o h k o s h ie ta 1 ，1 9 8 5 【2 1 1 ) ，微紫青( p e n i c i l l i u mj a n t h i n e l l u m ) ( t a k e n i s h ie ta 1 ，1 9 7 3 【2 2 】) 和t a l a r o m y c e sb y s s o c h l a m y d o i d e sy h 5 0 ( y o s h i k ae ta 1 ，1 9 8 1 t 2 3 】 c 2 4 j ) 等微生物中发现都至少有3 种以上木聚糖酶存在。有关木聚糖酶的多态性范围尚需进一 步研究。 1 3 木聚糖酶分子的结构区域 不同微生物产生的木聚糖酶的结构和性质上有很大的差别。木聚糖酶有的只含有单一 区域即催化区，也有一的同时具备催化区和多种非催化区。多区域木聚糖酶分子结构中含 有催化区( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 、纤维素结合区( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖 结合区( x y l a n b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 、连接序y u ( l i n k e rs e q u e n c e ) 、重复序y l j ( r e p e a t e d s e q u e n c e ) 、热稳定l 叉( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ) 及其它未知功能的非催化区等。这些区 域担负着不同的生理功能。不同微生物所包含的区域差别较大。有的仅具有其中的一种或 几种，有的则包含以上所有区域( 刘瑞田掣2 5 1 ，1 9 9 8 ；g i l k e se ta 1 ，1 9 9 1 t 2 6 1 ) 。 木聚糖酶的催化区承担着酶的水解特性，并作为该酶分类的基础。木聚糖酶的氨基酸 组成在数量上变化很大，但其催化区在大小上都趋向一致。在催化区特定位置的谷氨酸和 天冬氨酸对催化特性是非常关键的。到目前为止，有六种第1 0 家族木聚糖酶的催化区取 得了高清晰度的x r a y 结构( z u ie t a 1 ，2 0 0 0 唧；z u ie t a 1 ，1 9 9 7 【2 8 】) 。 根据氨基酸序列的同源性，木聚糖酶及纤维素酶的底物结合区可分为1 0 种以上类型 2 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿洒酵母中表达的刘寅 纤维素结合区( c b d ) ，一些木聚糖酶的底物结合区对木聚糖有特异性，所以又称之为木聚 糖结合区( x b d ) ( s c h m i d t e ta 1 ，1 9 9 9 2 9 1 ) ，一般这些底物结合区并不影响酶的催化活性， 但对不溶性底物有着特殊作用。如s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i v i d i se 8 6 中的f x y n 酶，它包 含有催化区域及x b d ，在天然状态下，它既能分解可溶性木聚糖，也能分解不溶性木聚糖， 而如果人工除去x b d ，它就不能降解不溶性木聚糖，但不会影响对可溶性木聚糖的降解效 率。所以x b d 对降解不溶性底物是必不可少的( z u ie t a 1 ，2 0 0 0 【2 刀) 。 木聚糖酶分子中的各功能区域是由连接序列相连，此序列的长度变化很大，一般为 6 5 9 个氨基酸( b l a c ke ta 1 ，1 9 9 4 t 3 0 1 ) 。该序列中或含有较多的丝氨酸残基，或含有较多的脯 氨酸残基，不同来源木聚糖酶的连接序列之间同源性一般不高，这些连接序列将不同的功 能区域连接起来，形成柔韧可伸展的绞链区。 另外，在某些微生物中有某些区段可增加相应酶的最适作用温度，可称为热稳定区 ( f o n t e se ta 1 ，1 9 9 5 t 3 1 】；s a u le ta 1 ，1 9 9 5t 3 2 1 ) 。这方面的报道还不算太多，有待更多研究证实。 1 4 木聚糖酶基因克隆 到目前为止，国内外已有3 0 0 余种不同来源的木聚糖酶基因的报道，其中1 0 0 多种基 因被克隆和表达在合适的宿主中，研究较多的是细菌的木聚糖基因，近几年研究真菌木聚 糖酶基因的有上升趋势。 1 4 1 细菌木聚糖酶基因克隆 i t o 3 3 1 等从p a e n i b a c i l l u ss p w 6 1 菌株克隆到一种多结构功能域的木聚糖酶x y n 5 并在 e c o l i 中表达，它定位于细胞的表面，分子质量为1 4 0 k d a ，x y n 5 编码1 3 2 6 个氨基酸残基， 包括2 7 个氨基酸的信号肽序列。序列分析表明x y n 5 包含两个家族2 2 的碳水化合物结合 单元( c b m ) ，一个家族1 0 的糖苷水解酶催化结构域，一个家族9 的c b m 和其它结构 域【3 3 1 。 有证据显示出厌氧细菌能合成高水平的周质木聚糖酶，它参与水解产生一些小的木寡 糖，小的木寡糖可被微生物吸收。一种腐生的需氧土壤微生物c e l l v i b r i om i x t u s 具有很高的 降解植物细胞壁的活力。构建于入z a p i i 的c e l l v i b r i om i x t u s 的基因组文库。一个插入基因 组核苷酸序列的木聚糖酶阳性克隆，在e c o l i 中表达胞内木聚糖酶。显示一个l1 3 7 b p 的开 放阅读框，编码的多肽推导分子量为4 3 4 1 3 d a ，定义为木聚糖酶c ( x y l c ) 。纯化到的重 组x y l c 分子质量为4 1 k d a ，显示出典型的家族1 0 多糖酶的生化特性。与以前描述的木聚 糖酶不同的是，x y l c 对胰腺蛋白酶的蛋白水解灭活极敏感【川。 b a c i l l u sc i r c u l a n st e r i 4 2 的木聚糖酶被克隆进厦s u b t i l i s 和ec o l i ，b s u b t i l i s ( p b a 7 ) 中的酶活比e c o l i ( p a q 4 ) 高8 7 。克隆b s u b t i l i s ( p b a 7 ) 分泌的胞外酶活约为l1 2 0u ( 占总酶活的8 0 ) ，克隆ec o l i ( p a q 4 ) 分泌的胞外酶活约为7 9u ( 占总酶活的8 8 ) 。 克隆b s u b t i l i s ( p b a 7 ) 的酶最适p h 为7 0 ，最适温度为5 0 ，与b a c i l l u sc i r c u l a n st e f i - 4 2 产生的木聚糖酶相同。但重组的木聚糖酶在高温下更稳定。纯化来自克隆b s u b t i l i s ( p b a 7 ) 3 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 的木聚糖酶，得到7 1 k d a 的多肽，这与b a c i l l u sc i r c u l a n st e r i - 4 2 的相似p 引。 两个来自嗜碱b c i l l u s f i r m u s 的编码热稳定的木聚糖酶的基因x y n l 0 a 和x y n l1 a ，被克 隆并在e c o l i 中表达。含有任一基因的e c o l i 在刚果红平板上会显示透明圈。x y n l 0 a 和 x y n l1 a 的分子质量分别是4 5k d a 和2 3 k d a ，在酶谱上都表现活性。x y n l 0 a 编码3 9 6 个 氨基酸残基，与来自嗜碱b c i l l u sh a l o d u r a n s 的一种嗜碱木聚糖酶非常相似。x y n li a 编码 2 1 0 个氨基酸残基，而且仅有一个氨基酸与来自b c i l l u sh a l o d u r a n s 的一种内切一b l ，4 木 聚糖酶不同。通过与其它的木聚糖酶的氨基酸序列的比较，得出x y n l 0 a 和x y n l1 a 分别 属于糖苷水解酶的第l o 和第1 1 家族。在3 7 。c 下，它们在p h 4 0 l1 0 的范围都表现活性， 7 0 时可保持8 0 以上的活性，在6 2 预保温1 6 h 仍保持7 0 以上的活性1 3 6 。 近年从细菌中克隆到的木聚糖基因有g a s p a r i ea 等通过构建基因组文库从p r e v o t e l l a r u m i n i c d l ab 1 4 克隆到了木聚糖酶基因【3 7 1 ，c o n n e r t o ni 3 s 1 等从嗜热的b a c i l l u ss t r a i nd 3 中克 隆到木聚糖酶基因并在ec o l i 中表达，来自a e r o m o n a s c a v i a e 的x y n a ( s u z u k i t 等，2 0 0 2 ) ， 来自b a c i l l u ss p b p 7 的x y n a 基 ( g a l l a r d oo 等，2 0 0 4 1 3 9 1 ) ，来自b a c i l l u s f i r m u s 的x y n l1 a 基因( c h a n gp 等，2 0 0 4 1 3 6 1 ) 。从b c a i l l u sa g a r a d h a e r e n s ，c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m ，b c a i l l u s c i r c u l a n s ，b c a i l l u sf i r m u s ，b c a i l l u sh a l o d u r a n s ，b c a i l l u sp u m i l u s 等克隆到了许多木聚糖酶 基因。 1 4 2 放线菌木聚糖酶基因克隆 利用简单长距离反向p c r 方法，k u n o 等 4 0 l 从s t r e p t o m y c eo l i v a c e o v i r i d i se 8 6 克隆到 了一个富含g c ( 6 8 ) 的属于家族i o f 的木聚糖酶基因f x y n 。该基因的开放阅读框大小 为1 4 3l b p ，编码4 7 7 个的氨基酸残基。f x y n 有两个功能域，一个是催化域，一个是底物 结合域。独一无二的三重复序列( c l d c ) 位于底物结合域，这与x y na 的木聚糖结合域 以及来自s 1 i v i d a n s 的呋喃阿拉伯糖苷酶b 相似。它在ec o l i 中高效表达并在f x y n 的c 末端加上6 个组氨酸残基的标签。ec o l i 中表达的f x y n 与s t r e p t o m y c eo l i v a c e o v i r i d i s 产 生的天然木聚糖酶具有相同的特性。此外，f x y n 的木聚糖结合域能极大地提高水解不溶 性木聚糖的能力，但它对可溶性木聚糖的水解没有多大的作用。 h e r n a n d e za 等2 0 01 年从s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s 克隆了基因x y l 2 3 ( a f1218 6 4 ) 。 编码的蛋白质的n 末端与木聚糖酶家族f 相似，c 末端与s t r e p t o m y c e sl i v i d a n sa b f b 相似。 t s u j i b oh 等【1 5 1 从s t r e p t o m y c e st h e r m o v i o l a c e u so p c 5 2 0 中克隆了编码木聚糖酶基因 ( s t x i ，g 号d 8 5 8 9 6 ) 及乙酰木聚糖酯酶。v a t s m e h t as 等从s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s6 6 克 隆到了第二个编码木聚糖酶的基因【4 1 1 ，从c h a i n a l 4 2 1 和s t r e p t o m y c e s f l a v o g r i s e u s l 4 3 中也克隆 到了木聚糖酶基因。 1 4 3 真菌木聚糖酶基因克隆 近几年，许多来自真菌的木聚糖酶基因被克隆。k i n o s h i t ak 等从a s p e r g i l l u sn i g e r 中 克隆到了编码木聚糖酶b 的基因x y n n b ，并在a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 中表达 4 4 】。h a a sh 等 4 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母巾表达的刘寅 从p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 中克隆了x y l p 基因，该基因长1 6 k b 。通过基因组克隆与c d n a 克隆进行比较，发现该基因有1 0 个外显子，9 个内含子1 4 5 1 。推导出的氨基酸序列的n 末 端有个典型的含2 3 个氨基酸残基的信号肽。经n o t h e m 杂交分析发现当有木聚糖诱导 的情况下，x y l p 可编码产生一个1 3 k b 的转录体。 其它有有丝状真菌a s p e r g i h u sa c u l e a t u s 的木聚糖酶基因被克隆且在a s p e r g i l l u so r y z a e 中表达【4 6 1 ，c o c h l i o b o l u sc a r b o n u m 的x y l 2 和x y l 3 基因的克隆及表达 4 7 1 ，t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s 的热稳定性木聚糖酶基因x y n a ( s c h l a c h e r a 等，1 9 9 6 t 4 s ) ，c o c h i o b o l u ss p i c i f e r 的公认的p 木聚糖酶x y n li b 基因的不完全克隆【4 9 】，导致水稻枯萎的真菌m a g n a p o r t h e g r i s e a 与致病性有关的基因x y l 4 的克隆( w us - - c 等，2 0 0 2 ) 等。 1 4 4 其它木聚糖酶基因克隆 d e v i l l a r d 等于1 9 9 9 年首次报道了来自原生动物的参与植物细胞壁多糖降解的酶的克 隆和定性。来自瘤胃的原生动物p o l y p l a s t r o nm u l t i v e s i c u l a t u m 构建c d n a 文库，编码的酶 属于糖苷水解酶家族ll 。系统发育树显示出相比于其它的纤维素分解真菌厌氧真菌，它 与g + 细菌的催化结构域有更紧密的关系【5 0 1 。 s u z u k i 等从a r a b i d o p s i st h a l i a n a 中分离得到的c d n a 克隆r x f l 2 编码一种木聚糖酶 ( e c3 2 1 8 ) ，蛋白质c 末端的一半的氨基酸序列命名为a t x y n l ，与大麦木聚糖酶的催化 结构域相似。分析表明转基因的a r a b i d o p s i st h a l i a n a 表达外泌的与增强绿色荧光蛋白融合 的a t x y n l ，木聚糖酶活是野生型的2 倍。资料表明a t x y n i 参与脉管细胞的次级细胞壁的 新陈代谢，a t h a l i a n a 的基因组中有四种公认的木聚糖酶。对五种木聚糖酶的氨基酸序列 进行比较，其结论可能暗示它们的分子进化过程 s z 】。 1 5 木聚糖酶基因表达 1 5 1木聚糖酶基因在原核生物中的表达 自从1 9 8 3 年，p a n b a n g r e d 等科学家首次利用大肠杆菌表达短小芽抱杆菌( b a c i l l u s p u r n i l u si o p ) p 一木聚糖酶以来( p a n b a n g r e de ta 1 ，1 9 8 3 5 2 1 ) ，已有数十种不同来源的木聚糖 酶基因在原核生物表达系统中实现了表达。表中列举了近几年部分在原核生物( 主要是大 肠杆菌) 中的表达中表达的木聚糖酶基因。 表1 1 近年部分在大肠杆菌中表达的木聚糖酶基因 t a b l e1 1e x p r e s s i o no fx y l a n a s eg e n e si ne c o l i 来源菌株宿主菌载体参考文献 e s c h e r i c h i ac o l ix l i b l u e j 正 b a c i l l u sc o a g u l a n ss t - 6l a c t o c o c c u sl a c t i s p m g 3 6 e e c o l is t r a i nb l 21 p e t 2 8 b 5 r a h a are t a 1 ，2 0 0 6 5 3 1 k a v o o s i me t a 1 2 0 0 4 5 4 】 微生物学硕士论文黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在酿酒酵母中表达的刘寅 s t r e p t o m y c e s d l i v a c e o v i r i d i sa 1 e c o l ib l 21 p e t 2 2 ( + ) 张红莲等2 0 0 3 5 5 1 b a c i l l u sl y t i c u s e c o l i b a c i l l u ss u b t i l i s p h b 2 0 1 p i c h i as t i p i t i sn r r l y 一115 4 3e c o l idh5alphafpuci9 s t r e p t o m y c e s t h e r m o v i o l a c e u sec o l ij ml0 9 v r b r i os p s t r a i nx y - 214e c o l id h 50 1 s r i v a s t a v ae ta ， 2 0 0 1 1 5 6 1 b a s a r a ne ta 1 ， 2 0 0 1 1 5 7 】 t s u j i b oe ta 1 ， p u c l 9 ，p u c l 8 ，m 1 2 0 0 1 5 8 1 p b i u e s c r i p ti i k s ( 一) t o s h i y o s h ie ta 1 ， 2 0 0 0 t 5 9 1 1 5 2 木聚糖酶基因在真核生物中的表达 目前，在真核基因的表达系统中应用最普遍的是酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、 动物乳腺表达系统、丝状真菌外源表达系统、植物基因表达系统以及t 7 r n a 聚合酶一书1 0 启动子偶联表达系统等。迄今为止，已有十多种不同来源的木聚糖酶在酵母中得到了高效 表达。表中列举了近几年部分在真核生物( 主要是酵母) 中的表达中表达的木聚糖酶基因。 表1 2 近年部分在酵母中表达的木聚糖酶基因 t a b l e1 2e x p r e s s i o no fx y l a n a s eg e n e si ny e a s t 来源菌株宿主菌载体参考文献 s c y t a l i d i u ma c i d o p h i l u m p i c h i ap a s t o r i s p p i c z a l p h a a a ib a l a abe ta 1 ，2 0 0 6 t 6 0 】 a s p e r g i l l u st e r r e u s ( b c c1 2 9 )p p i c z a l p h a ac h a n t a s i n g hd 甜甜。2 0 0 6 【6 l 】 t r i c h o d e r m ar e e s e i s c h i z o s a c c h a r o m y c e s q m 9 4 1 4p o m b ep t l o k a d ahe ta 。1 9 9 9 【6 2