（微生物学专业论文）生物防腐剂纳他霉素产生菌发酵工艺的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种二十六元多烯大环内酯类抗生素，能有效的抑制 酵母菌和霉菌的生长。作为一种高效广谱的抗真菌抗生素，纳他霉素在医疗、食 品等领域显示了良好的应用前景。本论文对纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i sh d m n t e 0 1 ) 的发酵生产工艺进行了系统的研究，重点进 行了纳他霉素的检测方法、发酵培养基成分、培养条件及发酵工艺优化等方面的 研究。 首先，本文建立了纳他霉素的检测方法，通过对管碟法测定纳他霉素生物效 价各项参数的确定，使纳他霉素含量与抑菌圈直径平方呈良好的线性关系，得到 线性回归方程：y = o 0 0 1 3 x 1 3 3 6 9 ，= o 9 9 6 5 。利用琼脂块法对不同形态的单菌落 进行初筛，进一步通过摇瓶复筛，筛选出性能稳定，产量较高的1 0 3 号菌，摇瓶 发酵纳他霉素产量达o 5 9 9 l 。 通过对1 0 3 号菌株的摇瓶分批发酵研究，确定了纳他霉素产生菌单因素发酵 条件。种子培养基：葡萄糖1 o ，淀粉1 o ，黄豆饼粉1 o ，蛋白胨0 6 ，玉 米浆o 6 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，k 2 h p 0 40 0 5 ， n a c l0 2 ，c a c 0 30 5 ；种子 培养条件：p h 值7 0 ，2 8 c ，2 2 0 r m i n 摇床培养4 8 h ，以6 接种量接种于发酵液； 发酵培养基碳源：4 葡萄糖；氮源及其比例：2 大豆蛋白胨+ 0 5 酵母粉；发酵 初始p h 值：7 0 ；发酵温度：2 8 ；溶氧条件：2 5 0 m l 三角瓶装液量2 5 m l ；摇床 转速：2 2 0 r m i n ；代谢调节物：o 0 0 3 亚铁氰化钾在发酵o h 时添加：前体物质： o 4 正丁醇在发酵2 4 h 时添加。 根据摇瓶分批发酵的初步研究结果，采用响应面法对纳他霉素发酵工艺进行 优化，得到纳他霉素产生菌最优发酵工艺。发酵培养基：葡萄糖3 9 7 ，大豆蛋白 胨2 ，酵母粉o 5 ，初始p h 值7 0 ，以6 的接种量接种于装液量为2 4 6 8 m l 的 2 5 0 m l 三角瓶中，摇床转速2 2 0 r m i n ，发酵0 h 向培养基中添加0 0 0 3 的亚铁氰化 钾，发酵2 4 h 时添加o 4 的正丁醇，2 8 ，发酵9 6 h 。在此最佳工艺下发酵，纳 黑龙江大学硕士学位论文 他霉素产量可达1 4 7 1 9 几，比初始产量提高了1 4 9 。 利用5 l 发酵罐进行纳他霉素的发酵放大研究，在优化条件下，发酵罐中的纳 他霉素产量可达到2 4 9 l ，比摇瓶发酵水平提高了6 3 。 关键词：纳他霉素纳塔尔链霉菌管碟法发酵优化响应面优化法 a b s t r a c t a b s t r a c t 2 6 m e m b e r e dr i n gp o l y e n em a c r o l i d ea n t i b i o t i c sn a t a m y c i nc a i le f f e c t i v e l yi n h i b i t t h eg r o w t ho fy e a s ta n dm o l d ，w h i c hs e r v e sa sab r o a d s p e c t r u ma n t i f u n g a la g e n ta n d i t se f f e c t i v ei nt h et h e r a p yo fm e d i c a lt r e a t m e n ta n dp r o t e c t i o no ff o o d s i nt h i sp a p e r , s o m es y s t e m a t i cr e s e a r c h e sw e r ed o n eo nf e r m e n t a t i o no fn a t a m y c i nb ys t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i sh d m n t e 一01 ，d e t e r m i n a t i o nm e t h o do fn a t a m y c i n ，t h eo p t i m i z a t i o no f m e d i u mc o m p o s i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e de m p h a t i c a l l y f i r s to fa l l ，d e t e c t i o nm e t h o do fn a t a m y c i nw a se s t a b l i s h e d t h ey i e l do fn a t a m y c i n a n dt h ed i a m e t e rs q u a r eo fi n h i b i t o r yz o n et o o ko nag o o dl i n e a rr e l a t i o na f t e rt h e d e t e r m i n a t i o no fp a r a m e t e ro fa g a rd i f f u s i o nm e t h o d ，e q u a t i o no fl i n e a rr e g r e s s i o n ： y = 0 0 0 13 x 一1 3 3 6 9 ，r 2 = 0 9 9 6 5 o n eh i g hy i e l d s t r a i nn o 10 3w a ss c r e e n e df r o m d i f f e r e n tc o l o n ys h a p eb ya g a rb l o c km e t h o da n ds h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o n t h ey i e l d o fn a t a r n y c i ni ns h a k i n gf l a s kw a s0 5 9 9 l t h eb a t c hf e r m e n t a t i o no fn a t a m y c i np r o d u c t i o no fs t r a i nn o 10 3i ns h a k ef l a s k w a ss t u d i e d ，a n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o no fs i m p l e xf a c t o r sf e r m e n t a t i o nw e r ea c h i e v e d s e e dm e d i u m ：g l u c o s e l o ，a m y l o n l 0 ，s o y b e a nc a k ep o w e r l o ，p e p t o n e 0 6 ，c o m s t e e pl i q u o r 0 6 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，k 2 h p 0 40 0 5 ，n a c l 0 2 ，c a c 0 3 0 5 ，p h 7 0 ， i n o c u l u mv o l u m ew a s6 c u l t i v a t e da t2 9 。cf o r9 6 ha n dt h ea g i t m i o ns p e e dw a s 2 2 0 r r a i n ；c a r b o ns o u r c e ：g l u c o s e 4 ；n i t r o g e ns o u r c ea n dt h e i rp r o p o r t i o n ：s o y ap e p t o n e 2 + y e a s te x t r a c to 5 ；d o ：2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g2 5 m lm e d i u m ，a g i t a t i o ns p e e d w a s2 2 0 r m i n ；i n i t i a lp hv a l u e ：7 0 ；t e m p e r a t u r e ：2 8 c ；t h er e g u l a t i o no fm e t a b o l i s m ： a d d i n g0 0 0 3 f e r r o c y a n a t u mk a l i u mi n t ot h eb r o t ha to ha n d0 4 n b u t a n o la t2 4 ho f c u l t i v a t i o n a c c o r d i n gt ot h ep r e l i m i n a r ys t u d yo fb a t c hs h a k i n g f l a s kf e r m e n t a t i o n ，r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g yw a sa p p l i e dt oo p t i m i z et h ez y m o t e c h n i q u eo fn a t a m y c i n ，a n dt h e n 1 黑龙江大学硕士学位论文 o p t i m u mz y m o t e c h n i q u ew e r ea c h i e v e d m e d i u mc o n s i s t e do fg l u c o s e 3 9 7 ，s o y a p e p t o n e2 ，y e a s te x t r a c to 5 ，t h ep ho ft h em e d i u mw a s7 0a n di n o c u l u mv o l u m e w a s6 a2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g2 4 6 8 m lm e d i u mw a sc u l t i v a t e da t2 9 f o r9 6 h a n dt h ea g i t a t i o ns p e e dw a s2 2 0 r m i n ，a d d i n g0 0 0 3 f e r r o c y a n a m mk a l i u mi n t ot h e b r o t ha to ha n d0 4 n b u t a n o la t2 4 ho fc u l t i v a t i o n t h ey i e l do fn a t a m y c i nw a su pt o 1 4 71g lu n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，w h i c hw a s14 9 h i g h e rt h a nt h eo n eb e f o r e o p t i m i z a t i o n a5 lb i o r e a c t o rw a su s e dt os t u d yt h em a g n i c i c a t i o no fn a t a m y c i nf e r m e n t a t i o n ， t h ep r o d u c t i v i t yo fn a t a m y c i nr e a c h e d2 4 9 li nt h eo p t i m i z e do p e r a t i n gc o n d i t i o n s ， w h i c hw a s6 3 h i g h e rt h a nt h a ti ns h a k i n g f l a s hf e r m e n t a t i o n k e yw o r d s ：n a t a m y c i n ；s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ；a g a rd i f f u s i o nm e t h o d ； o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：丢为寸，尹 签字日期：加譬年珀，弓日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕴堑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕴堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者繇翻坤 新躲子奠 签字日期：d 谚年么月一日 签字日期：龇岔年厂月- - j 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章前言 1 1 纳他霉素概述 第1 章前言 食品在贮存中极易受微生物侵袭而导致腐败。据统计，全世界约1 0 - - - 2 0 的食品损失源于各种腐败。食品工业中，霉菌、酵母、丝状真菌的污染和增殖不 仅给产品的生产和保藏带来危害，而且当食品被真菌污染后，产生的真菌毒素具 有强烈的致癌、致畸等致病性，对人类的健康造成极大的伤害【lj 。因此，食品工业 领域真菌污染的防治已引起全世界的关注。 为了延长食品的保藏期和防止食品被真菌污染，人们在食品加工过程中添加 防腐剂。最初，普遍使用的是化学防腐剂。这些防腐剂不但影响人类健康，其防 腐效果还受微生物种类、食品成分等因素的影响；且在常规用量下会影响食品风 味，因此化学防腐剂已不能满足现代食品工业的需要。高效、无毒、广谱及经济 实用的天然防腐剂的研究和开发越来越引起人们的重视。利用微生物制取天然生 物防腐剂已成为食品保藏研究的热点。 我国现已批准使用的天然微生物防腐剂只有纳他霉素( n a t a m y c i n ) 和乳酸链球 菌素( n i s i n ) 等少数几种。由纳塔尔链霉菌等发酵产生的纳他霉素是一种高效、广谱 的抗真菌抗生素，具有使用p h 值范围广、对产品口感无任何影响、对哺乳动物细 胞的毒性极低等优点。目前，全世界有三十多个国家将纳他霉素用于乳制品、肉 制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏。另外，纳他霉素还可以用来治疗真菌 引起的疾病。 虽然纳他霉素在食品、医疗等领域显示了良好、广阔的应用前景，但目前世 界上仅有美国和荷兰的几家公司在生产和销售纳他霉素，而国内的发展还处于起 步阶段，仅有北京营养研究所、天津科技大学、浙江大学等正在开发此产品。由 于目前国内纳他霉素的发酵水平较低，导致生产成本太高，限制了它的应用。因 此，研究发酵法生产纳他霉素以提高其生产水平、降低生产成本具有重要的意义 【3 巧】。目前，已公开报道的纳他霉素资料大部分是关于纳他霉素的应用及食品中残 黑龙江大学硕士学位论文 留纳他霉素检测方面的研究。国内对纳他霉素产生菌发酵条件的研究报道很有限， 发酵工艺的优化工作也不系统、成熟。这些都使得纳他霉素的应用前景受到限制， 工业化生产进展缓慢。因此，本文主要针对纳他霉素产生菌发酵工艺进行研究， 以提高纳他霉素产量，降低生产成本。 1 1 1 纳他霉素的发现与命名 1 9 5 5 年，s t r u y ka p 等人从南非纳他州彼得马里茨堡( 南非东部城市) 附近的土 壤样品中分离得到纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) ，并从其培养物中分离得 到了一种新的抗真菌物质，19 5 7 年s t r u y ka p 等将其命名为p i m r i e i n ，即匹马菌素 【q ；1 9 5 9 年，伯恩斯等人在美国田纳西州东南部城市查塔努加采集到的土壤样品 中分离得到了恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ) ，并从其培养物中分离 得到了t e n n e c e t i n ，即田纳西菌素。一后经研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物 质，世界卫生组织将这种新型抗真菌物质统一命名为n a t a m y c i n 7 ( 纳他霉素) ，而 在我国早期的文献中曾将其翻译为游霉素。 1 1 2 纳他霉素的理化性质 纳他霉素为白色至乳白色，无臭无味的结晶粉末，含有三分子以上的结晶， 其分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为6 6 5 7 3 ，其化学结构如图1 1 所示： 图1 1 纳他霉素的化学结构 f i g 1 1t h ec h e m i c a lc o n s t i t u t i o no f n a t a m y c i n 第1 章前言 由图1 1 可知，纳他霉素是一种多烯大环内酯类化合物，具有一个2 6 元的内 酯环，分子中含有4 个共轭双键的多烯发色团，且其中四烯系统是全顺式；内酯 环上c 9 一c 1 3 部位是半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨 基二脱氧甘露糖。 纳他霉素是一种两性物质，分子当中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其 电离常数p k a 值为8 3 5 和4 6 ，相应的等电点为6 5 ，熔点为2 8 0 。因为其结构 上存在两种典型构型烯醇式和酮式，所以它在许多溶剂中的溶解性较低。纳他霉 素不溶于非极性溶剂，在水中或低级醇中的溶解性是随着p h 的降低或升高而增加 的，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时，溶解度会有所增高【8 】。 纳他霉素在各种溶剂中的溶解度情况见表1 1 。 表1 1 纳他霉素的溶解度 t a b l e 1 1t h es o l u b i l i t yo fn a t a m y c i n 溶剂溶解度 水 乙醇 乙醇8 0 + 水2 0 甲醇 丙二醇 甘油 二甲基亚砜 冰醋酸 0 0 0 5 o 0 1 o 0 1 o 0 7 3 3 1 4 - 2 0 1 5 5 o 1 8 5 纳他霉素的紫外光谱如图1 - 2 所示，在2 9 0 ，3 0 3 ，3 1 8 r i m 处有尖锐的最大吸 收峰，在2 8 0 n m 处有肩，2 2 0 n t o 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因此在 2 8 0 3 2 0 n m 之间出现吸收峰，而在2 2 0 n m 的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团 【9 】 o 黑龙江大学硕士学位论文 覆 - c 至 口o 审 0 t 拳 图1 2 纳他霉素的紫外吸收光谱 。 f i g 1 - 2u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r u mo f n a t a m y c i n 1 1 3 纳他霉素的活性与稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物。j g o o s t e n d o r p 1 0 】等人研究发现 纳他霉素在室温下保存几年只有很小一部分失去活性，其三水合物同样稳定；但 无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存4 8 小时失去1 5 的活性。中性的纳他 霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。 纳他霉素在p h 值4 5 9 之间非常稳定，在极端p h 值下纳他霉素迅速失活， 形成各种各样的分解产物。但p h 对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响【l 。荷 兰g i s t b r o c a d e s 公司报道，纳他霉素于3 0 。c 储存三星期，在p h 5 7 的范围内， 纳他霉素的活性仍保持1 0 0 。p h 值3 6 时保持大约8 5 ，p h 值9 o 时仅剩大约 7 5 。但在大部分食品的p h 范围内，纳他霉素十分稳定。 纳他霉素在室温条件下是稳定的，温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中 性水溶液中) 。由于具有环状化学结构，纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。 丫辐射也能使纳他霉素分解【1 0 1 。 纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下降。 防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基轻基茵香醚、丁基 甲苯等。一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞等 重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加e d t a 烈；f 第1 章前言 或聚磷酸盐来防止失活f l l 】。 1 1 4 纳他霉素的作用机制 纳他霉素是一种高效、广谱的抗真菌试剂，能有效抑制和杀死霉菌、酵母、 丝状真菌，其抑菌作用机制为：纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分 以范德华力和真菌细胞质膜中的麦角固醇结合，形成膜多烯化合物，破坏细胞质 膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜 的通透性，从而引起细胞内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。由于细菌的 细胞壁和细胞膜不存在这些固醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用【1 2 1 【1 3 】。 纳他霉素对于抑制j 下在繁殖的活细胞效果较好，而对于破坏休眠的细胞则需 较高的浓度，其对真菌孢子也有一定的抑制效果【刀，抑菌谱见表1 2 。 表1 2 真菌对纳他霉素的敏感性 t a b l e 1 2t h es e n s i t i v i t yo ff u n g it on a t a m y c i n 黑龙江大学硕士学位论文 d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 1 4 】研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们 在连续数年使用纳他霉素的乳酪仓库中也没发现真菌形成抗性的证据；经过人为 诱导，也没发现真菌对纳他霉素形成抗性。纳他霉素的强抑菌活性和稳定性是真 菌不会产生抗性的原因。 1 1 5 纳他霉素的安全性与毒性 纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸。纳他霉素很难被消化道吸 收，给奶牛喂饲高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产物经粪 便排出【1 5 】。l e v i n s k a s t l q 等研究纳他霉素的急性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对 人体器官没有明显影响，也不产生伤害。h a m i l t o nm i l l e r l l 7 1 报道纳他霉素口服毒性 最小，静脉注射毒性极大。据报道，人体口服5 0 0m g 纳他霉素后，在血液中的含 量少于l m g m l f l 5 1 。 1 2 纳他霉素应用 1 2 1 纳他霉素在食品中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂【l 引。我国食品添 加剂标准化技术委员会在1 9 9 6 年正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂使用。 纳他霉素作为生物防腐剂具有以下特性【1 9 】：( 1 ) 无特殊感观形状：由于纳他霉 素是无气味、无味道的白色粉状物，它对食物的口感特性无任何影响，( 2 ) 适用p h 值范围广：纳他霉素和山梨酸钾等化学防腐剂相比，在p h 值3 9 范围内具有活 第1 章前言 性，其适用的p h 值范围更宽；( 3 ) 低剂量，高效率：由于真菌对纳他霉素极为敏感， 使用微量即可起到抑菌作用，其对霉菌和酵母菌的抑菌作用比山梨酸钾强5 0 倍以 上1 2 】；( 4 ) 专一性好：由于纳他霉素对细菌没有作用，可直接泐口到酸奶等发酵制 品中，只抑制其中的霉菌和酵母菌，却不作用于酸奶中的细菌。 纳他霉素作为食品表面防腐剂可以增加货架期，主要在奶酪、肉制品、葡萄 酒、茶饮料及果汁中添加。它在食品中的抗真菌作用是双效的，既可防止真菌引 起的食品腐败，减少经济损失；又可防止真菌毒素给人类造成的毒素型食物中毒 1 9 l 。 1 2 2 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素不仅可作为食品防腐剂，还可药用，主要用于抗皮肤和粘液膜的真 菌感染。近年来，纳他霉素的应用范围也越来越广泛，还可用于阴道和肺部真菌 感染的治疗。除此之外，钟文贤2 0 】等报道纳他霉素已成功的用于真菌性角膜炎的 治疗中。 作为外用型抗真菌药物，纳他霉素主要具有以下一些优良性质：非常低的口 服毒性；没有证实通过肠道吸收；没有发现过敏性；从来没有碰到交叉抗性。 1 3 纳他霉素研究进展 1 3 1 纳他霉素产生菌与合成途径的研究进展 1 3 1 1 纳他霉素产生茵及其特征 目前，报道的纳他霉素产生菌有三种； 1 ) 纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) 孢子丝2 - - 5 圈松散螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。在琼脂培养 基上，气丝白色或黄灰色，浅褐灰色，浅灰红褐色。 2 ) 恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t a n o o g e n s i s ) 孢子丝呈螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。在大部分 培养基内，基丝呈橙黄色至深黄橙色，可溶色素同基丝色。 7 黑龙江大学硕士学位论文 3 ) 褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 孢子丝呈螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。在琼脂培养基上， 气丝丰茂、微褐，近于浅褐色，边缘白色，反面浅黄色。 1 3 1 2 多烯大环内酯合成途径 多烯大环内酯类抗生素的生物合成途径可以分解为前体的生成( 乙酰辅酶a 和 丙二酰辅酶a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的形成。多烯大环 内酯类抗生素合成途径见图1 - 3 1 8 1 。 ，r - 一- - _ - - 一。一一- 一一。 。 l 鼍鼍蕾 ： l i i ， i 譬簟 i l l 砖每曩- l o ，l 一。 ： ll 【 坶垭l 嚣 。哪性一 注：代表能量代谢 代表癍阻断的代谢途行 图1 - 3 多烯人环内酯抗生素的生物合成途径 f i g 1 3s y n t h e s i sr o u t eo f p o l y e n ef a m i l yo fa n t i m y c o t i c s 1 3 1 3 纳他霉素生物合成调控及前体物质在合成中的作用 纳他霉素的生物合成是以乙酰c o a 和丙二酸单酰c o a 为前体。丙二酸单酰 第1 章前言 c o a 的合成有两条途径：一条是由磷酸烯醇丙酮酸经丙酮酸生成乙酰c o a ，再在 乙酰c o a 羧化酶催化下，生成丙二酸单酰c o a ；另一条途径是在磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶催化下，生成丙二酸单酰c o a 。陈刚新【2 2 】等人发现葡萄糖被氧化时所产生 的过量的a t p 对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶有反馈抑制作用；另外，过量的a t p 对柠 檬酸合成酶有反馈抑制作用，柠檬酸和异柠檬酸的合成减少，而柠檬酸、异柠檬 酸对草酰乙酸脱羧酶有激活作用，所以过量的a t p 会使草酰乙酸生成量减少，从 而抑制了抗生素的产生。 前体物质在抗生素合成过程中起着重要作用，范代娣【2 4 j 等向发酵液中添加前体 正丙醇可将红霉素发酵效价提高2 7 3 。次级代谢途径同初级代谢的分解代谢紧密 相关，其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。在纳他霉素的生物合 成中，其内酯环的形成是以乙酸为起始单位、丙二酸为延续单位通过与脂肪酸合 成相似的聚酮体途径缩合而成，这说明其重要前体物质是短链脂肪酸【2 3 1 。 但是，外源前体在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗生素 的合成。因此，研究适当的前体添加策略对有些抗生素的高产稳产有重要意义。 1 3 2 国内外纳他霉素发酵工艺研究进展 已报道的专利和论文中对纳他霉素产生菌发酵工艺的研究主要包括培养基成 分( 碳源、氮源、碳氮比等) ，培养条件( p h 值，温度，溶氧量等) ，接种物类型等方 面。 1 3 2 1 培养基成分 发酵过程中，培养液各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成。纳 他霉素以葡萄糖作为碳源时产量最高，这可能是因为葡萄糖的中间代谢产物能渗 入到纳他霉素的分子中去。p t 奥尔森【2 5 】的专利报道了在发酵前期葡萄糖浓度一 般为4 0 9 l ，到发酵后期则应降为2 0 9 l ，这时菌体的生长和纳他霉素的产量均能 达到最佳值。同时要在发酵中流加补充适当的碳源( 葡萄糖) ，何艳玲【2 6 】等通过研究 发现整个发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度降至2 0 9 l 以下开始补糖，流加量控 制在维持发酵液糖浓度为2 0 9 l ，这样可使菌体浓度基本不增或略增，使产生菌的 黑龙江大学硕士学位论文 代谢趋于大量合成纳他霉素。葡萄糖总流加量控制在2 0 - - 一2 5 9 l ，最终可使纳他霉 素的产量提高到2 3 0 9 r e 。陈冠群【2 刀等人报道，从第4 5 h 开始流加5 0 葡萄糖，以 发酵液中葡萄糖水平为控制指标，维持葡萄糖浓度2 0 9 r e ；培养时间为9 3 h 。最终 纳他霉素产量达到2 9 7 9 r l 。 e n s h a s yh a 凶等的研究表明，氮源的类型对茵体生长和纳他霉素的产量有较 大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是 牛肉浸出物，所以将两种氮源混合使用则使纳他霉素的产量增加两倍，摇瓶中达 到1 5 0 9 r e 。另有p t 奥尔森【2 5 】的生产工艺中使用的氮源是大豆蛋白抽提物与酵母 抽提物的混合物，李颖辉，李东【2 9 】报道的氮源为4 低聚糖和0 1 5 酵母粉+ 4 鱼粉。 碳氮比同样也是一个关键因素，在e i s e n s c h i n k l 3 0 】的专利报道的流加碳、氮源 进行纳他霉素发酵的过程指出发酵培养基中至少应有1 5 9 l 的蛋白氮源和8 2 5 9 l 的碳源，其中碳源要不断流加，使碳源浓度保持在5 - - - 3 0 9 r e ，纳他霉素产量 可达至少5 9 l 。 1 3 2 2 培养条件 通过控制发酵培养基的p h 值可以提高纳他霉素的生产速率，m a 艾森申克p l 】 的专利报道认为在纳他霉素的发酵主阶段即抗生素生产阶段，向发酵液中加入适 宜的p h 控制剂( 如n a o h ，k o h ，c a ( o h ) 2 等) 以控制发酵液p h 值，使其维持在5 9 6 1 ，可提高纳他霉素生产速率和产率，一般生产时间可以减少2 0 - - - 6 0 ，产量 可达5 9 l 。何艳玲【2 5 1 等报道在控制p h 值的5 l 自动罐间歇补料分批发酵过程中， 当p h 值降至5 3 以下时，用2 m o f l 的n a o h 维持p h 值在5 3 5 4 范围内，直到 发酵结束，可使纳他霉素产量提高到2 4 9 l 。另有陈冠群【2 7 】报道，在5 l 机械搅拌 发酵罐中进行的控制p h 值间歇流加培养实验将p h 控制为4 5 小时前保持6 5 ，4 5 小时后保持5 5 ，最终纳他霉素产量达到2 9 7 9 , t l 。 发酵过程中培养基的溶氧水平对纳他霉素的产量也会产生一定的影响。 e n s h a s yh a 【2 8 1 等发现向培养基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸钠可以降低溶 氧，使纳他霉素产量下降。在连续发酵法生产纳他霉素过程中，发酵在好氧条件 第1 罩前言 下进行，搅拌速度在不同时期有所不同。p t 奥尔森【2 5 1 在发酵的第一阶段进行有效 的种菌繁殖，并伴随部分纳他霉素的产生，搅拌速度是5 0 0 r r a i n 。到发酵第二阶段 进行连续生产，由于产物及代谢副产物的积累，产物的产生速率有所下降，故应 适当增加搅拌速度以保持发酵罐内足够的溶解氧水平。目前，国内骆健美【3 2 】等报 道的发酵过程中起始转速多为5 0 0 r m i n ，随着菌体进入对数生长期，溶解氧水平从 初始1 0 0 迅速下降，此时应不断提高转速，转速最高时可达5 5 0 r m i n ，维持溶解 氧水平不低于4 0 。进入抗生素分泌期，适当降低搅拌转速，维持溶解氧水平在 2 0 3 0 。 陈冠群鲫等在对褐黄孢链霉菌进行研究时发现，在初始培养基中加入o 5 的 磷酸镁并在快速生长末期加入o 1 的丙酸钠能提高纳他霉素的产量，使之达到 2 7 9 9 l 。骆健美等向发酵培养基中添加可降低细胞能荷水平的氰化物能有效提 高发酵水平；向发酵培养基中加入能捕捉铵离子的磷酸镁同样有利于纳他霉素合 成。 1 3 2 3 接种物类型 发酵过程中接种物类型对纳塔尔链霉菌摇瓶发酵产生纳他霉素有一定影响， e n s h a s yh a 渊用孢子接种得到的纳他霉素产量比用营养细胞接种的高4 0 。因此 发酵法生产纳他霉素的种菌培养和繁殖方法，要求用一种适宜的生孢子琼脂培养 基，种菌繁殖所用的孢子悬浮液的孢子浓度约为1 0 5 1 0 8c f u m l 。b a n e r j e er 【3 2 】 等研究发现适宜的种子密度应含有约1 5g l 的干细胞重，接种量为纳他霉素生 产培养基体积的o 1 - - 一1 0 。目前国内发表的论文所用于接种的孢子悬液浓度均 为1 0 8 个m l 。 1 3 3 发酵工艺优化方法响应面优化法 优化发酵工艺实质是考察各实验因素对优化目标的效应以获得各因素对目标 值的影响关系，进而以此为基础确定最优操作条件。微生物的发酵过程涉及微生 物性质( 种类、种龄、活力，接种量) ，生长条件( p h 值、温度) ，培养基组成， 传递条件( 溶氧量或转速、搅拌速度) 等多个变量，所以不仅要考察每个因素的 黑龙江大学硕士学位论文 效应，还应考察是否存在不同因素的协同效应。 正交试验设计曾在发酵工艺优化中得到普遍应用，这种方法注重如何科学合 理地安排试验，寻找最佳因素水平组合；但它对试验数据的统计处理不够重视， 相关的检验欠缺，并且不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明 确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值 的最优值。为此，响应面优化法应运而生，它是将体系的响应作为一个或多个因 素的函数，建立各因素对目标的数学表达函数并运用图形技术将这种函数关系显 示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。这种方法试 验次数少、周期短，求得的回归方程精度高，是能研究几种因素间交互作用的回 归分析方法 3 4 1 。 在应用响应面优化法优化发酵工艺时，一定要有意识的应用统计手段，首先 确定各个因素的效应大小，选择重要的因素进行重点考察，即抓住主要矛盾，而 后再集中精力优化关键因素。目前，人们主要采用p l a c k e t t b u r m a n 设计法或限制 性随机平衡法( r e s t r i c t e dr a n d o mb a l a n c ed e s i g n ) 来考察各因素的效应大小并确定 重要因素。 p l a c k e t t b u r m a n 设计法【3 习是一种以不完全平衡块( b a l e n c e di n c o m p l e t eb l o c k s ) 为原理的部分析因实验设计法，试图用最少实验次数使因素的主效应得到尽可能 精确估计，能够从众多考察因素中快速、有效地筛选出最为重要的几个因素，以 供进一步研究。w i l l i a m s 3 6 】将p l a c k e t t b u n m a n 设计法与随机平衡实验、部分因子 实验相比较，认为该方法在筛选重要因素方面最为有效和准确。 2 0 0 7 年，杨承剑【3 7 1 等采用p l a c k e t t - b u n m a n 设计法从1 3 个对啤酒糟培养基中 对益生菌生长有影响作用的因子中筛选得到发酵温度、尿素、硫酸铵为影响活菌 总数的主要因子，从而证明用p l a c k e t t b u n m a n 设计法筛选显著因子是一种经济而 有效的试验设计方法。 响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域拟 合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。所以，要先逼近最佳值 区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法【3 8 1 以实验值变化的梯度方向 第1 章前言 为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳 值区域。 在靠近最佳值区域后，优化法将采用响应面分析法来寻求效应的极值点。响 应面分析法( r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ) 3 9 】是一种数学统计方法，用于研究多因子系 统中因子交互作用及达到最大响应值时所对应的最佳条件。虽然它与传统的“正 交实验法”都建立在正交设计原理的基础上，但较后者更为有效。其中较常用的 是中心组合设计( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ) 4 0 】，根据相应的实验表进行实验后，对 数据进行二次回归拟和，得到带交互相和平方项的二次方程，最后在一定范围内 求出最佳值。 借助s a s ，s p a a ，s t a t i s t i c s 等统计手段，可以快速完成数据的分析、模型构 建及假设检验。而且这些统计软件还特供了强大的绘图能力，可以看到所建模型 的三维图像，得到直观影响，轻松进行最优求解得到优化条件【4 1 】【4 2 】。 2 0 世纪7 0 年代起，响应面优化法就开始被应用于食品工业【4 3 1 ，目前，响应面 分析法已经在微生物培养、抗生素发酵条件优化等生物技术的众多领域得到广泛 应用并取得了很多令人满意的成果【删【4 5 】。 2 0 0 6 年，郭小华删等利用p l a c k e t t b u n r n a n 设计法从1 1 种培养基原料中筛选 出4 种对益生芽孢杆菌m a l 3 9 芽孢产量有显著影响的因素，并用最陡爬坡试验及 中心组合设计优化得到产芽孢的最佳培养基。试验证明，在最佳培养基条件下培 养可使芽孢率达到9 6 ，从而有效的提高了单位产芽孢的数量。 2 0 0 6 年，熊智强f 4 7 】等利用全因子实验设计筛选出对链霉菌7 0 2 产红谷霉素的重 要影响因子黄豆饼粉和工业蛋白胨，应用最陡爬坡实验法接近重要因子的最优水 平，然后应用中心组合设计确定重要因子的最优水平。试验结果表明，采用优化 后的培养基，其发酵液红谷霉素效价比优化前提高了3 0 8 倍。这也说明响应面优 化法在抗生素发酵培养基优化领域也是行之有效的优化方法。 2 0 0 7 年，响应面优化法被应用到纳他霉素发酵培养基及发酵条件的优化工作 中。徐广宇4 8 1 等采用p l a c k e t t b u n m a n 法、最陡爬坡实验和响应面实验( b o x b e h n k e n 设计法) 相结合的方法对褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的发酵培养基及发酵条件进行 1 3 黑龙江大学硕士学位论文 优化。结果表明，培养基中的蛋白胨、p h 和摇瓶装液量是影响纳他霉素产量的主 要因素，并得到优化后的培养基组成和发酵条件，在此条件下，纳他霉素产量较 优化前提高了9 4 ，从而证明了采用响应面优化法对纳他霉素发酵工艺进行优化， 不仅科学合理，而且快速有效。 1 3 4 纳他霉素产生菌的基因工程研究进展 近年来，基因工程在抗生素生产中的应用越来越广泛，链霉菌由于其在生产 抗生素方面的特殊作用而成为放线菌分子生物学研究的核心。研究热点主要集中 在链霉菌形态分化基因的研究p 9 1 、转移质粒的构建【5 0 】 5 l 】及基因转移方法的改进( 如 原生质体转化、电穿孔等) 等方面【5 2 】【5 3 】。 如将t e 结构域融合到相应组件的羧基端或将所需组件插入到相邻组件之间， 进而改变内酯环的大小，以及通过在组件中增加d h 结构域，使羟基进一步还原 等研究工作己经在红霉素基因工程中得以实现f 5 4 1 。d a nf e r b e r 【5 5 1 利用基因工程使聚 酮化合物在大肠杆菌中得以合成。m e n d e sm v 1 5 6 1 等通过中断纳他霉素修饰基因 p i m d ，获得了新型环氧纳他霉素。 目前，对纳他霉素生物合成途径的了解还不象阿维菌素、红霉素等抗生素那 么清楚。尤其是合成途径中的某些基因功能还未完全明确，整个合成途径的调控 也还未知，对纳他霉素的结构改造工作也仅是刚刚开始。但随着人们对纳他霉素 生物合成基因簇理解的不断深入，将积极推动采用基因工程技术提高纳他霉素生 物合成能力或改造其化学结构的工作，而这些研究最终将促进抗生素产量、质量 的不断提高和新型抗生素的发现。 1 3 5 纳他霉素分离提取的研究进展 纳他霉素是一种分泌到细胞外的抗生素，由于它在水溶液中的溶解度很小， 往往吸附在菌丝体表面或形成微小的结晶，其分离提取方法也有很多相关报道。 常用到的分离工艺包括甲醇法【5 7 】和