（微生物学专业论文）抗伏马菌素b1单链抗体的制备.pdf

c l cc o d e ：q 9 3 9 9 1 s e c r e tl e v e l ： l i i i ii ii ll li l li il liiil y 1 7 4 7 8 5 1 u n i tc o d e ：1 0 3 8 9 s t u d e n t n o ：1 0 7 1 7 0 2 t h e s i sf o rm a s t e rd e g r e eo ff u j i a n a g r i c u l t u r ea n df o r e s t r y u n i v e r s i t y p r e p a r a t i o no fs i n g l ec h a i na n t i b o d y v a r i a b l ef r a g m e n t a g a i n s tf u m o n i s i nb 1 d i s c i p l i n ec a t e g o r y ：s c i e n c e p r i m a r ys u b j e c t ：b i o l o g y s e c o n d a r ys u b je c t ：m i c r o b i o l o g y r e s e a r c hf i e l d ：m o l e c u l a ri m m u n o l o g y p o s t g r a d u a t e ：l i ux i a o l e i s u p e r v i s o r ：p r o f w a n gs h i h u a s u b m i t t e dt i m e ：a p r i l ，2 010 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔签名。z 列嗣帝日期：加口、6 。1 1 日期：胁。- ， 口 目录 目勇乇i 摘要1 a b s t r a c t 2 英文缩写词表3 第一章文献综述5 引言5 l 伏马菌素及其污染现状5 1 1 伏马菌素生物学特性。5 1 2 伏马菌素污染现状7 2 伏马菌素毒性及检测方法的研究8 2 1 伏马菌素的毒性8 2 2 伏马菌素的检测方法l o 2 3 伏马菌素b 1 人工抗原1 2 3 基因工程单链抗体技术。l3 3 1 单链抗体基因的构建1 3 3 2 单链抗体的表达l4 3 3 噬菌体表面展示技术1 4 第二章f b l 人工抗原的制备1 7 引言17 材料与方法17 1 材料17 2 实验方法18 结果与分析2 0 l 结果2 0 2 讨论2 2 3 结论2 2 第三章抗f b l 单链抗体基因的克隆与抗体的淘选2 3 引言2 3 材料与方法2 4 l 材料2 4 2 实验方法2 7 结果与分析3 5 l 抗血清效价的测定3 5 2 脾脏总r n a 提取结果3 6 3v h 和v l 基因的p c r 扩增3 7 4s c f v 基因的组装与扩增一3 7 5 噬菌体重组质粒载体的构建3 8 6 噬菌体抗体库的构建3 8 7 噬菌体抗体库富集淘选s c f v 3 9 8 单链抗体特异性鉴定4 0 l0s c f v 测序4 2 iis c f v 的可溶性表达与e l i s a 检测4 2 讨论一4 4 l 小鼠免疫与血清效价测定4 4 2 总r n a 提取4 4 3s c f v 的组装与扩增4 4 4 噬菌体抗体库的建立及单链抗体的富集淘选4 4 结 念一4 6 参考文献4 7 致谢5 1 附录5 2 i l 福建农林人学硕士学位论文 摘要 伏马菌素是由串珠镰刀菌产生的一类能广泛污染粮食及其制品的真菌毒素， 具有多种毒性，对人和动物健康产生严重威胁。本研究旨在为建立一种基于基因 工程单链抗体的检测伏马菌素b 。的方法提供前期基础，以便最终快速有效地检 测粮食和饲料中f b l 的含量。 本研究以购买的伏马菌素b l 纯品为基础，由于f b l 是小分子半抗原，所以 需要将其与大分子载体蛋白交联才能成为完全抗原。分别利用戊二醛一步法和二 步法将伏马菌素b 1 与b s a 和k l h 两种载体蛋白偶联起来，制备得到f b l b s a 和f b l k l h 两种人工抗原，f b l b s a 作为免疫抗原，f b l k l h 作为检测抗原。 抗血清效价测定结果证明这两种抗原均制备成功。 用f b b s a 免疫b a i b c 小鼠，加强免疫后测定免疫小鼠抗血清效价，e l i s a 测定结果显示效价达到要求。处死并解剖小鼠后，取脾脏提取总r n a ，反转录 获得c d n a 第一链，以其为模板进行p c r 扩增得到抗体重链可变区和轻链可变 区基因( v n , 圪) ，然后进行组装和扩增得到单链抗体基因。将s c f v 基因克隆到 噬菌体载体p c a n t a b5 e 上后，构建噬菌体抗体库，然后经过噬菌体表面展示 技术进行淘选得到了一株可产生较高亲和力s c f v 的噬菌体单链抗体株，并进行 了s c f v 的可溶性表达和鉴定。 关键词：伏马菌素；单链抗体；噬菌体展示：淘选 福建农林大学硕士学位论文 p r e p a r a t i o no fs i n g l ec h a i na n t i b o d y v a r i a b l ef r a g m e n t a g a i n s tf u m o n i s i nb i a b s t r a c t f u m o n i s i n ，ak i n do fm y c o t o x i nd e r i v e df r o mf u s a r i u mm o n i l i f o r m e ，c a np o l l u t e c r o p sa n dt h e i rp r o d u c t sw i d e l y i th a sd i v e r s et o x i c i t yt h a t t h r e a t e n st h eh e a l t ho f h u m a nb e i n g sa n da n i m a l s t h i ss t u d yi n t e n d e dt oe s t a b l i s ham e t h o d ，w h i c hw a s b a s e do nr e c o m b i n a n ts i n g l e - c h a i na n t i b o d ya g a i n s tf u m o n i s i nbi ，t od e t e c tt h e c o n t e n t so ff u m o n i s i nb li nf o o da n df e e dq u i c k l ya n de f f i c i e n t l y f b l i sam i c r o m o l e c u l ea n dh a p t e n ，s oi tn e e d st oc o u p l ew i t ham a c r o m o l e c u l e p r o t e i na n dt h ec o n j u g a t ew i l lb e c o m eac o m p l e t ea n t i g e n i nt h i sr e s e a r c h ，f u m o n i s i n bl ( f b1 ) w a sp u r c h a s e d ，a n dg l u t a r a l d e h y d e ( g a ) o n e s t e pm e t h o dw a su s e dt o p r e p a r ef b i - b s ac o n j u g a t ea n dg a t w o s t e pm e t h o dt op r e p a r ef b i k l hc o n j u g a t e f b l - b s aw a su s e da si m m u n i z i n ga n t i g e na n df b1 - k l hw a su s e df o rd e t e c t i o n ，a n d t h eb o t hc o n j u g a t e sw e r ep r o v e db yt h ef o l l o w i n gt i t e ra s s a yr e s u l t so f a n t i s e r u m b a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e d 晰t l lf b i b s ac o n j u g a t e ，a n dt h et i t e ro fm i c e a n t i s e r u mw a sa s s a y e db ye l i s aa f t e rb o o s t e r , w h i c ha c h i e v e dt h ee x p e c t a t i o n t h e n ， t h ei m m u n i z e dm o u s ew a sk i l l e da n di t ss p l e e nw a ss e p a r a t e d t o t a lr n aw a s e x t r a c t e df r o mt h es p l e e na n dt h ef i r s ts t r a n do fc d n aw a so b t a i n e db yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n a n dt h eg e n e s a n d 圪，f r o mc d n a t e m p l a t ew e r eu s e dt oc o n s t r u c t g e n es c f v s u b s e q u e n t l y ，p h a g ea n t i b o d yl i b r a r yw a s e s t a b l i s h e da f t e rt h eg e n es c f v w a sc l o n e di n t op h a g ep l a s m i dp c a n t a b5 e s c f vp a n n i n gf r o mt h el i b r a r yb y p h a g ed i s p l a yt e c h n i q u e sw a sc a r r i e do u t t h es o l u b l ee x p r e s s i o na n di d e n t i f i c a t i o no f s c f vw e r ep e r f o r m e d f i n a l l y ，w eo b t a i n e do n es t r a i no fp h a g ea n t i b o d yb e i n ga b l et o p r o d u c es c f vw i t hh i g ha f f i n i t y k e yw o r d s ：f u m o n i s i n ；s i n g l ec h a i na n t i b o d y ；p h a g ed i s p l a y ；p a n n i n g 2 福建农林大学硕士学位论文 英文缩写词表 英文缩写英文全称 b p b a s ep a i r b s a b o v i n es e r u ma l b u m i n c d n a ec o i l e d t a e l i s a f b i h r p i g i p t g k l h o d p b s p c r p f u r n a s c f v s o e t m b v n v l 中文全称 碱基对 牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d互补脱氧核糖核酸 大肠埃希杆菌 e t h y l e e nd i a m i n et e r t a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附测定 f u m o n i s i nb 1 伏马菌素b l h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 l m m u n o g l o b u l i n 免疫球蛋白 l s o p r o p y l - p d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n 异丙基一p - d 一硫代半乳糖苷 钥孔戚血蓝蛋白 o p t i c a ld e n s i t y吸光度 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p l o y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p l a q u ef o r m i n gu n i t 聚合酶链式反应 空斑形成单位 r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 s i n g l ec h a i na n t i b o d yv a r i a b l ef r a g m e n t 单链抗体 s p l i c i n go v e r l a pe x t e n s i o n重叠延伸拼接法 t e t r a m e t h y lb e n z i d i n e 四甲基联苯胺 v a r i a b l er e g i o no f h e a v yc h a i n 重链可变区 v a r i a b l er e g i o no f l i g h tc h a i n 3 轻链可变区 祸建农林大学硕士学位论文 4 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 引言 伏马菌素是一种水溶性真菌毒素，在世界上的污染广泛存在，主要污染粮食 作物及饲料，尤其对玉米及其制品污染严重。伏马菌素的热稳定性高，不易被破 坏，对人畜具有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏， 严重危害人类和动物的健康。在伏马菌素的众多检测方法中，酶联免疫吸附法 ( e l i s a ) 是以其方便、快捷并且具有较高灵敏度的优点而成为目前应用最广泛 的检测方法。e l i s a 检测的原理是建立在免疫学反应基础上的，它是将抗原和抗 体之间的特异性反应与酶对其相应底物的高效催化作用结合起来的具有较高灵 敏度的一门试验技术，该技术的关键是获得对抗原特异性的高亲和力的抗体。针 对伏马菌素b l ( f b l ) 的检测，比较常用的是建立在单克隆抗体基础上的e l i s a 检测方法。另外，以基因工程小分子抗体为基础的e l i s a 技术也正在发展中， 并且逐渐呈现出比传统方法更有优势的方面，即可以通过分子牛物学技术改造抗 体基因，大幅度提高其亲和力，体现了其更有优越性的一面。 l 伏马菌素及其污染现状 1 1 伏马菌素生物学特性 伏马菌素( f u m o n i s i n ) 是一种主要由串珠镰刀菌( f u s a u i u mm o n i l i f o 删s h e l d ) 产生的真菌毒素，其主要组分是伏马菌素b l ( 简写为f b l ) 。g e l d e r b l o m 等于1 9 9 8 年首次从串珠镰刀菌培养液中分离得到伏马菌素，1 9 8 9 年l a u r e n t t 等又从伏马 菌素中分离出伏马菌素b l 和b 2 ( f b l ，f b 2 ) 。目前，已发现的伏马菌素有f a l ， f a 2 ，f b l ，f b 2 ，f b 3 ，f b 4 ，f c l ，f c 2 ，f c 3 ，f c 4 和f p i 共1 1 种，其中f b l 是 主要组成成分，也是毒性最强的成分。 1 1 1 伏马菌素结构及理化性质 伏马菌素是一组相关的极性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组 成的结构类似的双酯化合物，其结构具有一个线状的包含1 9 2 0 个碳原子的骨 架，沿骨架两侧的不同部位具有羟基、甲基和三羧酸组分，与神经鞘氨醇相似。 其分子结构式如图1 1 所示【2 1 。 福建农林大学硕士学位论文 c h 3 o r c h 3r 1 n h 2 r = c o c h ( c o o h ) c h 2 c o o h f b , ：r 1 = o h ；r 2 = o h f b 2 ：r l = o h ：r 2 = h f b 3 ：r i = h ；r 2 = o h f b 4 ：r l = h ；r 2 = h 图1 - 1 伏马菌素结构图 f i g 1 1s t r u c t u r eo f f u m o n i s i n s 伏马菌素为水溶性真菌毒素，具有热稳定性，结构不易被蒸煮破坏，在1 0 0 下蒸煮3 0m i n 结构也不能被破坏。伏马菌素的半衰期在1 5 0 时为1 0m i n ，1 2 5 时为3 8m i n ，1 0 0 时为1 7 5 m i n ，7 5 时为8h 【引。 伏马菌素b l 是一种小分子半抗原，分子量为7 2 1 ，只有反应原性而无免疫 原性，需要与载体蛋白偶联后才能使动物产生免疫应答。1 9 8 8 年，南非和美国 的研究人员首先从霉变的玉米中分离出伏马菌素b l ，纯品为白色针织结晶，易 溶于水，在多数粮食加工处理过程中比较稳定【4 1 。 1 1 2 伏马菌素产生菌 伏马菌素主要由串珠镰刀菌( f u s a u i u mm o n i l i f o r ms h e l d ) 产生。串珠镰刀菌 属于镰刀菌属。镰刀菌属为瘤座孢科，丛梗孢目，半知菌类真菌，由于本属真菌 的大型分生孢子多呈镰刀形状，故得名。 镰刀菌是一类分布广泛的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，而且侵染宿 主具有广谱性，侵染多种植物( 如农作物、经济作物、药用植物和观赏植物等， 达1 0 0 余种) ，可引起植物的根茎腐烂、花腐和穗腐等多种病害，是生产实践中 最难防治的植物病害之一。镰刀菌大约有4 0 个种，其中一半以上寄生在绿色植 物上。镰刀菌属包括粉红镰刀菌、茄病镰刀菌、禾谷镰刀茵、串珠镰刀菌、三线 镰刀菌等。其中串珠镰刀菌是产伏马菌素的主要真菌。 串珠镰刀菌俾m o n i l i f o r m e ) 是在北温带地区比较常见的一种产毒真菌，易在 生长期和储存期的农作物及其产品中生长，并在美洲、欧洲、亚洲等温带区域种 6 福建农林大学硕一t z 学位论文 植的谷物中被广泛发现。需要特别指出的是，作为世界主要粮食品种之一的玉米 最容易感染串珠镰刀菌，而由它产生的伏马菌素对人类和多种动物都有较严重的 毒副作用。串珠镰刀菌在繁殖过程中产生多种伏马菌素，其中6 0 以上是伏马菌 素b 。，其毒性也最强。 串珠镰刀菌适合生长的条件：培养基为c z a p e k 或p d a ，温度范围在 2 5 c 3 0 之间，p h 值是9 ，c 源和n 源分别是蔗糖和k n 0 3 ；适合该病菌产生 孢子的条件：p s a 培养基，温度在2 5 3 0 之间，c 源和n 源同前，p h 值是 6 ；分生孢子的最佳萌发条件：温度在2 5 3 0 之间，p h 值足7 ，避光，因为 光照对分生孢子萌发有明显的抑制作用【5 1 。 1 2 伏马菌素污染现状 伏马菌素对饲料尤其对粮食作物的污染情况较严重，其污染的饲料主要是以 玉米为原料的饲料。此外还有一些如大米、高梁、小米、牛奶、啤酒等。伏马菌 素对予粮食的污染情况，科学家研究最多的也是玉米及其制品。玉米中伏马菌素 含量受许多环境因素的影响，如收获前和收获期间的温度、湿度、干旱情况；玉 米中伏马菌素含量也受其贮存条件的影响，如在贮存期问收获的玉米中水分达到 1 8 - - 2 3 时，最适宜产生伏马菌素的串珠镰刀菌的生产和繁殖，最终导致玉米 及其相关制品中伏马菌素含量的增加。 2 0 0 1 年美国食品与药物管理局( f d a ) 发布了供人类食用的玉米和玉米产 品伏马菌素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马菌素最高限量为 2 m g k g ；同时，f d a 的畜牧医学中一i l , ( c v m ) 也发布了动物饲料中伏马菌素的最 高限量指导性公告，规定其限量范围为1 - 5 0 m g k g 。 伏马菌素对粮食作物的污染在世界范围内普遍存在。k p o d o 掣6 】在对来自加 纳首都阿克拉四个市场和加工场所的玉米样品进行f b l 、f b 2 和f b 3 的污染分析 后发现，所有的样品均含有伏马菌素，其中一份明显霉变的玉米中总伏马菌素的 含量高达5 2 6 7 0m g k g ，其余1 4 份样品中总伏马菌素污染水平为0 0 7 0 , - - 4 2 2 2 m g k g 。吕斌等【1 7 】通过对湖北省3 种主粮中串珠镰刀菌和f b i 的污染调查发现， 全省主要粮食普遍受到f b l 的侵染，小麦中f b l 检出率最高，其平均含毒素量和 大米持平，玉米中f b l 的侵染介于大米和玉米之间，但其f b 。平均含量高于小麦 和大米。王建升等【8 】在食管癌高发地区河南省林县抽取了1 0 4 份玉米粒样品进行 福建农林人学硕士学位论文 伏马菌素检测，发现家用、粮仓、批发市场及零售市场储藏间的样品阳性率分别 为6 1 5 、5 0 、3 3 3 和1 7 ，而取自超市的样品则没有检测到伏马菌素。粮 仓里的样品f b l 含量最高( 为0 3 0 - 3 2 0l a g g ，平均1 4 2l a g g ) ，家用的次之 ( 0 2 5 1 8 0l a g g ，平均0 7 3 l a g g ) ，然后是批发市场( 0 2 5 1 1 0l a g g ，平均o 5 1r t g g ) 和零售储藏( o 2 2 - 4 2 3 4l a g g ，平均0 2 8l a g g ) 。 鉴于伏马菌素的危害性，我国研究者【9 】对国内伏马菌素污染及串珠镰刀菌生 态分布进行了系统的调查研究和分析，发现我国三大谷物( 玉米、小麦、大米) ， 特别是玉米中的f b l 污染严重，与全球f b l 的监测结果相符。伏马菌素在我国的 污染以f b l 为主，f b 2 、f b 3 次之，阳性样品中f b l 、f b 2 、f b 3 的平均值及含量 范围依次是5 2 3 5 ( 3 5 5 0 2 2 7 ) 、1 5 1 1 ( 4 2 - 1 0 4 4 8 ) 、5 4 9 ( 5 2 - 3 4 2 0 ) l a g k g 。从谷物 及土壤中分离串珠镰刀菌1 0 4 株、串珠交孢变种2 4 株，其中产f b 菌株6 5 株( 1 0 株f b i 高产毒株和7 株f b 3 高产毒株) 。 伏马菌素污染的粮食常常伴有另外一种非常重要的真菌毒素一黄曲霉毒素 的存在，这更增加了其对人畜危害的严重性。a b b a s 等f l o 】分析了于1 9 9 8 至2 0 0 1 年在美国南部收集的受真菌侵害的玉米样品，结果显示收集于1 9 9 8 年的样品中 黄曲霉毒素超过2 0p p b ( 平均水平为2 1 - 6 9 9p p b ) ，伏马菌素超过2p p b ( 平均水 平为2 1 , - - 6 9 9p p b ) ，即f d a 允许的上限。阿肯色州的玉米样品中黄曲霉毒素的污 染水平范围为0 - 2 5 5 3p p b ，伏马菌素为0 3 - 8 3 6p p b 。在阿克拉的1 5 个加工场 所采集的玉米样品分析显示：样品中伏马菌素和黄曲霉毒素的共同污染率为 5 3 ( 8 1 5 ) 。有报道表明在巴西检出黄曲霉毒素的玉米样品中，f b l 的检出率为 1 0 0 。 由于伏马菌素污染的广泛性，人们对它的危害性认识逐渐深刻，对其检测方 法的研究也取得了一些成效。 2 伏马菌素毒性及检测方法的研究 伏马菌素主要作用于人畜的肝脏和肾脏，具有多种毒性，如神经毒性、肺毒 性、免疫毒性等，并可致癌。随着伏马菌素毒性研究的深入，相关检测技术的发 展也日新月异。 2 1 伏马菌素的毒性 伏马菌素在结构上与神经鞘氨醇相似，因而伏马菌素能够特异性地干扰神经 福建农林火学硕士学位论文 鞘脂类在体内的代谢，从而引发系列神经和免疫系统方面的疾病。神经鞘氨醇 是神经鞘脂类( 神经鞘磷脂、神经酰氨、神经节苷脂) 的化学结构骨架，神经鞘脂 类生物合成的破坏将给人类以及动物的健康造成严重的危害【3 1 。由于伏马菌素的 多种毒性，其可在不同的动物引起不同的疾病，能引起马脑白质软化综合症、猪 肺水肿和鼠肝肾损伤，甚至可以诱发鼠肝癌，并且发现在食管癌高发区伏马菌素 污染水平很高，两者具有明显的相关性【l l 】。另外，伏马菌素还可与其他毒素一起 产生联合毒性，对动物产生更大的危害。 2 1 1 神经毒性 伏马菌素的神经毒性的显著表现就是引发马脑白质软化症( e q u i n e l e u k o e n c e p h a l o m a l a c i a ，e l e m ) ，这种病是一种对马属动物具有高度致死性的中 毒症，主要表现症状为：初期表现为嗜睡拒食、共济失调、抽搞等症状，最后死 亡。病理学检查发现明显的肝病样改变和延髓质水肿【1 2 1 。k e l l e r m a n 等【1 3 】用伏马 菌素f b l 喂食2 只小马进行诱导马脑白质软化症实验，发现分别按一定剂量喂 养f b l 多天后，2 只马都出现了马脑白质软化症的症状，表现出精神紧张、冷漠、 性情改变、动作不协调等非正常状态，且大脑都出现了特征病变。m a r a s a s 等【1 4 】 的研究也有类似的结果。这些都证明了伏马菌素是诱发马脑白质软化症的致病因 子。 2 1 2 肺毒性 伏马菌素的肺毒性主要体现在可以引起猪的肺水肿综合症( p i gp u l m o n a r y e d e m ，p p e ) 。s m i t h 等【1 5 】研究发现，给猪每天喂食伏马菌素后，检测发现猪体内 鞘氨醇浓度持续增加，猪在安乐死前1 2h 内呼吸速率加快，平均肺动脉压和肺 动脉楔压升高，心率和心输出量随着下降。喂食了伏马菌素的猪也出现全身动脉 低血压，动脉和混合静脉缺氧，代谢性酸中毒等病状。 2 1 3 免疫系统毒性 大量试验结果表明，伏马菌素能损害动物免疫系统，引起免疫功能下降，造 成免疫抑制。给小鼠静脉注射f b l ( 1 5 5m e g k g ) ，导致实验组8 5 d 、鼠脾脏细 胞d n a 断裂f 1 6 】。给大鼠腹腔连续数天注射f b l ( 7 5m e , k g d ) ，导致大鼠胸腺重 量下降、播散性坏死【1 7 】。给鸡饲喂( 2 0 0r f l g l ( g d ) f b l ，也可导致鸡胸腺重量下降。 在体外实验o o ( f b l ，5 和5 0i t g m 1 ) ，脾脏细胞的生存能力和有丝分裂能力降低， 9 福建农林大学硕士学位论文 并有时间和剂量依赖效应。在高剂量组，胸腺细胞活力受到影响，但不影响细胞 的有丝分裂【1 8 j 。 2 1 4 致癌性 关于致癌方面，经研究表明，伏马菌素对肝脏、肾脏均具有毒性作用，在高 剂量或长期饲喂条件下，可引起啮齿类动物产生癌症，是一种慢性癌症促进剂和 诱导剂1 2 1 。美国国家毒理学规划( u s n t p ) 在肿瘤研究实验中表明，长期摄入高水 平伏马菌素( 5 0m g , ，l ( g 以上) 可诱发雌性小鼠肝癌并使其寿命缩短，诱发 f i s c h e r - 3 4 4 n c t rb r 大鼠肾癌，但不影响其寿命。用b d i x 雄性大鼠进行类似实 验，暴露于5 0m e j k g 时，可诱发肝癌【1 9 1 。此外，人们发现伏马菌素与诱发人类 食管癌有密切关系【2 0 ，2 1 1 。但目前还没有充足的证据证明伏马菌素可以诱发食道 癌。1 9 9 3 年，国际癌症研究中心( i a r c ) 将伏马菌素列为2 b 类致癌物质( 即人类 可能致癌物) 。 2 1 5 与其他毒素的联合毒性 伏马菌素与其他毒素的联合毒性作用研究也有新的进展【珏2 4 1 ，镰孢菌酸和 f b l 对鸡胚有协同作用。但镰孢菌酸和f b 在大鼠体内亚慢性毒性方面没有相互 作用。伏马菌素和a f b l 对小鼠的亚慢性毒性研究，未发现两者有明显的联合作 用。但f b l 和a f b l 在大鼠肝脏短期致癌模型的相互作用研究中，发现两者的共 同存在增加了患癌症的危险度。孙桂菊等【2 5 1 研究了伏马菌素与黄曲霉毒素对s d 大鼠的联合毒性，高剂量组大鼠肝脏、肾脏重量降低，肝脏出现明显病理变化， 血清中超氧化物歧化酶( s o d ) 活力降低，丙二醛o v i d a ) 水平升高等。 2 2 伏马菌素的检测方法 鉴于伏马菌素的广泛污染及严重危害性，对于粮食及其制品和饲料的污染检 测显得十分重要。但现在国际上对食品和饲料中伏马菌素的限量和检测方法还没 有形成统一的标准。而对于食品中伏马菌素的检测，常用的分析方法主要有荧光 光度法、薄层色谱法( t l c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 、 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 、色谱质谱联用法( g l c m s ) 等。 2 2 1 荧光光度法 荧光光度法是依照物质在紫外线下发射荧光的强度来测定其含量的一种分 析方法。饶正华【2 6 1 建立了免疫亲和柱荧光光度法检测饲料中伏马菌素。样品经 1 0 福建农林人学硕士学位论文 萃取、过滤等操作后，滤液通过键合有伏马菌素特殊抗体的f u r n o n i t e s t 分离柱， 使伏马菌素结合在抗体上，用p b s t 淋洗粒子，然后洗脱。淋洗液经荧光计检测， 并通过h p l c 定量和确认。结果显示，此法相关系数为0 9 5 8 9 ，平均回收率为 8 9 2 2 ，各重复之间的变异系数小于1 5 。 2 2 2 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱又叫薄层层析，是在5 0 年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发 展起来的一种色谱技术。c a w o o d 等1 2 7 】用硅胶g 板，经两种展开剂展开后，用显 色剂在1 2 0 。c 进行显色，可以分离f b l 和f b 2 。f b l 的r f 值分别为0 2 3 和0 1 5 ， f b 2 的r f 值分别为0 3 0 和0 2 。d a w l a t a n a 等【2 8 】建立了高效t l c 法检测大米中的 f b l 含量，采用s a x 纯化样品后，用t l c 法检测在薄层板上用0 1 6 的对甲氧 基苯甲醛酸溶液展开，用荧光显像测密术定量。这种方法在o 5m g k g 是线性的， 平均回收率为8 l 。 2 2 3 酶联免疫吸附法( e l i s a ) e l i s a 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高 效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。e l i s a 检测法具有简单、 快捷、灵敏度高等特点，是目前比较常用的方法。在实际应用中，通过不同的设 计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双 抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的足 双抗体夹心法及间接法。 e l i s a 检测f b l 的方法大多是建立在单克隆抗体基础上的。郭云昌等【2 9 1 在 单克隆抗体基础上建立了一套用于检测粮食、饲料中伏马菌素b l 的直接竞争性 酶联免疫吸附测定方法( d c e l i s a 法) ，其最低检出浓度为1 0n g m l ，线性范 围在1 0n g m l 5g m l 。2 0 0 3 年，s a v a r d 等【3 0 】以b s a 为载体蛋白，制备出可同 时检测f b l 、f b 2 和f b 3 的单克隆抗体。许金俊等【3 1 】在单克隆抗体基础上建立了 定量检测玉米中f b l 含量的间接竞争e l i s a 方法，以o v a f b l 作为包被抗原， f b l 为竞争抗原，二者与抗f b l 单抗竞争反应。该法灵敏度为9 0 8 8n g m l ，最 低检测限为7 8 3n g m l 。宫慧芝等在制备抗f b l 单克隆抗体基础上，利用间接 竞争酶联免疫吸附方法研制除了f b l 快速检测试剂盒。该试剂盒最低检出浓度为 5n g m l ，校正曲线线性范围5 0 5 0 0n g m l 。 福建农林大学硕士学位论文 q u a ny 等在多克隆抗体基础上建立了化学发光e l i s a 技术( e c l e l i s a ) 来检测样品中的f b l 。优化后的e c l e l i s a 系统检测灵敏度为0 3 2p g l ，最低 检出浓度为0 0 9u g l 。 2 2 4 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的待测流动相泵入装有固 定相的色谱柱中，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被 分离然后依次进入检测器进行检测。产生的离子流信号经放大后，在记录器上描 绘出各组分的色谱峰。林维宣等【3 4 1 利用单克隆免疫亲和柱一高效液相色谱法分 别测定了酱油、啤酒、玉米中伏马菌素b l 、b 2 的含量。宫慧芝等【3 5 】建立了伏马 菌素b l ( f b l ) 的高效液相色谱检测方法， 浓度的回收率在7 1 7 7 1 0 2 6 8 之间， 1 2 1 7 。 2 2 5 气相色谱法( g c ) ll x g m l 、5l a g m l 、10l x g m l3 个加标 平均回收率为8 4 7 2 ，总变异系数为 由于f b l 分子高度极性，很难对整个分子进行气化。传统毛细管气相色谱检 测伏马菌素主要集中于分离及检测其水解产物。f b l 酸性水解产物为丙三羧酸， 碱性水解产物为氨基多羟基化合物) 【3 6 】。起初研究一般利用异丙醇与丙三羧酸的 酯化作用，验证丙三羧酸的存在，间接证明f b l 存在，但是它的检测线信息是非 特异性的【3 7 1 。对氨基多羟基化合物的衍生产物三甲基硅烷基的研究提高了检测 的特异性。g c m s 可同时定量和定性f b l ，其检测限可达到1 0i _ t g k g t 38 1 。 2 2 6 其他检测方法 除了上述方法外，还有化学选择性固定检测法( c h e m i s e l e c t i v ei m m o b i l i z a t i o n a n dd e t e c t i o n ，c s i d ) 、毛细管区带电泳法( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 、 蒸发光散射检测技术( e l s d ) 、气相色谱质谱联用( g c - m s ) 和液相色谱质谱联用 ( l c m s ) 等检测手段被用于检测伏马菌素。 2 3 伏马菌素b 1 人工抗原 现阶段对于伏马菌素的检测比较常用的足e l i s a 检测方法，本研究即通过 制备f b l 抗体为其e l i s a 检测方法提供基础。由于f b l 分子量比较小，只有 7 2 1 8 3 ，因此是半抗原，不具有免疫原性，只有反应原性，需要与载体蛋白偶联 后形成完全抗原才能使动物产生免疫应答，进而产生抗体。常用的载体蛋白有卵 福建农林大学硕士学位论文 清白蛋白( o v a l b u m i n ，o a ) 、牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 、钥孔 戚血蓝蛋白( k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n ，k l h ) 、人血清白蛋白( h u m a ns e r u m a l b u m i n ，h s a ) 等。o a 和b s a 应用较多，主要是因为它们具有较多的偶联位点 以及溶解性好等特点。k l h 分子量比较大，大概为4 5 1 0 51 3 1 0 7 ，具有几 个可以连接的赖氨酸残基，免疫原性较高，但其水溶性较差，易产生沉淀。本研 究采用将f b l 与b s a 偶联形成免疫抗原，刺激动物产生免疫反应，与k l h 偶联 形成检测抗原，用于筛选和检测抗体【3 9 1 。 3 基因工程单链抗体技术 基因工程抗体( g e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n ga n t i b o d y ) 是指利用基因重组技术，对 编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，表 达生产出预期的抗体分子，又称重组抗体。1 9 8 4 年，m o r r i s o n 等人将鼠单抗可 变区的编码序列与人i g g 恒定区的编码序列连接在一起，成功构建了第一个基因 工程抗体，即人鼠嵌合抗体( h u m a n m o u s ec h i m e r i ca n t i b o d y ) 。1 9 8 9 年，h u s e 等人首次构建了抗体基因库。这些技术推动了第三代抗体一基因工程抗体的发 展。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力 和特异性。借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改 造。其中小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统中表达 及易于对其进行基因工程操作等优点而受到研究者的重视，并成为基因工程抗体 的研究热点。常见的单价小分子抗体有s c f v 、f a b 、f v 等【删。我们介绍一下基因 工程单链抗体技术。单链抗体( s i n g l ec h a i nf v , s c f v ) 是h 链和l 链的v 区被适 当的寡核苷酸接头( 1 i n k e r ) 连接起来形成的单一多肽链。主要介绍一下单链抗 体基因的构建、表达及应用。 3 1 单链抗体基因的构建 首先从杂交瘤细胞、免疫小鼠的脾细胞或接触抗原的人外周血淋巴细胞中提 取总r n a ，经反转录生成c d n a 第链，然后以其为模板进行p c r 扩增，得到