（微生物学专业论文）酵母甘油合成关键酶基因在大肠杆菌中的表达研究.pdf

摘要 摘要 酵母中普遍存在葡萄糖到甘油代谢途径，对酿酒酵母的研究表明，葡萄糖分解生成 磷酸二羟丙酮( d h a p ) ，d h a p 在关键酶n a d + 依赖性3 磷酸甘油脱氢酶( g p d ) 催化下 还原为3 一磷酸甘油。3 磷酸甘油在3 磷酸甘油酯酶( g p p ) 的作用下脱磷酸根而形成甘油。 这两个酶分别有两个同工酶，其中g p d l 和g p p 2 受渗透压诱导高表达。 产甘油假丝酵母w l 2 0 0 2 5 具有耐高渗且高产甘油的特性，本课题组已通过染色体 步移法首次成功克隆了来源于产甘油假丝酵母的胞浆3 磷酸甘油脱氢酶编码基因 c g g p d l ，通过基因序列比对，发现该基因是全新的基因，有关该酶的酶学性质的研究未 见报道，为了能更好的解释该酶在高渗条件下保持高酶活和产甘油假丝酵母的耐高渗甘 油合成的代谢机理，因此对该酶的酶学性质的研究显得十分迫切。 在前期研究的基础上，首先，本课题以产甘油假丝酵母基因组d n a 为模板，扩增 得到3 磷酸甘油脱氢酶编码基因c g g p d l ，将其克隆到大肠杆菌表达载体p e t 一2 8 a ( + ) 上， 在e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中诱导表达，利用表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 上的6 h i s t a g 标记选用n i 2 + 柱纯化具有表达活性的3 磷酸甘油脱氢酶( c g g p d l ) ，纯化后比酶活达到15 2 6 m u m g ， 并初步研究了该酶的酶学性质并与酿酒酵母3 磷酸甘油脱氢酶s c g p d l 的酶学性质进行 了比较。研究发现：两种蛋白分子量大小基本相同，c g g p d l 的最适p h 为6 2 ，而s e g p d l 为6 8 ；c g g p d l 在p h 3 5 7 5 范围内稳定性良好，s c g p d l 在p h 4 5 6 2 范围内稳定； c g g p d l 最适温度为2 5 ，s c g p d l 为3 7 ；二者均在2 0 表现出很好的稳定性； c g g p d l 受m 9 2 + 激活明显，受z n 2 + 完全抑制，进一步通过在产甘油假丝酵母发酵培养 基中单独添加这两种离子来指导甘油发酵，s c g p d l 同样受m g + 激活，受z n 2 + 完全抑制； 以d h a p 为底物c g g p d l 的k m 值为0 5 5 m m o l l ，v m a x 为1 0 6 u m o l ( m g m i n ) ，s c g p d l 的k m 值为o 7 5 m m o l l ，v m a x 为0 5 l u m o l ( m g m i n ) 。 其次，本研究从酿酒酵母中扩增了3 一磷酸甘油酯酶编码基因g p p 2 ( s c g p p 2 ) ，构 建重组菌株p e t 2 8 a - s c g p p 2 b l 2 1 ，在大肠杆菌中对s c g p p 2 进行诱导表达、纯化和酶 学性质的初步研究。研究发现，s c g p p 2 大小约为3 1 k d a ，最适p h 为4 5 ，在p h 5 5 7 5 范围内具有较好的稳定性；最适温度为5 5 ，在4 c 和2 0 均有较好的稳定性，受到 m 9 2 + 和f e 3 + 的激活，而z n 2 + 、s n 寸、i i l 2 + 离子对该酶呈完全抑制状态；以不同浓度的3 磷酸甘油为底物，测得该酶的k m 值为0 5 5 m m o l l ，v m a x 为0 3 0 u m o l ( m g m i n ) 。以3 磷酸甘油为底物，进行菌株p e t 2 8 a - s c g p p 2 b l 2 1 的全细胞转化，证明了该酶良好的转 化性能，该酶能有效的将底物3 磷酸甘油转化为甘油。 最后，我们在大肠杆菌中尝试了葡萄糖到甘油代谢途径的重构。即将基因c g g p d i 和s c g p p 2 串联表达，构建了p e t a c c g g p d l - s c g p p 2 b l 2 1 重组菌株。在1 的葡萄 糖的条件下，甘油最高产量可达到1 5 6 9 l 。 关键词：胞浆3 磷酸甘油脱氢酶；3 磷酸甘油酯酶；酶学性质；共转化；甘油产量 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e r ei sam e t a b o l i cp a t h w a yo fg l u c o s et og l y c e r o lw a i d l yi ny b a s t s t u d i e so f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eh a v es h o w e dt h a tg l y c e r o li sp r o d u c e db yr e d u c t i o no ft h e g l y c o l y t i ci n t e r m e d i a t ed i h y d r o x y a c e t o n ep h o s p h a t et og l y c e r o l3 - p h o s p h a t e ( g 3 p ) f o l l o w e d b yad e p h o s p h o r y l a t i o no fg 3 p t 0g l y c e r 0 1 t h ef i r s ts t e pi sc a t a l y z e db yn a d - d e p e n d e n t g l y c e r o l3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g p d ) ，w h i c h i se n c o d e db yt h et w oi s o g e n e sg p d ia n d g p d 2 1 1 1 es e c o n ds t e pi sc a t a l y z e db yg l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e ( g p p ) ，w h i c hi se n c o d e db yt h e t w oi s o g e n e sg p p la n dg p p 2 ，w h i l et h eg p d la n dg p p 2a r e 、n d u c e da th i g ho s m o l a r i t y o s m o t o l e r a n ty e a s t ，c a n d i d ag l y c e r i n o g e n e sw l 2 0 0 2 - 5 ，i sa l le x c e l l e n tg l y c e r o lp r o d u c e r w ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e da4 9 0 0 - b pg e n o m i cf r a g m e n tc o n t a i n i n gt h ec g g p dg e n e e n c o d i n gag l y c e r o l 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eh o m o l o g o u s t og p d g e n e s i no t h e ry e a s t s u s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r si nc o n j u n c t i o nw i t hi n v e r s ep c r i t w a sr e g a r d e da san e w g e n e b e c a u s eo ft h en u c l e o t i d eh o m o l o g yb e t w e e nc g g p da n dg p d lg e n ef r o ms a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ei so n l y5 4 15 t h e r ei sn os o m er e p o r t sa b o u tc h a r a c t e r i t i o na b o u tt h i se n z y m e i nt h i ss t u d y ，w ec l o n e dg e n ec g g p d la n ds c g p d1f r o mcg l y c e r i n o g e n e sa n d s c e r e v i s i a e r e s p e c t i v e l y t h e n , w e c o n s t r u c t e dt h e p l a s m i dp e t - 2 8 a - c g g p d l a n d p e t 一2 8 a - s c g p d l ，t r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 t h ec g g p d la n ds c g p d lw e r e e x p r e s s e d ，p u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z e dr e s p e c t i v e l y ，c o n 协a s t e d w i t he a c ho t h e r t h e s d s p a g es h o w e dt h a tc g g p d1a n ds c g p d1h a v eas a m i l i a rm o l e c u l a rm a s s t h e c g g p d ls h o w e do p t i m a la c t i v i t ya tp h6 2a n d2 5 h o w e v e rt h ec g g p d lw a s6 8a n d 3 7 c t h ec g g p d ls h o w e ds t a b i l i t yb e t w e e np h 3 5 - 7 5a n d _ 2 0 。c t h es c g p d ls h o w e d s t a b i l i t yb e t w e e np h 3 5 - 7 5a n d1 2 0 b o t ho fc g g p d la n ds c g p d lw e r ea c t i v a t e db y m g + a n dd e p r e s s e db yz n 2 十，n l es t u d ys h o w e dt h a tg l y c e r o lp r o d u c t sc h a n g e db ya d d e d m 十a n d z n 2 十i n c g l y c e r i n o g e n e s c u l t u r er e s p e c t i v e l y k mv a l u e so b t a i n e dw e r c 0 5 5 m m o l la n d0 7 5 m m o l lf o rd h a pa n dv m a xw e r e1 0 6 u m o l ( m g m i n ) a n d 0 5 1 u m o l ( m g m i n ) r e s p e c t i v e l yo fc g g p d la n ds c g p d l t l l i ss t u d yw ec l o n e dg e n es c g p p 2f r o ms c e r e v i s i a ea n dc o n s t r u c t e dan e ws t r a i n p e t 2 8 a - s c g p p 2 b l 21 t h es c g p p 2w a se x p r e s s e d p u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z e d i t sm o l e c u l a r w e i g h tw a sd e t e r m i n e dt ob e31k i ) ab ys d s - p a g e t h ee n z y m es h o w e do p t i m a la c t i v i t ya tp h4 5a n d 5 5 ca n ds h o w e ds t a b i l i t yb e t w e e np h 5 5 - 7 5a n d4 ca n d - 2 0 c t h es c g p p 2w a sa c t i v a t e db yi r o f e 3 + a n dm 9 2 + ，h o w e v e r , w a si n h i b i t e ds t r o n g l yb yz n 2 + ，m n 2 + a n ds n 2 + 1 1 1 ek mv a l u ew a s o 5 5 m m o l la n dv m a xw a so 3 0 i x m o l ( m g m i n ) f o rg l y c e r o l 一3 一p h o s p h a t e t h e t r a n s f o r m a t i o na b i l i t yo fs e g p p 2f r o mg l y c e r o l 3 - p h o s p h a t et og l y c e r o li sp r o v e db yt h e s t a d yo fp e t 2 8 a - s c g p p 2 b l 21w h o l ec e l l sb i o c a t a l y t i c i ti sr e p o r t e dt h a te s c h e r i c h i ac o l ic a l ln o tt r a n s f o r mg l u c o s et og l y c e r 0 1 i nt h i sp a p e r , w e c l o n e dg e n ec g g p d la n ds c g p p 2f r o mc g l y c e r i n o g e n e sa n ds c e r e v i s i a er e s p e c t i v e l ya n d c o n s t r u c t e dan e wp l a s m i dp e t a c c g g p d l s c g p p 2 t h e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a s t r a n s l a t e di n t oe c o l ib l 21a n dt r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e d s d s p a g es h o w e dt h a t c g g p d 1a n ds c g p p 2e x p r e s s e do b v i o u s l y ，n l en e we c o l is t r a i nw a sc u l t u r e di nl ba n d1 g l u c o s em e d i u nw h i l et h ec g g p d 1a n ds c g p p 2s p e c i a la c t i v i t yo fr e c o m b i n a n ts t r a i nw e r e l i a b s t r a c t d e t e c t e d t h eg l y c e r o lp r o d u c tw a sa l s od e t e c t e da n da c h i e v e d1 5 6 9 l k e yw o r d s ：g l y c e r o l 一3p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，g l y c e r o l - 3 一p h o s p h a t e ，e n z y m ec h a r a c t e r i t i o n , c a ) - t r a n s f o r m a t i o n ，g l y c e r o lp r o d u c t s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：圭箪啦日期：三塑4 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：鱼】童鳞导师签名：幽 日 期j 甜。一 第一章绪论 1 1 甘油的现状及发展 1 1 1 甘油的理化性质及用途 第一章绪论 甘油( g l y c e r 0 1 ) ，学名丙三醇，为一种含有三个羟基的多元醇，是一种无色透明、 无毒、无臭、甘甜粘稠的液体。分子式为c 3 h 8 0 3 ，分子量为9 2 0 9 。甘油具有3 个有亲 水性的羟基，分子量小、容易溶解，在生理p h 范围内不带净电荷，能被细胞膜保持住， 不仅对生物细胞无任何毒副作用，而且可以作为细胞的保护剂等特点，因而是一种极其 理想的耐高渗透压介质。 甘油，因其优良的生理生化特性，能够广泛应用于医药、食品、化妆品、印染、涂 料、油墨、国防、皮革、医药、合成树脂、农药、牙膏等多个行业，是重要的轻化工原 料【1 1 。 然而，最令人期待的是以甘油为底物发酵生产l ，3 丙二醇( 1 , 3 p d o ) 研究所取得的 成就【2 ，3 1 ，1 ，3 p d o 作为一种重要的溶剂和化工原料，主要用于生产多醇聚酯( p t t ) ，在 纤维和纺织品工业有重要用途。 1 1 2 甘油的生产方法 甘油的生产方法先后经历了皂化法、化学合成法和发酵法【4 j 。随着石油等能源的日 渐减少，化学合成法生产丙三醇的经济效益不断下降，产量也在逐年降低，合成洗涤剂 的发展造成皂化法生产甘油产量停滞不前，采用生物技术法生产甘油就营运而生。耐渗 透压酵母合成甘油的方法是国际领先的技术，与一般发酵法相比，该方法是在需氧而不 是微氧或厌氧下生长，不需要加入转向剂，且酵母可在较高的糖浓度条件下生长发酵， 糖的转化率可高达6 0 t 引。 许多微生物在特定的培养条件下都能够合成甘油，包括细菌、酵母、霉菌、原生动 物和藻类等【6 8 j ，其中已被研究过的甘油生产菌株见表1 1 f 9 ，。 表1 1 已研究过的生产甘油的微生物 t a b l el 1s o m em i c r o o r g a n i s m si nw h i c hg l y c e r o lp r o d u c t i o nh a sb e e ns t u d i e d 种类菌株名种类菌株名 酵母菌 s a c c h a r o m y c e s 俚膨v 捃胁p s a c c h a r o m y c e se l l i p s o i d e u s z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i s a c c h a r o m y c e sm e l l i s s a c c h a r o m y c e s f o r m o n e n s i s s a c c h a r o m y c e si i v a r u m s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m e k l o e c h e r aa p i c u l a p a c h y s o l e nt a n n o p h i o l u s 霉菌d e b a r y o m y c e sm o g i i r h i z o p u sn i g r i c a s r h i z o p u s j a v a n i c u s b o t r y t i sc i n e r e a a s p e r g i l l u sn i g e r 江南大学硕士学位论文 1 1 3 发酵法生产甘油 发酵法是继皂化法和合成法之后现在应用于甘油生产的第三种方法。从天然油脂中 提取甘油的方法因其合成量少，而且工艺条件复杂而不能广泛应用于工业生产；化学合 成甘油法也因其条件复杂，成本教高等缺陷不能作为可持续发展生产甘油的方法。从2 0 世纪6 0 年代开始，各国便开始开展采用耐高渗压酵母发酵法生产甘油的研究。江南大 学诸葛健教授等，从自然界中筛选到一株能利用葡萄糖转化高产甘油的酵母，经鉴定命 名为产甘油假丝酵母( c a n d i d ag l y c e r i n o g e n e s ) l l j ，是目前世界上发酵法生产甘油达到 的最高水平之一【1 1 1 。近年来随着基因工程技术和分子生物学的快速发展，国内外相继有 关于构建基因工程菌发酵生产甘油的报道【l 刭。发酵法生产甘油和甘油的其它生产方法相 比周期更短、成本较低、环保无危害，因此有着自身特有的优势，有着极其广阔的应用 前景。江南大学工业微生物研究中心的耐高渗酵母甘油生产、提取方法已经成功的在全 世界中广泛应用于工业化生产，显示了良好的经济和环境效益。 1 1 4 甘油的合成机理 已发现在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中存在甘油合成途径( 图1 1 ) 。当环境 中渗透压升高时，s c e r e v i s i a e 启动体内的高渗甘油应答途径( h o g 途径) ，通过合成并在 胞内累积甘油以便维持细胞内外渗透压的平衡【1 3 , 1 4 ，用于保证菌体的生长和代谢正常进 行。 甘油的合成途径如图1 1 ，首先底物葡萄糖在磷酸化和醛缩酶的作用下分解成3 磷 酸甘油醛和磷酸二羟丙酮( d h a p ) ，前者经脱羧反应进入三羧酸循环或e m p 途径，d h a p 在n a d + 依赖性3 磷酸甘油脱氢酶催化下还原生成3 磷酸甘油，这一反应为进入甘油合 成分支途径中的第一步酶促反应，也是甘油合成过程中的限速步骤。3 磷酸甘油进一步 在3 - 磷酸甘油酯酶的作用下脱去磷酸根而最终形成甘油，此为甘油合成途径的最后一个 2 第一章绪论 酶促反应。 图1 - 1 甘油代谢途径 f i g 1 1m e t a b o l i cp a t h w a yo f g l y c e r o l 1 2 产甘油假丝酵母 产甘油假丝酵母( c a n d i d ag l y c e r i n o g e n e s ) 是江南大学科研人员从5 0 0 0 株耐高渗酵 母中分离得到的一株优良工业化甘油生产菌株，该菌株最大的特点是耐高渗透压，能够 在5 0 0e , l 葡萄糖的高渗条件下生长；在2 5 0g l 葡萄糖条件下，胞外积累甘油总量最 高可达1 1 0g l ，转化率超过6 0 ，是目前世界相关研究中的最高水平之一【l 孓1 8 j 。同时， 江南大学研究人员经过多方面考察，最终采用载体蒸馏技术来纯化甘油，该方法可使甘 油的蒸馏效率高达9 0 以上。该项目因发酵甘油产业化成绩显著已于1 9 9 7 年获得中国 轻工科技进步一等奖【1 9 1 ，因科技创新突出而于1 9 9 9 年获得国家科技发明二等奖【2 0 】。 近年来，本研究中心已经对该酵母进行了大量的高产机理以及遗传背景方面的研 究。主要的研究成果包括以下方面：细胞内过量合成并积累甘油是该菌株耐高渗性能的 物质基础【2 ，而甘油合成过程中的关键酶胞浆3 一磷酸甘油脱氢酶的组成型稳定性高表 达则是其过量合成甘油的重要原副2 2 1 ，克隆并验证了产甘油假丝酵母3 一磷酸甘油脱氢 酶基因启动子受高渗透压高表达1 2 3 1 。 1 33 磷酸甘油脱氢酶 在酵母细胞内，甘油的合成代谢由糖酵解途径的中间代谢产物磷酸二羟丙酮 ( d 乩廿) 开始通过两步催化反应来完成的。如图1 2 所示，d h a p 首先在n a d + 依赖 的胞浆3 磷酸甘油脱氢酶( g p d ) 作用下以n a d h 为氢供体被还原为3 磷酸甘油( g 3 p ) ， 再在3 磷酸甘油酯酶( g p p ) 作用下脱去磷酸基团而生成甘油【2 4 】。这条催化途径对于许 多酵母来说都是主要的甘油合成途径。在甘油合成途径所包括的两步反应中，第一个反 应为限速步骤，催化该反应的为3 磷酸甘油脱氢酶，是酵母细胞内甘油合成代谢途径中 的关键酶，它的合成量大小以及酶活水平将直接决定葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成 方向的物质流分配量，由此也决定甘油的生成水平。 3 江南大学硕士学位论文 研究结果显示，酿酒酵母中的胞浆3 磷酸甘油脱氢酶有两个同工酶，为g p d l p 和 g p d 2 p ，其中g p d l p 为渗透压诱导表达型 2 5 - 2 8 】，高渗条件可以大幅度提高其酶活表达， 而g p d 2 p 贝l j 受到厌氧条件的诱导。其中g p d l p 已经得到分离纯化【2 9 】，研究发现它由3 9 1 个氨基酸组成，分子量为4 2 ，8 6 9l ( d ，它的氨基酸序列存在n a d + 结合区域和催化区域【3 0 】。 对于胞浆3 一磷酸甘油脱氢酶g p d l p 受高渗条件诱导的特性已进行了广泛的研究，为了弄 清其受高渗条件诱导的特性，研究人员克隆得到其编码基因g p d l 并开展了大量的研究， 结果表明高渗条件可以大幅度提高该酶的表达 2 7 , 3 1 , 3 2 。当g p d l 基因缺失，突变株表现 出渗透压敏感性，同时细胞的甘油合成能力也显著下降【2 7 】，而g p d 2 基因的缺失对细胞 的耐渗透压能力以及渗透压胁迫条件下甘油的合成能力并无显著影响，但是g p d 2 基因 的缺失可导致细胞在厌氧环境下甘油的合成能力显著下降，与野生型对照相比可下降 4 0 左右，而产生乙醇的能力可提高约8 ，同时细胞生物量也显著下降【3 3 2 8 】。而g p d l 基因的敲除对细胞在厌氧环境中甘油合成能力基本没有影响【3 4 1 。g p d l a g p d 2 a g v g 重突变 株则不能正常合成甘油，表现出渗透压敏感性并且在厌氧环境中无法正常生长 2 8 , 3 3 】。 最近研究人员发现，g p d l p 和g p d 2 p 在甘油代谢中发挥不同作用是由二者在细胞器 内位置差异所引起的【3 5 1 。g p d l p s r 币i g p d 2 p 在细胞内呈现出区室化分布特点【3 5 ，3 6 1 。g p d l p 部分存在于胞浆中，另一部分存在于过氧化物酶体之中；而g p d 2 p 蛋白被认为存在于线 粒体中3 5 1 。 本课题组根据已报道的3 磷酸甘油脱氢酶的氨基酸序列设计简并引物，通过简并 p c r 技术结合染色体步移技术首次从cg l y c e r i n o g e n e s 克隆到编码产甘油假丝酵母胞浆 3 磷酸甘油脱氢酶基因c g g p d l 的读码框及其侧翼序列( g e n b a n k 登录号为e u l 8 6 5 3 6 ) ， 与酿酒酵母g p d l 基因( g e n b a n k 登录号为x 7 6 8 5 9 ) 相比对，发现二者的同源性只有 5 4 1 5 ，表明产甘油假丝酵母的c g g p d l 基因是一个全新的基因，同时研究还发现 c g g p d l 是一种渗透压调节基因。研究也表明c g g p d p 蛋白，由3 8 8 个氨基酸组成，分子 量为4 3 k d a ，与安格斯毕赤酵母( p i c h 插a n g u s t a ) 相似性最高，达到7 0 9 ，与酿酒酵母 的g p d l p 、g p d 2 p 的相似性分别为6 0 9 矛- 1 5 6 2 t 3 9 1 。 1 43 磷酸甘油酯酶 在合成甘油的过程中，3 磷酸甘油酯酶( g p p ) 最终将3 磷酸甘油脱去磷酸基团而 生产甘油，在甘油合成的过程中起到重要的作用。王正祥教授【4 0 1 研究表明细胞稳定高表 达g p d 并且g p p 酶活水平远高于g p d 酶活是菌株高产甘油的根本所在。该酶高效过量表 达，酶活水平远高于胞浆3 磷酸甘油脱氢酶，为高产甘油提供了必要的基础。 在s c e r e v i s i a e 中，g p p 有两个同工酶，g p p l 和g p p 2 ，对应的编码基因分别为g p p l 和卯p 2 。大量研究表明g 尸尸2 受到高渗透压诱导表达，与g p d l 相同【3 3 3 9 1 ；而g 尸尸j 是在 细胞处于厌氧环境时诱导表达的，与g p d 2 相对应【2 8 , 4 0 , 4 。当细胞处于渗透压胁迫状态 时，g p d l 和在短时间内诱导表达，促使代谢流迅速转向甘油合成途径并大量在胞 内积累以平衡外界渗透压，从而保护细胞免受渗透脱水的损伤。当酵母细胞处于厌氧环 境中时，诱导g p d 2 和a 叩，表达，促使细胞合成甘油，根据培养条件的不同，大约4 1 0 的葡萄糖能够转化为甘油1 4 2 ，同时将胞内积累的过量n a d h 再氧化为n a d + ，维持胞内 4 第一章绪论 氧化还原电势的平衡p 3 , 4 q 。g p p 和g p p 2 两个基因任何一个缺失都不会显著影响细胞在 高渗透压或厌氧条件下甘油台成能力和表型变化，只有二者同时缺失的突变株才会表现 出甘油合成能力下降、对高渗透压的敏感性和厌氧生长缺陷【3 9 1 。另一方面过量表达g p p 基因并不能显著提高细胞的甘油合成能力删。 i 图l 一2 酿酒酵母中甘油合成示意图 f i 9 1 2 t h eo v e r v i e w o f g l y c e r o l m e t a b o l i s mp a t h w a y i n sc e r e v i s i a e 1 5 融合蛋白 用于融台表达的亲和纯化蛋白标签，茸先，蛋白本身越小越好，这样不会对目标蛋 白的构象、大小和特性产生显著影响，方便直接对融合蛋白进行下游操作：曾经用过的 融台表达亲和标签g s t ( 谷胱甘肽转移酶) 本身就比较大，在纯化后需要先切除标签后才 能进行下一步的检测分析：其二、生理条件下带电越少越好：需要借助融合表达纯化的 许多蛋白通常在生理溶液p h 下进行分析研究，所以融合标签带电少，对蛋白质的表达、 分泌、折叠、构象形成等影响小，比较存易得到和天然蛋白相似的产物；第三、融合标 签的免疫原性越少越好，融合产物不必除去标签即可直接作为抗原免疫。 6 x h i s t a g 作为融台表达亲和标签在各方面都是比较理想的，6 个组氨酸本身比较小， p h8 0 的情况下是不带电的，免疫原性差，年惘优质的带镍离子的纯化填料进行亲和纯 化，目标蛋白纯度高，方法简单方便，成本低，己得到国内外研究人员的广泛应用。 h i s - t a g 所用层析凝胶的基质上连接了个n t a ( 氮基三乙酸) ，可以与n i 离子结 合，而n i 离子与融合蛋白的6 x h l s 氨基酸之间产生吸引力，当融台蛋白溶液流经亲和纯 化介质时，融合蛋白被特异亲和吸附，然后用不含咪唑( i m i d a z o l e ) 的缓冲液沈柱，便 可以将杂蛋白洗脱，而特异性吸附的目的蛋白仍结合在柱体，从而将带有h i s t a g 组氩酸 江南大学硕士学位论文 标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。五元咪唑环是蛋白与n i 离子作用的关键。因此 当我们用高浓度的咪唑溶液洗脱的时侯，咪唑便于蛋白质h i s t a g 的咪唑环竞争结合，最 终将融合蛋白从凝胶上洗脱下来。 1 6 酶活力测定以及影响因素 1 6 1 酶的活力 酶活力单位用u ( a c t i v eu n i t ) 来量度。1 9 6 1 年国际酶学会议规定：1 个酶活力单 位是指在特定条件( 2 5 c ，其它为最适条件) 下，在l m i n l 勾能转化1 1 x r n o l 底物的酶量， 或是转化底物中1 9 m o l 的有关基团的酶量。比活( s p e c i f i ca c t i v i t y ) 是指每分钟每毫 克酶蛋白在2 5 。c 下转化的底物的微摩尔数。比活是酶纯度的测量。 1 6 2 影响酶活力的因素 米契里斯( m i c h a e l i s ) 和门坦( m e n t e n ) 根据中间产物学说推导出酶促反应速 度方程式，即米一门公式v = v m s ( k m + s ) ，其中k m 为米氏常数v m a x 为最大反应速度，s 为反应中底物浓度。由米门公式可知：酶促反应速度受酶浓度和底物浓度的影响， 也受温度、p h 、激活剂和抑制剂的影响。 ( 1 ) 酶浓度对酶促反应速度的影响 从米门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系图解可以看出：酶促反应速度与酶 分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 但事实上，当酶浓度达到一定的程度后，并不保持这种关系，曲线逐渐趋向平缓。 根据分析，这可能是高浓度的底物夹带有许多的抑制剂所致。 ( 2 ) 底物浓度对酶促反应速度的影响 在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与 底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产 物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加。 在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有 因此增加，甚至受到抑制。 ( 3 ) 温度对酶促反应速度的影响 各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范 围内，温度每升高1 0 ，酶促反应速度可以相应提高1 2 倍。不同生物体内酶的 最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为3 7 - - 4 0 ；微生物体内各种酶 的最适温度为2 5 - - 6 0 ，但也有例外，如巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等 体内的葡萄糖异构酶的最适温度为8 0 ；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为 8 5 - - 9 4 。 最适温度在6 0 以下的酶，当温度达到6 0 - - 8 0 时，大部分酶被破坏，发生不 可逆变性；当温度接近1 0 0 时，酶的催化作用完全丧失。 6 第一章绪论 ( 4 ) p h 对酶促反应速度的影响 酶在最适p h 范围内表现出较好的活性，大于或小于最适p h ，都会降低酶活性。 主要表现在两个方面：一、改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物 的结合；二、过高或过低的p h 都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。 ( 5 ) 激活剂对酶促反应速度的影响 能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有无机阳离子，如钠离子、 钾离子、铜离子、钙离子等；无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离 子磷酸盐离子等；有机化合物，如维生素c 、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。许多 酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称 为对酶的激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态，这种酶称为酶原。它必须 经过适当的激活剂激活后才具活性。 ( 6 ) 抑制剂对酶促反应速度的影响 能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。 酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙酸、生物 碱、染料、对氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。 有的物质既可作为一种酶的抑制剂，又可作为另一种酶的激活剂。 1 7 本课题的立题意义以及内容 酵母中普遍存在甘油合成途径，能够在渗透压培养基中实现葡萄糖到甘油的转化， 酿酒酵母作为模式菌株，其代谢机理以及甘油合成过程中的各基因和酶的性能已经了解 比较清楚，产甘油假丝酵母作为一株已经工业化应用的甘油生产菌株，我们对其遗传背 景了解尚少，对其代谢调控详细机理以及关键酶等的基础性了解甚少。 胞浆3 磷酸甘油脱氢酶( g p d ) 是甘油合成过程中的限速酶，该酶的表达与否，表 达量大小以及酶活力的高低都直接影响到甘油产量。本研究通过p c r 扩增分别得到来 自产甘油假丝酵母和来自酿酒酵母的胞浆3 一磷酸甘油脱氢酶编码基因c g g p d l 和 s c g p d j 。构建了重组菌株p e t - 2 8 a - c g g p d l b l 21 和p e t - 2 8 a - s c g p d l b l 2 1 ，在大肠杆 菌中对c g g p d i 和s c g p d l 进行诱导表达、纯化和酶学性质的分别研究和对比。通过与 s c g p d l 的对比，发现c g g p d l 的特别之处，进而为产甘油假丝酵母高产甘油进行指导。 同时也为今后研究c g g p d l 在晶体结构等方面与s c g p d l 之间存在的差别等提供一定的 基础。 3 磷酸甘油酯酶作为甘油代谢过程中重要的酶，实现了3 一磷酸甘油到甘油的最终转 化，该酶的高表达是高产甘油的基础。目前对该酶的研究主要集中在功能研究方面，对 该酶的酶学性质系统报道尚少。本研究从酿酒酵母中扩增出3 磷酸甘油酯酶编码基因 s c g p p 2 ，在大肠杆菌中对该酶进行了诱导表达、纯化和酶学性质的研究，并且设计了 以3 磷酸甘油为底物的p e t - 2 8 a - s c g p p 2 b l 2 1 全细胞转化，对该酶的功能进行了有效验 证。 研究表明，大肠杆菌中并无从葡萄糖到甘油这一代谢途径，本研究分别从产甘油假 丝酵母和酿酒酵母中扩增基因c g g p d l 和s c g p p 2 ，构建了p e m e c g g p d l - s c g p p 2 b l 2 1 7 江南大学硕士学位论文 重组菌株，欲在大肠杆菌中实现从葡萄糖到甘油直接转化。发酵结果显示，在1 葡萄 糖的条件下进行发酵，最高可产甘油1 5 6 9 l ，成功的实现了大肠杆菌中葡萄糖到甘油 的转化。 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验仪器 第二章实验材料与方法 超净工作台：苏净集团安泰公司；a l l e g r a x 1 5 r 离心机：b e c k m a n 公司； 电子天平：上海天平仪器厂；立式蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂； p c r 仪：德国e p p e n d o r f 公司；琼脂糖凝胶水平电泳仪：b i o r a dm o d e l2 0 0 2 0 ， 北京六一厂：u v p 凝胶成像仪：英国i j l v p 有限公司； 超纯水生成系统：美国l a b c o n c o 公司；冷冻离心机：德国b e c k m a n 公司； s p x 2 5 0 型生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；u v i ，凝胶成像仪：英国u v p 有限 公司；旋转式摇瓶柜：上海新星自动化控制设备成套厂； 超声破碎仪：美国s o n i c s x 7 5 0 ；分光光度计：尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 琼脂糖凝胶水平电泳仪：b i o r a dm o d e l2 0 0 2 o ，北京六一厂； 2 1 2 实验材料 2 1 2 1 实验所用菌株和质粒 产甘油假丝酵母( cg l y c e r i n o g e n e s ) w l 2 0 0 2 - 5 和酿酒酵母w 3 0 3 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 均由本研究中心保藏。大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b l 2 1 和j m l 0 9 由本研 究中心保藏。克隆载体p m d i8 一t 购自t a k a r a 公司。质粒p e t - 2 8 a ( + ) 购自n o v a g e n 公司， 质粒p e t a e 由本研究中心沈微博士构建。 2 1 2 2 化学材料 d l a 磷酸甘油、三乙醇胺、d t t 、n a d h 、磷酸二羟丙酮( d m 廿) 、抗生素、t r i s 、 s d s 购自s i g m a 公司， t 4 d n a 连接酶、t a qd n a 聚合酶、d n t p s 、d n a 限制性连接酶、i p t g 购自t a k a r a 公司， d n a 胶回收试剂盒、小量质粒回收试剂盒购自博大泰克生物工程有限公司， 咪唑、氨苄霉素、卡那霉素购自上海s a n g o n 公司， 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自a m e r i c a np