（有机化学专业论文）荧光光谱法在生化分析中的应用研究.pdf

摘要 荧光光谱法作为一种重要的现代仪器分析方法，从2 0 世纪以来 得到了长足发展，理论日益丰富，技术日益成熟和多样化。它具有灵 敏度高、选择性强、用量少、方法简便、信息多样等优点，因而被广 泛应用于化学、医学、药学、生物学、考古学、矿物学、环境科学等 领域。 本学位论文利用荧光光谱法对一些蛋白质、药物、核酸、氨基 酸、维生素及它们的相互作用进行了创新性研究。 1 研究了牛血清白蛋白( b s a ) 在十六烷基三甲基溴化铵 ( c t a b ) 反相胶束中的荧光性质，探讨了微环境对b s a 荧光强度的影 响。发现在c t a b 反相胶束中，c d s 纳米粒子与b s a 之间存在能量转 移，导致b s a 荧光强度发生猝灭，猝灭程度与c d s 纳米粒子浓度在 5 0 1 0 。l 一3 0 1 0 “m o l l 范围内存在线性关系，猝灭常数为1 3 2 1 0 4l m o l 。 2 首次利用酪氨酸作为荧光探针研究d n a 。通过荧光猝灭法发现 酪氨酸的荧光强度比值刚户与鲑鱼精子d n a ( s md n a ) 的浓度在 7 8 0 1 0 一一1 2 5 1 0 1m o l l 范围内存在线性关系，检测下限为 1 1 8 1 0 m o l l 。讨论了p h 值及盐效应的影响。通过一系列实验发 现酪氨酸与s md n a 以沟槽模式结合。通过新推的荧光方程求算出两 者之间的结合常数为2 2 4 1 0 6l m o l ，结合比为0 8 1 。 3 利用硫脲嘧啶( t u ) 对牛血清白蛋白( b s a ) 内源荧光的猝 灭，发现两者结合比为1 ：1 ，结合常数为1 3 5 1 0 5l m o l 。由 f s r s t e r 能量转移理论求算出t u 与b s a 中色氨酸( t r p ) 残基之间距 离为0 9 5r i m 。由推算出的热力学常数可知两者结合是吸热反应，结 合过程伴随着熵的增加。 4 研究了在聚亚甲基蓝修饰的玻碳电极上盐酸吡哆辛( 维生素 b 6 ) 的电化学氧化一还原过程。研究表明，阳极峰电流与维生素b 6 的 浓度在0 0 1 0 1 0 3m g m l 范围内存在线性关系，检测下限为1 3 4 g g m l 。通过荧光光谱电化学和紫外一可见光谱电化学方法研究，发现 维生素b 6 的氧化导致吡哆醛的生成，但毗啶环并未被破坏。 关键词：荧光光谱，生化分析，猝灭，光谱电化学 a b s t r a c t s i n c et h e2 0 m c e n t u r y ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a lm e t h o d ( f s m ) ，a so n eo f l m p o r t a n t m o d e r ni n s t r u m e n t a l a n a l y s i st e c h n i q u e s ，h a sb e e nr a p i d l y d e v e l o p e d i t st h e o r y w a s g r a d u a l l ya b o u n d i n g ，a n d i t s o p e r a t i n g t e c h n i q u ew a sg r a d u a l l ym a t u r ea n dd i v e r s i f i e d h i g h s e n s i t i v i t y a n d s e l e c t i v i t y ，s m a l lc o n s u m p t i o n ，s i m p l eo p e r a t i o na n d m u l t i p l ei n f o r m a t i o n d a t aa r et h ev i r t u e so ft h em e t h o d s oi th a sf o u n dw i d ea p p l i c a t i o n si n v a r i o u s f i e l d s ，i n c l u d i n g c h e m i s t r y ，m e d i c i n e ，p h a r m a c y ，b i o l o g y ， a r c h a e o l o g y ，m i n e r a l o g y ，a n de n v i r o n m e n t a ls c i e n c e r e s e a r c h e sb yf s mi nt h et h e s i sa r eg i v e na sf o l l o w sf o rs o m e p r o t e i n ， p h a r m a c e u t i c a l s ，n u c l e i ca c i d s ，a m i n oa c i d s ，v i t a m i na n d t h e i ri n t e r a c t i o n ： 1 t h ef l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e s o fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) i n c e t y t t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) r e v e r s e d m i c e l l e sw e r e r e s e a r c h e d ，a n d t h ee f f e c to ft h em i c r o e n v i r o n m e n to nf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo fb s a w e r es t u d i e d e n e r g yt r a n s f e ro c c u r r e db e t w e e nc d s n a n o p a r t i c l e sa n db s a i nc t a br e v e r s e dm i c e l l e s w h i c hr e s u l t e di nt h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yq u e n c h i n g o ft h e l a t t e r t h e q u e n c h i n gd e g r e e i n c r e a s e d l i n e a r l y w i t h i n c r e a s i n g t h ec o n c e n t r a t i o no fn e g a t i v ec d s n a n o p a r t i c l e s o v e rt h e r a n g eo f5 0 1 0 3 0x 1 0 m o l l a n dt h e q u e n c h i n g c o n s t a n te s t i m a t e dw a s1 3 2 1 0 4l m 0 1 2 t y r o s i n ew a s f i r s tu s e da st h ef l u o r e s c e n c ep r o b ef o rd n a r e s e a r c h f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tf d fo f t y r o s i n ew a sl i n e a r w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fs a l m o n s p e r md n a ( s md n a ) f r o m 7 8 0 10 。 o t o1 2 5 1 0 m o l l w i t had e t e c t i o n1 i m i to f1 1 8 1 0 m 0 1 l t h ep h a n ds a l te f f e c t so nt h ef l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h e i n t e r a c t i o nm o d e lb e t w e e nt y r o s i n ea n dd n aw a sf o u n dt ob eag r o o v e b i n d i n gb y as e r i e so f e x p e r i m e n t s t h ei n t r i n s i cb i n d i n gc o n s t a n ta n d t h e b i n d i n gs i t e n u m b e rw e r ed e t e r m i n e dt ob e2 2 4 10 6l m o la n d0 8 1 ， a c c o r d i n g t ot h e n e w l y d e d u c e df l u o r e s c e n c e e q u a t i o n 3 t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) b y t h i o u r a c i l ( t u ) w a si n v e s t i g a t e d t h eb i n d i n g r a t i ob e t w e e nb s aa n dt u a n dt h e b i n d i n gc o n s t a n tw e r ef o u n dt o b e1 ：1a n d1 3 5 10 5l m 0 1 r e s d e c t i v e l y t h ed i s t a n c eb e t w e e n t ua n dt h et r pr e s i d u eo fb s a w a s d e t e r m i n e dt ob eo 9 5 n ma c c o r d i n gt ot h ef 6 r s t e rt h e o r y f o re n e r g y t r a n s f e r 。t h et h e r m o d y r n a m i c f u n c t i o n so ft h eb i n d i n gr e a c t i o n w e r e m e a s u r e d g i v i n gt h a t t h et u b s ab i n d i n gi s a ne n d o t h e r m i cr e a c t l o n t h a ta c c o m p a n i e se n t r o p yi n c r e a s e 4 t h er e d o xp r o c e s s e so fp y r i d o x i n eh y d r o c h l o r i d e ( v i t a m i nb 6 ) a t a d o l y ( m e t h y l e n eb l u e ) f i l m m o d i f i e dg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e ( p m b e ) w e r e s t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d t h e a n o d i cp e a kc u r r e n t w i t sf o u n dt o b ep r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o n o fp y r i d o x i n eh y d r o c h l o r i d ef r o m 0 0 1t o1 0 3m g m l ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f1 3 4 g g m l f l u o r e s c e n c e a n du v v i sa b s o r p t i o ns p e c t r o e l e c t r o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ep y r i d i n er i n gw a s n o td e s t r o y e d ，a n dt h ep y 。i d o x a l w a sg e n e r a t e dd u r i n g t h eo x i d a t i o no fv i t a m i nb 6 k e y w 。r d s ：f l u 。r e s c e n c e s p e c t r u m ，b i o c h e m i c a l a n a l y s i s ，q u e n c h i n g ， s p e c t r o e l e c t r o c h e m i s t r y 1 1 1 第一章前言与综述 第一章前言与综述 荧光光谱法是- - ；e e 历史悠久、目前技术较成熟的分析方法。它具 有灵敏度高、选择性强、用量少、方法简便、信息多样的特点，在化 学、生物学、药学、临床医学、环境科学中应用广泛。 一、荧光光谱法基本概念“。” 早在1 6 世纪，人们就发现荧光的存在。当时人们从植物抽提液 和矿物中观察到荧光的发射。1 8 5 2 年，s t o k e s “3 阐明了荧光发射的机 理，他认为荧光不是由于光的漫散射所引起的，而是由于物质吸收了 光能后重新发出不同波长的光线。因此，荧光可被定义为：当用一种 波长的光( 如紫外光) 照射某物质时，此物质在极短时间内( 通常在 1 0 一一1 0 。9 s 内) 发射出较发射光波长更长的光( 如可见光) 。 在吸收光的过程中，光能被转移给分子。根据量子理论，分子从 光波中吸收能量必定是以不连续的、整份单位的形式发生，这些不连 续的微小能量单位被称为量子。每个量子的能量 e = hu = h c 每个分子具有一系列严格分立的能级，处于基态的分子吸收特征 频率的能量以后，可以从低能级跃迁到高能级。被吸收的光量子的能 量正好等于两个能量之差。 j l 跃j 巳 吸 迁帑 。 光 钉删麓儿。腓： l li f i g u r ei 一1 t h es k e t c hm a po fe n e r g yt r a n s f e rf o ra b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a 第一章前言与综述 图卜1 为分子能级图。g 表示基态，s + 表示第一电子单线激发态， s ”表示第二电子单线激发态，t + 表示第一电子三线激发态。基态和激 发态都有几个不同的振动能级，图中用d = o ，1 ，2 ，3 表示。当光量 子打到分子上时，电子从基态跃迁到能量比较高的单线电子激发态 s + 或s ”等。跃迁后，能量较大的激发态分子，通过内转换过程把部分 能量转移给周围分子( 如溶剂分子j ，自己回到最低电子激发态的最 低振动能级。此时分子再通过发射出相应的光量子来释放能量，回到 基态的各个不同振动能级时，就发射出荧光。荧光光谱具备以下三个 特征：激发光谱的形状和吸收光谱极为相似：发射光谱的形态和激发 光的波长无关；发射光谱的形状和吸收光谱极为相似，且基本上呈镜 象对称关系。 荧光分析能提供较多的物理参数，这些参数不但可作一般定量的 测定，还可以推断分子在各种环境中的构象变化，从而了解分子的结 构与功能的关系。通常荧光分析的参数有：激发光谱，发射光谱， s t o k e s 位移，荧光强度，量子产率，荧光偏振值，荧光寿命等等。 其中，以荧光强度f 利用最广。当溶液浓度较小时，荧光强度与物质 的浓度呈线性关系，f = k c 。 荧光分析的手段虽然较多，但从分析方法上来说，大致可分直接 测定与间接测定两大类。直接测定是利用物质自身发射的荧光，即所 请“内源荧光”来进行测定的，故其分析受到一定限制；间接测定是 利用某些试剂( 如荧光染料) ，使其与荧光较弱、或不显荧光的物质 共价或非共价结合，以形成发荧光的结合物等再进行测定，这种方法 又叫“外源荧光”法或“荧光探针”技术，荧光探针的使用为一些原 来不能用荧光分析的物质打开了方便之门。除上述两种方法外，近些 年发展很快的荧光猝灭法也经常应用于一些物质的定量或定性分析。 荧光光谱分析法在实际操作中受到多种因素的影响，掌握好这些 因素，对完成分析任务至关重要。首先要注意溶剂的影响，一是溶剂 的选择要适宜，二是溶剂应达到足够的纯度；其次要避免荧光污染； 第三要注意表面吸附、氧化和光分解等干扰；第四要考虑温度、溶液 p h 值、溶液粘度的影响；第五要防止光散射与荧光猝灭( 荧光猝灭 分析法除外) 。在实际工作中，情况常常是很复杂的。对于不同样品 来说，各种因素的影响程度也不一。样，采取合理措施排除影响，才能 得到正确的测定结果。 二、荧光光谱法的应用 第一章前言与综述 2 1 无机物的荧光光谱分析 含有c e ”离子的稀h 。s o 。或b c i o ，溶液在2 5 4n m 氙射线照射下会产 生紫外区荧光，荧光峰在3 5 0n m n 。但此类“直接荧光法”测定无机 化合物并不多见，因为大多数无机化合物在紫外光照射下不能发射荧 光。自1 8 6 8 年发现桑色素与a r 离子的反应物会发生亮绿色荧光“3 以来，无机化合物的荧光分析有了很大发展，目前一般可分为三类： 1 无机元素与有机试剂组成会产生荧光的络合物，由荧光强度可以测 定该元素的含量。例如：l ，1 ，3 - 三氰基一2 一氨基- 1 - 1 丙烯( t r i a p ) 曾用于生物物质中微量铜的测定；3 ，6 - - - 羟基一2 ，4 一双 n ，n 二( 羧甲基) 一氨甲基 荧烷( 钙试剂) 与c a 2 + 组合物的络合物发出蓝 绿色荧光，荧光强度与c a 2 + 离子浓度呈线性关系。2 无机元素与有 机试剂结合后导致该有机试剂的荧光强度降低或猝灭。例如：2 ，3 一 萘三氮杂茂水溶液( p h 值为1 0 。5 ) 的荧光强度随a f 离子浓度的增大 而减弱可用于测定微量银。3 ；荧光素一醋酸汞的碱性溶液，在加入s 2 一 离子后，荧光强度减弱，可用于测定微量硫“”“。3 在微量金属离子 的催化作用下，荧光反应加速或荧光强度猝灭，可测定该金属离子的 浓度。例如：微显f e ”离子存在时，a 1 ”离子和滂铬蓝黑r 染料( p b b r ) 所组成的络合物的荧光强度发生猝灭，可用于测定试样中铁含量“。 2 2 有机物的荧光光谱分析 有机物的荧光性质与其结构和环境有密切关系。脂肪族有机物分 子结构简单，绝大部分自身不能产生荧光，故多采用间接法测定；芳 香族化合物具有共轭的不饱和结构，大多能产生荧光。能够产生荧光 的有机物一般具备以下几个条件：1 具有共轭双键，体系中电子共 轭度越大，非定域竹电子越易被激发，荧光也就越易产生：2 具有刚 性的平面结构；3 芳香族化合物的芳香环上有适当的取代基，一0 h 、 n h 。、一n h r 、- n r 。、- c n 、一o c h 。一般使荧光强度增强，一c o o h 、一c = o 、 一n o ：、一n o 、一s h 、一f 、一c 1 、- b r 、一i 一般使荧光强度减弱，一s o a h 、一n h ； 则影响不明显；4 处于适当的环境，如溶剂、温度、p h 值，一般来说， 随溶液温度的降低和溶剂极性的增大，量子效率和荧光强度增大。 有机荧光物按结构大致可分为三类：1 具有刚性结构的芳香稠环 化合物。近年来，这方面的研究主要集中在芄“叫及其衍生物上，晕苹 “较荛的共轭程度及分子刚性等更大，具有更优秀的荧光性能，是非 常理想的u v - c c d 材料。2 具有共轭结构的分子内电荷转移化合物。 这是目前研究得最为广泛和活跃的一类，包括芪类化合物”，吡唑啉 第一章前言与综述 衍生物“，蒽醌衍生物“，罗丹明类衍生物3 等。3 金属配合物，如 8 一羟基喹啉是一个在分析中常用的配位试剂，可与a 1 、b e 、g a 、i n 、 z n 、z r 等金属离子形成刚性荧光络合物。 2 3 荧光光谱法在生化分析中的应用 2 3 1 维生素的检测 维生素是人体必需的营养物质，对人体的新陈代谢和生理机能具 有重要的调节作用。它们大多含有芳香环结构，是首先用荧光方法测 定的生物物质之一。各种维生素中，有的能发射荧光，可用直接法测 定，如维生素a n 9 3 、b 2 1 、b 6 1 、b 。：呲1 、c 、d t 2 4 1 和e c 2 s ? 等，有的则不 能产生荧光，须用间接法测量，如维生素b 。“、k t m 和fc 2 8 1 等。 为了克服荧光法本身存在的一缺点与限制，各种新的荧光分析方 法和技术陆续发展起来，大大拓宽了荧光分析法的应用范围。例如： 光化学荧光分析法测定维生素b 和b 。”，荧光反应速率法测定维生素 b 。”0 1 ，导数一同步荧光光谱法同时测定维生素b 、b 2 和b 。“，人工神经 网络一荧光光谱法同时测定维生素b 。、& 和be 3 2 等。 2 3 2 药物分析 在药物分析学中，荧光光谱分析和紫外光谱分析、气相、液相色 谱分析同为药物分析的基本技术。奎宁是最早采用于荧光分析的抗疟 药品。州。自2 0 世纪7 0 年代以来，各种灵敏度高的荧光分析法已有效 用于制剂和生物体液中药物的分析。荧光分析法应用于药物分析不仅 大大降低了分析成本，简化了分析手续，而且改善了分析条件，拓展 了荧光分析的应用领域。 例如同步扫描荧光技术可用于违禁品中苯丙胺和吗啡加奎宁”刮 的测定。荧光偏振免疫分析可用于血清中的庆大霉素、地谷新、茶叶 碱、苯巴比妥和五巴比妥“”等多种药物的检测，及烧伤患者体内萘替 米星的药代动力学研究。特异性荧光偏振免疫法可监测肾移植后环 孢素a 全血浓度。荧光猝灭法可测定苦参碱和氧化苦参碱的含量。固 体表面荧光测定已用于血清中茶叶碱醴7 1 及其它多种抗菌药、抗气喘病 药和抗惊风病药等的临床荧光分析。电解荧光光度法测定片剂中卡马 西平的含量。另外，近年来荧光光谱法亦用于研究连翘苷与金属离 子e u ”、m n 2 + 的配位作用、人尿中美芬妥英对映体的测定、血清中地高 辛等免疫活性物质以及毗柔比星注射液、萘普生胶囊、萘替米星注射 液和盐酸环丙沙星软膏。卯的含量测定。 第一章前言与综述 药物分子与血清白蛋白相互作用的研究是介于化学与生命科学 之间的边缘性课题，属于化学生物学的范畴。血清白蛋白与药物结合 反应的研究主要包括结合位置、结合位点数与结合常数、作用力类型、 共存物影响以及药物在血液中的分配等。用荧光法研究药物分子与蛋 白质的结合反应可以综合利用蛋白质和药物的荧光猝灭、荧光敏化、 能量转移和实验条件的影响等多方面的信息。如：通过f s r s t e r 能量 转移理论求算药物与氨酸残基之间的距离“”1 “；s c a t c h a r d 作图法研 究蛋白质分子与药物小分子的结合常数及结合位点数“；根据反应前 后热力学焓变h 和熵变s 的相对大小，可以判断药物与蛋白质之 间的主要作用力类型“。 2 3 3 氨基酸和蛋白质的荧光分析 所有氨基酸只有色氨酸、酪氨酸、苯丙氮酸有内源荧光。色氨酸 激发峰在2 8 7n m ，发射峰在3 4 8n m ；酪氨酸激发峰在2 7 5n m ，发射 峰在3 0 3n m ；苯丙氨酸的激发峰在2 6 0n m ，发射峰在2 8 2n m “。三 者荧光发射光强度之比为1 0 0 ：9 ：0 5 。其他氨基酸只能借助于“外 源荧光”进行间接测量。例如：甘氨酸与7 氯一4 一硝基苯曙二唑反应 生成强荧光的产物，用4 6 4n m 射线激发即可观察到产物的荧光，能 检出0 3n g m l 的甘氨酸“。 蛋白质常吸收2 7 0 3 0 0n m 紫外区而产生紫外光荧光，这是由于 蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸的缘故。现代蛋白质的研究多用荧光 探针技术。该技术最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范 围。测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长，位移及量子 产率的变化，可探知其所处微环境的极性及其有关性质。荧光探针试 剂包括有机试剂和稀土离子试剂。最常用的有机荧光试剂有卜苯胺 基萘一8 一磺酸( a n s ) ，2 - 对甲胺萘一6 一磺酸( 2 ，6 - t n s ) 和卜n ，n 一二 甲胺基萘一5 一磺酸( 1 ，5 - d n $ ) 等。如p r a s a d 用b i s - a n s 作荧光探针 研究微管蛋白( t u b u l i n ) h ”，证明b i s a n s 与蛋白质结合后，蛋白 质上的t r p 残基可将吸收的能量无辐射地转移到b i s a n s 上； a r b e l a e z 用b i s a n s 作荧光探针研究了孕区蛋白( p z p ) 的构象“。 e u ( i i i ) 和t b ( i i i ) 是最常用的两种稀土荧光探针，其荧光光谱的 高灵敏性和不同环境的明显影响，使得它们成为研究蛋白质的有效探 针。如m u l q u e e n 等利用e u ( i i i ) 研究钙调蛋白，结果表明e u ( i i i ) 和钙调蛋白有两个强结合部位和两个弱结合部位”；h o r r o c k s 等测得 嗜热菌蛋白酶中t r p 残基与结合的t b ( i i i ) 间距离为0 9 9 n m ”。 第一章前言与综述 2 3 4 核酸的荧光分析 水溶液中的天然碱基和核酸的荧光量子产率非常低，一般仪器不 能检测到它1 1 的荧光。检测它们最好的方法是利用各种荧光探针。 1 9 6 4 年发现溴化乙锭( e b ) ”0 1 ”与核酸结合后，荧光显著增强，随即 e b 被广泛使用。荧光衍生法可为研究核酸提供灵敏的探针，但操作 和繁琐，应用受到一定限制瞄”3 。近年来，利用核酸对小分子荧光探 针的荧光增强或荧光猝灭作用来研究小分子探针和d n a 的相互作用 或进行核酸的定量分析已成为核酸荧光分析的主要手段。加入核酸使 其荧光增强的荧光探针有：l a ( 1 1 1 ) 一8 - 羟基喹啉络合物畸、t b ( 1 1 1 ) 一邻菲咯林络合物“、e u ( 1 1 1 ) 一四环素络合物”、3 5 - - - 氨基苯甲酸 ”、4 6 一二脒基一2 一苯基吲哚( d a p i ) 哺、卜二甲胺基萘- 5 - 碘酰鱼精 蛋白( d n s p ) 晒、二聚体吖啶橙( a o a o ) 一s d s “0 1 ，小蘖碱隋“、二苯并 咪唑染料h o e c h e s t3 3 2 5 8 哺“、依沙吖啶踟等。加入核酸使其荧光猝灭 的荧光探针有：c e ( i i i ) 阳“、t b ( 1 1 1 ) 一钛铁试剂( t r ) 络合物哺、 m e s o 一四( 对一三甲基氨基) 卟啉( t a p p ) ”、邻菲咯林哺“、藏红t ( s t ) “、而 尔蓝( n b ) 6 9 3p h o s p h i n3 r ( p r ) ”1 、3 一m e t h o x y b e n z a n t h r o n e ( m b a ) ”“、亚甲基兰”“、阿霉素”3 1 、酪氨酸。4 3 等。各种荧光探针， 特别是高灵敏度的荧光探针的发现，为核酸分子的研究拓宽了思路， 现今寻找更为灵敏的荧光探针仍是一个颇具潜力的研究领域。 三、本文构思 荧光光谱应用范围广泛，可以用荧光分析检测的无机物、有机物、 生物体系和药物等的数目与日俱增。荧光分析法已成为分析化学中的 一种重要分析方法。除了单独作为一种物质定性定量的分析技术外， 荧光光谱法还可以与其他技术联用，以获得更多的信息，拓展应用领 域。例如：荧光光谱法与色谱联用技术”、与光纤联用技术”、与纳 米技术联合应用于生化分析口“、与电化学技术联用”8 1 等等。这些不同 分析手段和方法的交叉，使荧光光谱法呈现出生机勃勃的研究与应用 前景。 本文首先对荧光光谱法的原理和应用领域作了简要的介绍，然后 分四个部分就荧光光谱法在生化分析中的具体应用进行了研究。 第一部分：研究了牛血清白蛋白( b s a ) 在c t a b 反相胶束中的荧 光特性，探讨了微环境对荧光强度的影响；还就c d s 纳米粒子对b s a 荧光的猝灭进行了讨论。反相胶束可作为细胞的简单模拟体系，这些 第一章前言与综述 工作对于研究在细胞中蛋白质的性质具有一定的意义。 第二部分：利用中性环境下d n a 对酪氨酸荧光的猝灭，研究了 d n a 与酪氨酸的结合方式，求算了结合常数与结合位点数。以酪氨酸 作为荧光探针对d n a 进行直接分析，该方法简便、经济有效，便于操 作。 第三部分：研究了抗甲亢药物硫脲嘧啶( t u ) 对牛血清白蛋白 ( b s a ) 内源荧光的猝灭。两者之间存在能量转移，推算了药物小分 子与蛋白质t r p 残基间的距离及t u 与b s a 的结合常数，结合位点数 以及反应热力学常数等。 第四部分：联用荧光光谱法、紫外一可见光谱与电化学分析方法 研究了维生素b 6 的氧化一还原过程。这种光谱电化学研究方法拓展了 荧光光谱的应用范围，可以可以得到多维信息，对研究、检测维生素 具有重要意义。 参考文献 1 陈国珍，黄贤智，许金钩等，荧光分析法，科学出版社，北京， ( 1 9 9 0 ) 2 郭尧君，荧光实验技术及其在生物分子学中的应用，科学出版社， 北京，( 1 9 8 3 ) 3 赵藻藩，周性尧，张悟铭，赵文宽，仪器分析，高等教育出版社， 北京，( 1 9 9 0 ) ， 4 g s t o k e s ，p h i l t r a n s ，r o y s o c l o n d o n ，1 4 3 ，4 6 3 ( 18 5 2 ) 5 wa a r m s t r o n g ，d w g r a n t ，wg h u m p h r e y s ，a n a l c h e m ，3 5 ， 1 3 0 0 ( 1 9 6 3 ) 6 f g o p p e l s c h r o d e r ，z a n a l c h e m 71 9 5 ( 1 8 6 8 ) 7 k r i t c h i e ，j h a r r i s ，a n a l c h e m ，4 1 ，1 6 3 ( 1 9 6 9 ) 8 d e h w a l l a c h ，d m s u r g e n o gj s o d e r b e r g ，e d e l a n o ，a n a l c h e m ，3 1 ，4 5 6 ( 1 9 5 9 ) 9 g l w h c e l e gj a n d r o j a c k ，j h w i e r s m a ，ef l o t t ，a n a l c h i m a c t a ，4 6 ，2 3 9 ( 1 9 6 9 ) 1o h d a x e l r o d ，j h c a r r y , j e b o n e l l i ，j rl o d g e ，a n a l c h e m ，4 1 ，1 8 5 6 ( 1 9 6 9 ) 11 a g r a n e r t ，k b a l l s c h m i t e r ，g t 6 1 9 ，t a l a r t a ，15 ，4 51 ( 19 6 8 ) 1 2 j b l o c k ，e m o r g a n ，a n a l c h e m ，3 4 ，1 6 4 7 ( 1 9 6 2 ) 【1 3 d i j kv a n ，t m j o o s t ，j o r g c h e m ，6 1 ，l1 3 6 ( 1 9 9 6 ) 第一章前言与综述 1 4 】p _ j j e s s u p ，a u s t j c h e m ，3 0 ，8 4 3 ( 1 9 9 7 ) 1 5 宋波，沈永嘉，荧光增白剂及其应用，华东理工大学出版社， 上海，1 9 9 5 ，p 3 9 1 6 杨国强，吴世康，高等学校化学学报，1 6 ，2 3 9 ( 1 9 9 5 ) 【1 7 】鹏博，上海染料，4 ，3 0 ( 1 9 9 9 ) 【1 8 】j a r d e n ，j l u m i n ，4 8 ，3 5 2 ( 1 9 9 1 ) 1 9 a p a s s a n n a n t e ，l a v i o l i ，a n a l ，b i o c h e m ，1 5 ，2 8 7 ( 1 9 6 6 ) 2 0 赵一兵，余志雄，郭祥群，许金钩，陈国珍，分析化学，2 0 ，1 2 6 1 ( 1 9 9 2 ) 2 1 高海涛，陈晓光，分析化学，1 8 ，3 7 7 ( 1 9 9 0 ) 【2 2 】d d u g g a n ，r b o w m a r , e ta 1 ，a r c h b i o c h e m b i o p h y s ，6 8 ，1 ( 1 9 5 7 ) 2 3 r e n d o ，m e d j m u t u a l a i d a s s ，18 ，2 5 7 ( 1 9 6 9 ) 2 4 s j o n e s ，j w i l k i e ，e ta 1 ，a b s t r a c t s1 3 8 “m e e t i n g a m e r c h e m s o c ， n e wy o r k19 6 0 ，p 6 0 0 【2 5 d d u g g a n ，a r c h b i o c h e m b i o p h y s ，8 4 ，1 1 6 ( 1 9 5 9 ) 2 6 】hn r i d y a r d ，a n a l y s t ，7 5 ，6 3 4 ( 1 9 5 0 ) 2 7 1m k o f l e ，h e l v c h i m a e t a ，2 8 ，7 0 2 ( 1 9 4 5 ) 2 8 t e f r i e d e m a n n ，e i f r a z i e r ，s c i e n c e ，10 2 ，9 7 ( 19 4 5 ) 2 9 郭祥群，许金钩，王晋玲，陈国珍，分析化学，2 0 ，9 1 0 ( 1 9 9 2 ) ， 3 0 杨屹，蔡汝秀，黄厚评，曾云鹗，分析化学，2 1 ，3 6 0 ( 1 9 9 3 ) 3 1 唐波、何锡文、沈含熙、栗风珍、高传喜高等学校化学学报， 1 5 ，9 7 0 ( 1 9 9 4 ) f 3 2 1 吴根华、何池洋光谱学与光谱分析2 3 ，5 3 5 ( 2 0 0 3 ) 3 3 c a ，p a r k e r , wt r e e s ，a n a l y s t ，8 5 ，5 8 7 ( 1 9 6 0 ) f 3 4 1j c a n d r e ，e ta 1 ，a n a l c h i m a c t a ，1 0 5 ，2 9 7 ( 1 9 9 7 ) 【3 5 pk l i ，e ta 1 ，c h i n c h e m ，3 0 ，3 0 ( 1 9 8 4 ) 3 6 1 甄健存，崔世目，中国药学杂志，3 4 ，1 7 4 ( 1 9 9 9 ) 3 7 b w a l t e r ，a n a l c h e m ，5 5 ，4 9 8 ( 1 9 8 3 ) f 3 8 潘祖亭、姚礼峰，分析化学，2 6 ，9 9 7 ( 1 9 9 8 ) f 3 9 1 周采菊，卢宁，郭永思，药物分析杂志，1 8 ，2 0 0 ( 1 9 9 8 ) 。 4 0 p w u ，l b r a n d ，a n a l b i o c h e m ，2 1 8 ，1 ( 1 9 9 4 ) 4 1 谭亮，谢青季，姚守拙，湖南师范大学自然科学学报，2 6 ( 1 ) ，5 9 ( 2 0 0 3 ) 【4 2 】张保林，王文清，白风莲，高等学校化学学报，1 5 ，3 7 3 ( 1 9 9 4 ) 【4 3 】p d r o s s ，s s u b r a m a n i a n ，b i o c h e m i s t r y , 2 0 ，3 0 9 6 ( 1 9 8 1 ) 第一章前言与综述 4 4 f w j t e a l e ，g w e b e r ，b i o c h e m j ，6 5 ，4 7 6 ( 1 9 5 7 ) 4 5 p r g h o s h ，m ww h i t e h o u s e ，b i o c h e m j ，1 0 8 ，1 5 5 ( 1 9 6 8 ) 【4 6 a r s p r a s a d ，b i o c h e m i s t r y ，2 5 ，3 5 3 6 ( 1 9 8 6 ) 4 7 l f a r b e l a e z ，e ta 1 ，e u r j b i o c h e m ，2 1 8 ，6 5 1 ( 1 9 9 3 ) 4 8 pm u l q u e e n e ta 1 ，b i o c h e m i s t r y , 2 4 ，6 6 3 9 ( 1 9 8 5 ) 4 9 1w d j r h o r r o c k s ，e ta 1 ，b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n ，1 0 0 ， 1 1 1 ( 1 9 8 1 1 5 0 】j l e p e c q ，c p a o l e t t ，a n a l b i o c h e m ，1 7 ，1 0 0 ( 1 9 6 6 ) 【51 m j b l a c k b u m ，t m a n d r e w s ，a n a l b i o c h e m ，5 1 ，1 ( 1 9 7 3 ) 【5 2 】y o h b a ，m k a i ，h n o h t a ，yo h k u r a a n a l c h i m ，a c t a ，2 8 7 ， 2 1 5 ( 1 9 9 4 ) 【5 3 m k a i ，f t o b a ，h - n o h t a ，yo h k u r a ，m i c r o c h e m j ，4 9 ，1 6 5 ( 1 9 9 4 ) 【5 4 】c 。z 。h u a n g ，a n a l l e t t ，2 9 ，1 7 0 5 ( 1 9 9 6 ) 5 5 yx c i ，a n a l c h i ma c t a ，2 4 8 ，5 8 9 ( 1 9 9 1 ) 【5 6 】y x c i y z l i ，a n a l ，c h e m ，6 7 ，l7 8 5 ( 1 9 9 5 ) 【5 7 】f wr o b e r t s o n ，a n a l b i o c h e m ，4 1 ，4 7 7 ( 1 9 7 1 ) 5 8 j k a p u s c i n s k i ，a n a l b i o c h e m ，8 3 ，2 5 2 ( 1 9 7 7 ) 【5 9 n n a k a m u r a ，j k i n o s h i t a ，k m u r a y a m a ，j s o c a n a l c h e m ，3 3 ， e 6 l ( 1 9 8 4 ) 【6 0 x q g u o ，a p p l 。s p e c t ，5 1 ，1 0 0 2 ( 1 9 9 7 ) 。 【6 1 】宋功武，成耀鹏，分析化学，2 7 ，4 4 ( 1 9 9 9 ) 【6 2 】t r d o w n s ，a n a l b i o c h e m ，1 3 1 ，5 3 8 ( 1 9 8 3 ) 【6 3 】w yl i ，j g x u ，x wh e ，a n a l l e t t