（微生物学专业论文）气单胞菌的毒力基因及其表达的影响因素研究.pdf

摘要 为了了解温度和p h 对嗜水气单胞菌的毒力基因表达以及致病性的影响，我 们利用r t - p c r 对4 种毒力基因的表达进行了分析。研究结果显示嗜水气单胞菌 毒力基因的表达受温度和p h 值影响，其中编码溶血素( a h h ) 、气溶素似e r a ) 、 外膜蛋白( 例归) 和粘附素( a h a ) 的毒力基因在1 5 。c 、2 5 和3 7 。c 下均能高效表达， 4 。c 时a h h 和a e r a 两基因也能持续表达，而o m p 和a h a 两基因的表达停止。 在中性或偏酸性的条件下( p h 5 0 和p h 7 o ) ，4 种毒力基因都得以表达；在碱性条 件下( p h 9 0 ) ，只有a h h 得以表达，而a h a 等其它3 个基因的表达减弱或停止。 基因表达的研究结果得到鲫鱼攻毒试验的支持。此外，研究还表明细菌的毒力与 鱼的体温也有关系。 本文的另一个重要的工作是研究7 8 株嗜水气单胞菌菌株毒力基因的分布以 及在其中6 4 株菌株中的耐药情况。在8 个检测的毒力基因中，气溶素( a e r a ) 基 因出现的频率是最高的，达到了7 3 ；而在所有7 8 株气单胞菌中未检测到s 层 蛋白基因( 乩) 和丝氨酸蛋白酶基因( a h p a ) l 出现。在6 4 株菌株中，嗜水气单胞菌对 杆菌肽和氨苄青霉素具有高度的耐药性，而高于7 3 的菌株却对丙氟哌酸等1 2 种药物敏感。 关键词：嗜水气单胞菌；毒力基因；温度；p i - i ；表达 a b s t r a c t t h i sp a p e rc o n s i s t so ft w op a r t s ：( i ) t h e s ee f f e c t so ft e m p e r a t u r ea n dp ho n t h ee x p r e s s i o no ff o u rv i r u l e n c ef a c t o r s ：h e m o l y s i n ( a h h ) ，a e r o l y s i n ( a e r a ) ，o u t e r m e m b r a n ep r o t e i n s ( o m p ) a n da d h e s i o n ( h h a ) ，f r o ma e r o m o n a sh y d r o p h i l aa n do n i t sp a t h o g e n i c i t yw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no ft h e s e v i r u l e n c ef a c t o r sf r o ma h y d r o p h i l aw a sa f f e c t e db yt e m p e r a t u r ea n dp hi nt h em e d i a a l lf o u rv i r u l e n c ef a c t o r sw e r eh i g h l ye x p r e s s e di na h y d r o p h i l aw h e ng r o w na t15 。c ， 2 5 ca n d3 7 cd e t e r m i n e db yr t - p c r a t4 c ，b o t ha h ha n da e r aw e r es t i l l e x p r e s s e d ，b u tn e i t h e ro m p n o ra h aw a s a l lf o u rv i r u l e n c ef a c t o r st e s t e di nt h e p r e s e n ts t u d yw e r ee x p r e s s e di nb a c t e r i a lc e l l sw h e ng r o w na tp h 5 0a n dp h 7 0 o n l y a h h e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e da tp h 9 0 t h e s er e s u l t sw e r es u p p o r t e db yt h er e s u l t s f r o mt h ec h a l l e n g ee x p e r i m e n t sw i t hc r u c i a nc a r p i na d d i t i o n ，t h es t u d ys h o w e dt h a t t h ep a t h o g e n i c i t yo ft h eb a c t e r i aw a sa f f e c t e db yt h eb o d yt e m p e r a t u r eo ff i s h ( i i ) w e h a v es t u d i e dt h ed i s t r i b u t i o no fv i r u l e n c ef a c t o r si n7 8s t r a i n so fa e r o m o n a s h y d r o p h i l aa n da n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t y t e s t ao ft h e6 4s t r a i n s o ft h ee i g h t v i r u l e n c ef a c t o r , a e r ah a v et h eh i g h e s tf r e q u e n c eu pt o7 3 ，w ec a n td e t e c ts - l a y e r p r o t e i n ( s l ) a n de x t r a c e l l u l a rs e r i n ep r o t e a s e ( a h p a ) i n a l lt h e7 8s t r a i n so f a e r o m o n a sh y d r o p h i l a i nt h e6 4s t r a i n s ，a e r o m o n a sh y d r o p h i l ah a v eh i g hl e v e l r e s i s t a n tt ob a c i t r a c i na n da m p i c i l l i n ，b u tu pt o7 3 a r es e n s i t i v et ot w e l v ed r u g s i n c l u d i n gc i p r o f l o x a c i n k e y w o r d s ：a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ；v i r u l e n c eg e n e ；t e m p e r a t u r e ；p h ；e x p r e s s i o n i i 独创性声明 y9 2 8 9 7 7 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壹璺叁鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 一始恫旮蒯年多月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌文学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 饲臻 签字日期：办彩年易月r 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章综述 气单胞菌( a e r o m o n a ss p p ) 是一群氧化酶阳性、接触酶阳性的革兰氏阴性杆 菌，其直径为o 3 1 0 1 x m ，呈单个、成对或短链状，通常以一根极生鞭毛运动( 在 固体幼龄时具有周生鞭毛) ，没有芽胞和荚膜。气单胞菌兼性厌氧，具有呼吸和 发酵代谢类型，是化能异养菌，其最适生长温度2 2 2 8 ，大多数种可在3 7 生 长。气单胞菌对葡萄糖和其他糖类能产酸，常产气、通常为赖氨酸脱羧酶和精氨 酸双水解酶阳性、鸟氨酸脱羧酶阴性、明胶酶和d n a 酶皆阳性、还原硝酸盐。 气单胞菌的绝大多数种能发酵糖包括麦芽糖、d 半乳糖和海藻糖，抗弧菌抑制剂 2 ，4 二氨基6 ，7 异丙基喋啶( o 1 2 9 ) 。目前为止报道的气单胞菌共有1 4 种表型种 ( 对应1 5 种基因种，h g s ) t 1 1 表型上主要分为两大类：嗜冷、无运动力( p s y c h r o p h i l i c ， n o n m o t i l e ) 和嗜温、有运动力( m e s o p h i l i cm o t i l e ) 。 气单胞菌是水生态系统中的常居菌，其模式种为嗜水气单胞菌a e r o m o n a s h y d r o p h i l a ) 。嗜水气单胞菌是我国淡水养殖中最常见的致病细菌，经常引起水生 动物的败血症，不仅有零星的感染和流行，还可引起淡水养殖鱼类的大面积暴发 性死亡( 俗称“暴发病”) ，后者在在我国尤为常见【2 】。通常认为这类细菌只有中 等毒力，属于条件性致病菌，当鱼类处于应激状态，抗病力下降以后才引发疾病 【引。嗜水气单胞菌有些种类( 包括a v e r o n i i ，a c a v i a e ，a 廊以幽e f 和a s c h u b e r t i i ) 对人 也有致病性，可引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎【4 5 】 等。近年来，因水体环境遭受破坏，嗜水气单胞菌成为了危害甲鱼、鲤鱼、鳗鱼、 罗非鱼、河蟹、鲶鱼、牛蛙等水产动物养殖的重要致病菌之一，引起多种水产动 物的败血症，给从业者造成惨重的经济损失。研究认为：毒力基因的表达是引发 嗜水气单胞菌致病性的必要因素，鉴于它们在引发嗜水气单胞菌致病性方面的重 要作用，引起越来越多学者的关注。 1 1 毒力因子 研究发现嗜水气单胞菌的致病性是复杂而且多因子的，涉及到许多毒力因 子。嗜水气单胞菌的致病过程是由多种致病因子的相互作用导致的，与一般细菌 的致病过程类似，主要是粘附、侵袭、体内增殖及产生毒素等系列过程，而这些 过程又与细菌产生的各种致病因子有关【6 】。嗜水气单胞菌具有多种毒力因子，包 括：外毒素( e x t r a c e l l a r t o x i n ) 、s 层蛋白( s l a y e rp r o t e i n ) 、胞外蛋白酶( e x t r a c e l l a r p r o t e a s e ：，e c p a s e ) 、外膜蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，o m p ) 、菌毛( p i l i ) 、鞭毛蛋 白、脂肪酶、d n a 酶等，这些毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用。 1 1 1 内毒素( e n d o t o x i n ) 一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素( e x o t o x i n ) ，它是一种毒性蛋白质， 是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。另一类为内毒素( e n d o t o x i n ) ，是 革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。 ， 细菌在生活状态时不释放内毒素，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞 时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂a 成分，具有很 强的耐热性。内毒素对组织细胞的选择性不强，不同革兰氏阴性细菌的内毒素， 引起的病理变和临床症状大致相同。由于嗜水气单胞菌主要引起出血性败血症， 所以可以肯定内毒素在该菌的致病性方面起到了重要作用。许多学者的研究证 实，用l p s 免疫鱼类可以产生有效的保护作用【_ 7 1 。 1 1 2 外毒素( e x t r a c e l l a r t o x i n l ) 产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆 菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌，例如，气单胞菌。嗜水气单胞菌的 致病菌株所产生的外毒素是其重要的致病因子之一，这些外毒素具有细胞毒性、 肠毒性和溶血性等多种生物活性。嗜水气单胞菌外毒素成分多样，功能复杂。包 括有两种溶血毒素：气溶素和溶血素( 分别a e r a 和h l y a 编码) 以及三种肠毒素： 热敏感型细胞兴奋性肠毒素( a c t ，由口厅基因编码) 【8 9 】，耐热型细胞兴奋性肠毒素 ( a s t ，由娜f 基因编码) 和溶细胞肠毒素或称细胞毒肠毒素( a c 饥址c y t o e n ，眭l a c t 编码) 【1 1 】等。尽管上述称谓各不相同，但它们表现出十分相似的生物活性，都是 单一的多肽分子，并具有相似或相同的分子量、等电点。另外，涂小林等1 2 1 从患 暴发性传染病的鲫鱼分离到嗜水气单胞菌，将其培养物经硫酸铵沉淀，d e a e 纤维素层析及s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶过滤纯化，获得一种分子量为5 2 5 k d 单一多肽 的外毒素。涂小林发现该外毒素具有溶血性、肠毒性和细胞毒性，其生物学特性 可被同源抗毒素中和，并根据其生物学特性将毒素命名为h e c ( h e m o l y t i ca c t i v i t y e n t e r o t o x i c i t yc y t o t o x i c i t y ) 毒素。 1 1 2 1 气溶素( a e r o l y s i n ：，a e r a ) 气溶素在3 2 年前i 主t b e r n h e i m e r 等【1 3 】首先鉴定和命名。1 9 8 1 年i 由b u c k l e y 1 4 1 等 2 纯化出来。其编码基因于1 9 8 7 署1 1 9 8 8 年被克隆和测剧1 5 , 1 6 。a e r a 基因是研究得最 为深入的嗜水气单胞菌的毒力基因之一，在g e n b a n k 中可以搜索到4 0 多条嗜水气 单胞菌气溶素基因的部分或全序列。该基因编码的气溶素a e r a 是细胞通道形成 毒素，引起p 型溶血。a h y d r o p h i l a ，a b e s t i a r u m 和a t r o t a 都可产生这种毒素。 1 1 2 2 溶血素( h e m o l y s i n ) 溶血素能破坏各种细胞( 包括白细胞) ，这种损伤是不可逆转的，它在0 - 3 7 c ， 都可以结合在细胞膜上。纯化的溶血素无宿主特异性，可对动物致死，例如， r o s e 等1 7 1 纯化的毒素( 有溶血性) 在l m i n 内致死小白鼠，其致死剂量小于lp g g 。 溶血素在致病过程中的毒性作用已经证实，但其活性和细菌致病性之间没有正相 关的关系，因此，邱德全等【18 】认为在一些动物中溶血素的作用不如细胞毒素突出。 1 1 2 3 细胞毒肠毒素( c y t o t o x i ce n t e r o t o x i n ，a c t ) 细胞毒肠毒素为5 4 5 k d 蛋白质，该蛋白为细胞肠毒素( a c t ) 的前体形式，并 含有一段2 3 个氨基酸的导肽，成熟的a c t 为5 2 k d 的蛋白，属于孔形成毒素， 与气溶素基因具有7 3 1 9 6 7 的相似性。a c t 具有多功能活性，兼具溶血性、细 胞毒性、肠毒性和致死性。细胞毒肠毒素使组织细胞溶解和破裂。r o s e 等观 察到嗜水气单胞菌分泌的毒素使各种细胞形成孔洞，中国仓鼠卵巢细胞膜在细胞 毒素原作用下围绕细胞核皱缩、破裂并释放细胞内容物。 大多数细胞毒素同时具有溶血性，使红细胞形成空洞。同时，细胞毒素还影 响细胞的代谢( 如生长、代谢酶、培养液p h 、蛋白质结合、核酸的代谢) ，但它 与气溶素不同的是，它不能与红细胞上气溶素受体血型糖蛋 刍( g l y c o p h o r i n ) 结合。 外毒素的溶血作用包括“结合聚合插入”三个步骤。毒素单体首先结合到 红细胞膜表面的特殊糖蛋白受体上，很快进行聚合作用形成六聚体，聚合体插入 细胞膜、破坏细胞膜的渗透屏障作用，最终导致细胞破裂死亡，使病鱼血液处于 低凝状态，表现出全身性出血的症状。 1 1 2 4 细胞兴奋性肠毒素( c y t o t o n i ce n t e r o t o x i n ) 嗜水气单胞菌含有2 种类型的细胞兴奋性肠毒素基因，对5 6 处理敏感的 a l t ( 3 6 8 个氨基酸残基，4 4 k d ) 以及对5 6 c 处理不敏感的a s t ( 6 3 6 个氨基酸残基， 7 1 k d ，等电点为6 9 ) 。它们和细胞毒肠毒素不一样，可使细胞由圆变长、变大， 并产生c a m p ，这属于典型的肠毒素反应，当然，它们在兔肠段结扎试验中均可 引起积水。细胞兴奋性肠毒素在兔的肠绊不引起粘膜损伤，但是导致液体积累， 所聚集液体的电解质内容和霍乱作用的结果相似。 肠道内的嗜水气单胞菌导致的腹泻性病，容易为抗菌素抑制。个别动物在 大量感染嗜水气单胞茵时，肠道内肠毒素量大，与细胞不可逆结合，使体液大量 损失，导致死亡【1 8 1 。 1 1 3 s 层蛋白( s l a y e rp r o t e i n ) ， s 层蛋白象荚膜一样位于细菌表面的最外层，完整地包裹着细菌的菌体，它 是由单一的蛋白质亚单位呈四边形规则排列起来的一种类晶格结构，晶格之间有 一定的间隙，所以表现为多孔性。 s 层蛋白是一种相对分子量为5 1 5 2 k d ，p 1 4 6 的单一多肽，含有大量的酸性 氨基酸和非极性氨基酸，具有显著的疏水性，并借此自我组装成层，主要起保护 性屏障作用，同时还具有保持细胞完整性，抵抗宿主血清作用，抗吞噬细胞和补 体介导的细胞溶解等作用。s 层蛋白的分子量虽与外毒素相近，但并非同一物质 1 2 1 。现有研究表明，大部分的强毒株都具有s 层，s 层蛋白z 日匕l - , 够增强嗜水气单胞 菌的致病性，但奇怪的是s 层蛋白对小鼠并没有直接的致死性 1 9 , 2 0 】。 嗜水气单胞菌的s 层蛋白对细菌入侵动物组织有重要作用，k o k k a 掣1 9 】也通 过免疫化学分析证实了s 层蛋白在细菌通过胃肠粘膜入侵后的扩散及致病过程 中有重要的作用。在感染嗜水气单胞菌的病人身上有强的对s 蛋白的体液免疫反 应，说明s 蛋白的免疫原性是较强的，也提示它在感染中的作用。多年研究的结 论认为s 蛋白在嗜水气单胞菌自我保护和入侵过程中有重要作用，但不是主要的 致病因子。 1 1 4 胞外蛋白酶( e x t r a c e l l a rp r o t e a s e ，e c p a s e ) 胞外蛋白酶是嗜水气单胞菌胞外产物的组成部分，是构成嗜水气单胞菌重要 的致病因子之一，它的产生受代谢阻遏系统的调节，氨离子和葡萄糖会抑制蛋白 酶的产生，而氮化物和无葡萄糖碳源则促进其产生。胞外蛋白酶的作用机理为破 坏机体的免疫系统，促进病原菌在宿主组织中的繁殖。胞外蛋白酶可以直接作用 于宿主的组织，使其发生溶解和坏死。嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶具有免疫原性， 能够产生与菌体引起的败血症相同的症状，对鲫鱼具有很强的独立致病作用。胞 外蛋白酶在细菌对宿主组织的粘附、细菌在体内的增殖及逃避机体免疫机制的杀 灭等过程中都起重要作用，从而有助于细菌在宿主体内的生存和繁衍，并对宿主 组织造成直接损伤【刚。 胞外蛋白酶不仅起直接致病作用，还能激活毒素前体，影响细菌粘附而起间 接作用川。迄今为止，研究较多的嗜水气单胞菌胞外酶有乙酰胆碱酯酶和丝氨酸 蛋白酶，其中乙酰胆碱酯酶是最毒的部分，能使宿主产生典型的神经毒症状。乙 酰胆碱酯酶是一种高分子量的蛋白，它在2 0 稳定，在嗜水气单胞菌胞外分泌 蛋白的其它成分作用下，分解为两部分，最小及稳定的具有高活性片段的分子量 为1 5 1 0 4 k d ，它对鱼类有较高的致死作用。 1 1 5 外膜蛋i 刍( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，o m p ) o m p 是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，含有多种蛋白成分，其数量、种类 随着不同菌株及菌株的不同培养条件和提取方法而有所变化。嗜水气单胞菌 o m p 与其毒力密切相关。孙建和等吲研究表明，培养温度对嗜水气单胞菌o m p 基因的表达有一定的影响，例如，2 8 。c 表达的o m p 以4 3 k d 最多，并且菌体毒 力增强。 值得注意的是，嗜水气单胞菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发机 体的体液免疫和细胞免疫，还能激活补体介导的免疫系统【2 3 乏4 1 。 1 1 6 菌毛( p i l i ) 菌毛也是嗜水气单胞菌的重要的粘附素，嗜水气单胞菌的菌毛从s 层晶格网 孔伸出菌体外。菌毛有两种形态：w ( w a v y ) 菌毛细而长，易弯曲呈波浪状，菌毛 数量少，与细菌的粘附及血凝作用有关，是一种粘附素；r ( r a g i d ) 菌毛短而硬， 与细菌的自凝作用有关，但与血凝作用无关，不是粘附素。w 菌毛可能是一种 定居因子，它主要见于临床分离菌株，是病原细菌的毒力因子之一，能结合到人 及兔的肠上皮细胞。 1 2 嗜水气单胞菌的检测 二十世纪7 0 年代以来，嗜水气单胞菌的检测方法研究随着分子生物学、免 疫学和微生物学的发展取得了很大的进步。 1 2 1 选择性培养基检测法 j 选择性培养基检测法是利用不同培养基成分和培养条件，抑制多数细菌生 长，只利用某一种或某一类细菌生长的检测方法。鱼类嗜水气单胞菌的检测可使 用r i m l e r - s h o t t s 培养基。使用r i m l e r - s h o t t s 培养基检测腐皮病病原，嗜水气单 胞菌，3 7 。c 培养2 0 2 4 h 后，该菌落呈黄色，其它菌落呈另外的颜色。这个方法 制作容易，使用方便。可是在选用培养基时，温度和时间要求较为严格，培养时 间较长，只能用于粗略检测，精确度不高。 1 2 2 免疫荧光技术( i m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n i q u e ) 检测法 免疫荧光技术又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的 基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术就是利用抗原抗体反应原理，将不 影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体( 或抗原) 上，与其相应的抗原( 或抗体) 结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。因为荧光色素不但能与抗体 球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或 定位抗体，因此该法在鱼类疾病诊断上得到了广泛应用。该技术的主要特点是： 特异性强、敏感性高、速度快。但是非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定 的客观性不足，技术程序也还比较复杂。 吴淑勤等【2 5 】和高汉娇等2 6 1 都先后用此法检测出嗜水气单胞菌，其准确率和 检测率都较高。 1 2 3 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 检测法 e l i s a 是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。它是 以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相 结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体 聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多 余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。 钱冬等2 7 1 用此法检测出了细菌性败血症病原嗜水气单胞菌，整个过程只用 了1 5 小时左右： 1 2 4 点酶联免疫吸附试验( d o t - e l i s a ) 检测法 d o t - e l i s a 与e l i s a 相似，只是将固相载体变为硝酸纤维素膜( n c m ) 。刘 颖【2 8 】应用d o t - e l i s a 技术检测了嗜水气单胞菌等鱼类致病菌，结果也表明该法 重复性好，特异性较强，可同时检测大量的样品，并在3 - 4 h 内即可得出结果。 d o t - e l i s a 检测法为诊断淡水鱼暴发性传染病提供了一种快速、敏感、可靠的 6 检测手段。 1 2 5 单克隆抗体技术( m o n o c l o n a la n t i b o d yt e c h n i q u e ) 检测法 单克隆抗体是指由一个b 淋巴细胞分化增殖的子代细胞产生的针对单一抗 原决定簇的抗体。单克隆抗体技术是由k o m e r h 和m i l s t e n 在1 9 7 5 年创立的。此 技术具有特异性强，亲和性一致和识别单一抗原决定簇的特点，因此在疾病诊断 上发挥了重要作用。 陈琼等【2 明从致病性嗜水气单胞菌培养上清液中，提取了一种外毒素h e c ， 用毒素包板的间接e l i s a 法筛选到九株抗毒素的单克隆抗体，其中8 株单克隆 抗体能特异性地抑制h e c 毒素的溶血活性，溶血抑制效价为1 ：3 2 1 ：2 5 6 ，用其 中的1 8 4 株5 e 3 株建立d o t - e l i s a 检测h e c 毒素，从病鱼分离的9 5 份细菌培 养上清液中检测阳性率为7 6 ，敏感性高于同步进行的常规血清。 1 2 6 聚合酶链反应( p o l y m e m s ec h i nr e a c t i o n ，p c r ) 检测法 p c r 技术是美国科学家k b m u l l i s 于1 9 8 3 年发明的一种体外扩增特定基因 或d n a 序列的方法，在某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有 极为重要的应用价值。 其基本原理为：双链d n a 分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链 d n a 分子( 变性) ，与待扩增片段两端互补的寡核苷酸( 引物) 分别与两条单链d n a 分子两侧的序列特异性结合( 退火、复性) ，在适宜的条件下，d n a 聚合聚利用反 应混合物中的4 种脱氧核苷酸( d n t p ) ，在引物的引导下，按5 3 的方向合成互 补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个p c r 循环。随 着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量 按2 n 方式增长。从理论上讲，经过2 5 3 0 个循环后d n a 可扩增1 0 6 1 0 9 倍。 h o w a r d 等和p o l l a r d 等例都利用p c r 技术，成功地扩增出嗜水气单胞菌 的毒力因子，并显示其具有很高的特异性和灵敏度。 除上述之外，还有a p i 2 0 e 、a p i 5 0 e 试剂条和v i t e k 系统都可对嗜水气单 胞菌进行检测。 当然，这些方法也存在着许多不足，所以在实际工作中，应根据具体的情况 选择相应的检测方法进行检测，在不断的实践和摸索当中使这些方法达到完善。 7 1 3 鱼病的免疫防治 由于传统化学药物防治该病效果较差并引起环境污染等问题，因此开展免疫 防治，开发高效、安全的疫苗成为必需。有报道的或正在研究的疫苗有：全菌灭 活苗、减毒活疫苗、菌体成分亚单位疫苗和正处于探索阶段的基因工程疫苗和 d n a 疫苗。 1 3 1 全茵灭活苗 陈月英等【3 1 l 选择对养殖鱼类致病的嗜水气单胞菌强毒株，用福尔马林以 o 0 5 1 o 的6 个浓度及4 、2 5 和6 3 等3 种温度灭活制成菌苗，进行安全性和 免疫保护试验；并取得良好的免疫效果。同时，他还发现用嗜水气单胞菌全菌苗 及菌体超声波破碎苗腹腔注射免疫鲫，全菌苗免疫保护率为1 0 0 ，破碎菌体保 护率为8 0 。比较全菌苗、胞外产物苗和菌细胞苗的免疫效果，以全菌苗最佳。 1 3 2 减毒活疫苗 k a r u n a s a g a r 等【3 2 】将嗜水气单胞菌溶血素缺失突变株活菌分别用浸浴、注射、 高压浸浴三种途径免疫鲤鱼，结果都检测到了较高的抗体水平，免疫保护实验结 果也显示免疫鱼对同源菌株的攻击免疫保护率在8 0 以上，而异源菌攻击后的 成活率在5 0 左右。 1 3 3 菌体成分亚单位疫苗 孙建和等【3 3 1 将嗜水气单胞菌j 1 株提纯的外毒素和l p s 按1 ：1 3 的比例偶联 制备压单位疫苗，同源攻击结果显示，该疫苗对小鼠的保护率为1 0 0 ，对鲫鱼 的保护率为8 3 。同样，r a h m a n 等用提纯的嗜水气单胞菌的外膜蛋白免疫金 鱼，使金鱼产生了很好的保护性免疫效果。 1 3 4 新型疫苗的研究 w o n g 等【8 1 和h e m a n z 等分别构建出嗜水气单胞菌溶血素基因灭活苗和气 溶素基因减毒苗，都有一定的免疫保护效果。而s o m m e r s e t 等制作了新一代的 d n a 疫苗，可能为防治嗜水气单胞菌病带来新的思路和方法。 总体而言，嗜水气单胞菌疫苗的制备和效果都已经不成问题，问题在于，水 产动物本身及其栖息环境的特殊性大大限制了有关疫苗的临床应用，包括嗜水气 单胞菌在内的水产动物疫苗的最终推广应用，还需要做进一步的探索。 1 4 研究目的与意义 ， 本文由两个内容所组成，一是研究养殖条件的变化对嗜水气单胞菌致病性的 影响规律，二是研究了7 8 株气单胞属菌的毒力因子的分布，并且对其中的6 4 株菌 做了药物敏感性的研究。 众所周知，鱼病的发生是宿主、病原和环境三者相互作用的结果。在这三种 关系中，环境对鱼类免疫功能的影响、病原对鱼类的致病性及致病机理等两个方 面的研究相对较多，且有比较深刻的认识。然而，有关环境条件对细菌的影响却 鲜有研究，知之甚少。环境对病原的影响至少包括两个方面，一是对细菌生态学 分布的影响，这方面也有比较多的研究；另一方面环境对细菌毒力基因的表达也 有影响，进而影响随后感染的发生以及细菌的致病性，这类研究非常缺乏。例如， 嗜水气单胞菌在低水温条件下不引起鱼病，但其中的机理还不甚明确，在低温条 件下细菌到底是不具有感染力还是不产生毒力? 开展环境对细菌毒力基因表达 的研究，将有助于阐明细菌的流行病规律、嗜水气单胞菌感染的发生机理，以及 提供有效的生态学防治措施。为此，本文将研究温度和p h 这两种常见的环境因 子的变化对嗜水气单胞菌四种与侵袭、毒性有关的毒力基因表达的影响，以期能 初步了解养殖条件的变化对嗜水气单胞菌致病性的影响规律。 另外，通过了解毒力基因在气单胞属菌环境分离株中的分布情况，能更好地 阐明和分析气单胞菌相关疾病的流行病学。同时，通过对气单胞菌耐药状况的调 查，不仅可以了解我国水产养殖系统中细菌耐药的状况，还可以为正确防治嗜水 气单胞菌病的发生在药物选择方面提供参考。 第二章温度和p h 值对嗜水气单胞菌毒力基因 表达的影响 嗜水气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) 属于弧菌科、气单胞菌属，是嗜温、有 动力的气单胞菌，它普遍存在于水体和土壤中，是自然生态系统和水生动物肠道 正常菌群的成员。嗜水气单胞菌有致病性和非致病性菌株之分，致病性菌株在某 些特定条件下，可以引起鱼类等多种水产动物的暴发性感染，属于典型的条件致 病菌，往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失【37 1 。嗜水气单胞菌具有多种毒力因 子，包括：粘附素( a d h e s i o n s ，a h a ) 、侵袭素( i n v a s i o n s ) 、肠毒素( e n t e r o t o x i n s ) 、 溶血素( h e m o l y s i n ，a h h ) 、气溶素( a e r o l y s i n ，a e r a ) 、外膜蛋i 刍( o u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s ，o m p ) 等，这些毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用。 众所周知，鱼病的发生是宿主、病原和环境三者相互作用的结果。在这三种 关系中，环境对鱼类免疫功能的影响、病原对鱼类的致病性及致病机理等两个方 面的研究相对较多，且有比较深刻的认识。然而，有关环境条件对细菌的影响却 鲜有研究，知之甚少。环境对病原的影响至少包括两个方面，一是对细菌生态学 分布的影响，这方面也有比较多的研究：另一方面环境对细菌毒力基因的表达也 有影响，进而影响随后感染的发生以及细菌的致病性，这类研究非常缺乏。例如， 嗜水气单胞菌在低水温条件下不引起鱼病，但其中的机理还不甚明确，在低温条 件下细菌到底是不具有感染力还是不产生毒力? 开展环境对细菌毒力基因表达 的研究，将有助于阐明细菌的流行病规律、嗜水气单胞菌感染的发生机理，以及 提供有效的生态学防治措施。为此，本文将研究温度和p h 这两种常见的环境因 子的变化对嗜水气单胞菌四种与侵袭、毒性有关的毒力基因表达的影响，以期能 初步了解养殖条件的变化对嗜水气单胞菌致病性的影响规律。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 4 1 ) 由本实验室分离并保存，分离自罹患出血性败血症 的鲢鱼等f 2 1 。日常培养使用t s b ( t r y p t i cs o yb r o t h ) 或t s a ( t r y p t i cs o ya g a r ) j 精 基，培养温度为2 5 c 。 l o 供试鲫鱼由中国科学院水生生物研究所关桥渔场提供，体重为2 0 a ：0 3 5 9 ，经 至少2 周的室内( 7 9 c ) $ 1 1 养后用于实验，每天投喂适量的饲料。， 所有试验在塑料水族箱( 5 8 c m x 4 7 c m x 3 2 c m ) 进行，每个箱( 水的体积为3 0 l ) 中放入实验鱼1 5 尾，人工充氧，每两天用曝气后的自来水将箱中的水置换约2 1 3 。 对于2 5 的试验，采用人工加热的方式在3 天内，使水温逐渐上升。到达2 5 以后，试验前再进行5 天的适应。注射攻毒以后不再投喂饵料。 2 1 2 细菌基因组d n a 的提取 a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 - 4 - 1 ) 在t s b 培养基中2 5 c ，摇床以2 0 0 r m i n 的转速培养 过夜，取1 5 m l 菌液( 约5 x1 0 6c f u ) 1 3 ，0 0 0 9 离心3 0 s ，收集菌体。利用u l t r a p u r e t m d n a 提纯试剂盒( 上海赛百盛公司) ，提取细菌的基因组d n a ，操作方法按试剂 盒的说明。 2 1 3 p c r 反应 根据d n as t a r 软件设计引物。p c r 反应为2 5 9 l 反应体系，其中含模板d n a 1 p l ，上下游引物各0 5 9 l ，d n t po 5 1 a l ，t a q 酶1 p l ，覆盖矿物油1 0 9 l ，用p t c 1 0 0 p c r 仪( m jr e s e r c h 公司) 进行扩增，每一循环包括9 4 变性3 0 s ，6 0 退火3 0 s ， 7 2 c 延伸2 m i n ，3 9 个循环。根据相应的特异性引物，检测嗜水气单胞菌的溶血 素、气溶素、黏附素、外膜蛋白等四种基因的表达，并以1 6 s 核糖体r n a 基因 作为对照。所有引物的序列见表2 - 1 。， 2 1 4 培养温度和p h 值对细菌毒力基因表达的影响研究 2 1 4 1 r n a 的分离 分别在1 5 。c 、2 5 。c 和3 7 c 下摇床( 2 0 0 r m i n ) 培养至o d 6 0 0 = o 6 0 8 ，用磷酸盐 缓冲液( p b s ) p h 7 0 调整至相同的o d 值。4 c 的细菌按g o n z a l e z s e r r a n o 等【6 1 的方 法制备：接菌于5 m lt s b 中，2 8 c 摇床培养过夜，吸取约5 0 9 l 菌液涂布于t s a 平板上，置4 c 生长1 0 d 。用无菌生理盐水( 0 8 5 ) 洗下菌苔，收集菌液，调整其 o d 值至与其它温度的相同。各取1 5 m l 菌液收集菌体，加l m l 经d e p c ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) 处理的h 2 0 洗涤培养基，以1 3 ，0 0 眙离心l m i n ，除去上清，加7 0 i t l 溶菌酶( 5 0 m g m 1 ) ，并用超声波破碎仪破碎细胞( 冰上) 片刻，放置8 0 。c 冰箱中保 存。然后利用r n a 勘f v 试剂盒( o m e g a 公司) 分离r n a ，按试剂盒提供的方法进 行操作。 吸取适量于2 8 c 培养的菌液，分别加入p h 5 0 、p n 7 0 和p h 9 0 的t s b ( 5 m 1 ) 中，于4 c 下放置1 2 h 后，按上述相同的方法收集菌液和分离r n a 。 对每次提取的r n a 样品均使用引物1 6 s r r n a f 1 6 s r r n a - r 进行p c r 检测， 均没发现扩增产物，说明提取的r n a 中无基因组d n a 污染。 2 1 4 2 r t - p c r 反应 上述得到的r n a 2 t l ，下游引物2 1 ，d e p c h 2 09 “l ，混匀，7 0 c 培养5 m i n 后立即放至冰上，上述混合物中再加入m m l v5 b u f f e r5 u l ，d n t p s2 5 1 a l ， d e p c h 2 02 5 h l ，r n a s i n1 p l ，m - m l v 反转录酶1 1 t l ，混匀，4 2 c 延伸1 h ，即 得e d n a ，然后根据2 1 3 的反应体系进行p c r 扩增反应。 2 1 5 培养温度和p h 值与细菌致病性的关系研究 2 1 5 1 培养温度与细菌致病性的关系研究 2 1 5 1 1 菌液和细菌胞外产物( e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t s ，e c p ) 的制备 将a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 - 4 - 1 ) 接种于t s a 平板上，分别于1 2 c 和2 5 c 培养2 d 和1 d 。用无菌的生理盐水洗下菌苔，并调整其浓度为1 x 1 0 9 c f u m l ，然后1 2 ，0 0 0 9 离心1 m i n 沉淀菌体，上清液经灭菌的孔径为o 4 5 i t m 的纤维素膜过滤，得到的 即为e c p ，供下一步实验用。另外，用生理盐水将上述沉淀的菌体悬浮，再以相 同步骤洗涤一次，最后将菌体浓度调整到1 07 c f u m l ，用于下一步的攻毒试验。 2 1 5 1 2 攻毒试验 实验分为8 组，分组情况见表2 2 。将分别在1 2 和2 5 条件下培养、制备 的e c p 和细菌菌体，分别以o 2 m l 尾的剂量经腹腔注射3 0 尾鲫鱼，分别放养于 2 5 c 控温和未控温( 水温为7 - 9 c ) 的塑料水族箱中，每组含有2 个塑料水族箱。 观察并记录7 天内各组的死亡数，计算死亡率。每天至少检查2 次，及时捞出死 鱼。 2 1 5 2 p h 值与细菌致病性的关系研究 分组情况见表2 3 ，将a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 4 1 ) 分别接种于2 支t s a 斜面培养 基，2 5 c 培养1 6 1 8 h ，分别用p h 7 0 和p h 9 0 的p b s 洗下菌苔，室温下放置2 h ， 离心并去上清液后分别用p h 7 0 和p h 9 0 的p b s 缓冲液将菌体浓度调整到 1 07 c f u m l ，用于下一步的攻毒试验。每条鱼腹腔注射0 2 m l 的菌液，每组3 0 尾， 1 2 水温为2 5 c 。另设立1 对照组，采用相同方法和剂量注射p h 90 的p b s 。 表2 1 本研究中所检测的基因及所用的p c r 引物 t a b2 1g e n e ss t u d i e da n dp r i m e r su s e di nt h i ss t u d y 2 2 结果 2 21 毒力基因的检测 经p c r 检测，证实a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 - 4 一1 ) 基因组中存在a h h 、a e r a 、o m p 、 a h a 4 个毒力基因。扩增出的片段大小与预期的相同，分别为3 0 9 b p 、3 0 9 b p 、9 3 3 b p 、 1 0 8 2 b p 。作为对照的1 6 sr r n a 基因也扩增出了与预期大小相同的片段( 3 5 6 b p ) ( 图 2 1 、。 2 0 0 0 1 0 0 0 7 5 0 5 0 0 2 5 0 1 0 0 b p m a r k e ra h ha e r ao 御a h a1 6 sr r n a 图2 - 1 a h y d r o p h i l a ( x s 9 1 - 4 - 1 ) 基因组中4 种毒力基因的p c r 检测结果 f i g 2 1t h e d e t e c t i