（植物学专业论文）根癌农杆菌介导的psag12ipt基因转化蓝猪耳的研究.pdf

望堕师蔓盔堂塑土研究生学位论文根癌农杆菌介导的。，r 胛基因转化蓝猪耳的研究 摘要 蓝猪耳( t o r e n i a f o u r n i e r il ) 是一种重要的热带、亚热带观花植物，盛花期 较长，且具备特殊的裸露胚囊，是一种研究植物花器官发育和授粉受精过程的理 想模式植物。嵌合基因p y _ g 1 2 i p t 由来源于拟南芥的衰老特异表达的启动予 s a g l 2 与来源于农杆菌质粒的致瘤基因区( t m r ) 的编码细胞分裂素合成酶的基 因( 异戊烯基转移酶i p t ) 组成，常用于转化植物以提高被转化植物抵抗衰老的 能力。 本研究利用限制性内切酶x b ai 消化双元载体p c a m b i a l 3 0 1 和载体 p s g 5 1 6 并连接然后转化大肠杆菌d h 5d 最终得到的双元表达载体p h q i p t ， 含目的基因p s a a t 艘g u s 报告基因、h y g r o m y c i n 抗性基因。用冻融法将 其导入了根癌农杆菌e h a l 0 1 。 本研究以在组培苗蓝猪耳叶片为外植体。在共培养基中与根癌农杆菌 e h a l 0 1 p 1 4 0 t r r 共培养4 d 后，g u s 瞬时表达检测9 0 的外植体为阳性。叶片 外植体在诱芽培养基( c e f 5 0 0 m g l ，h y g l s m g l ) 上筛选2 0 d 后移到生根培 养基( c e f 5 0 0 m g l ，h y g o m g l ) 上培养1 5 d ，然后再移到生根培养基 ( c e f s o o m g l ，h y g l 5 m g l ) 上筛选2 0 d 即可得到g u s 染色检测为阳性的 抗性芽。g u s 染色检测、p c r 检测、s o u t h e mb l o t 、n o r t h e r n b l o t 确定九株 抗性株为转基因植株。九株转基殿拣与对照盼形态有所不同，表现为侧芽 的无限增殖，叶片小且卷髓、根少且短，类似于细胞分裂素的过量表达。推 测蓝猪耳幼苗中具有激活翩伪2 特异启动予的反式作用因予，使得i p t 基 因过量表达所致。 关键词：尥研胛基因，蓝猪耳，根癌农杆菌，遗传转化 v 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的p s i g j r i p t 基n 转化蓝猪耳的研究 a b s t r a c t t o r e n i a f o u r n i e r il i sa ni m p o r t a n tf l o w e rt h a tg r o w si n s e m i t r o p i c sa n dt r o p i c s ， w i t hs p e c i a la n dn a k e dm e g a s p o r e a n di ti sa l s oam o d e l p l a n tw h i c h c a nb eu s e dt o s t u d yf l o w e ra p p a r a t u s sd e v e l o p m e n ta n dt h ep r o g r e s so fi m p r e g n a t i o n c h i m e r i c g e n ep s a m z - i p t i sc o m p o s e do fs a u l 2c l o n e df r o m a r a b i d o p s i s t h a l i a n aa n di p t c o m e df r o mt h et m r r e g i o n o fp l a s m i do fa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s a n de n c o d i n g i s o p e n t e n y lt r a n s f e r a s e t h i sc h i m e r i cg e n ei sa l w a y su s e dt ob et r a n s f o r m e dt o p l a n ti no r d e r t oi m p r o v ei t sr e s i s t a n c e i nt h i s s t u d y , t h ev e c t o r 删b 弧1 3 0 1 a n dt h ev e c t o rp s g 5 1 6w e r ec u tb y x b ai 。a n dt h e nw e r el i n k e d 。a f t e rl f 髓s f o r m e dt oe c o u d h s a ，w eg o tt h e e x p r e s s i o n v e c t o r p h q i f f t h i s v e c t o rh a st h et a r g e tg e n e ，t h e r e p o r t e rg c n eg u s ，t h e s e l e c t i o n gg e n eh y g r o m y c i n u s i n gf r e e z i n g - m e l t i n gm e t h o d ，t h ee x p r e s s i o n v e c t o rp x q n tw a st r a n s f o r m e dt oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s l e a fd i s c so ft o r e n i a ，o 融一la n d a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sc o c n l t u r e o nc o c u l t u r em e d i u ma f t e r4 d a y s n i n e t yp e r c e n to ft r a n s i e n te x p r e s s i o no f g u s g e n e o f e x p l a n t s a f t e rc o c u l t u ma r e p o s i t i v e 。t h ee x p l a n t w a ss e l e c t e do n s h o o t - i n d u c e d m e d i u m ( c e f s 0 0 m g m ，h y g l 5 m g l ) a f t e r 2 0 d a y s ，t h e n w a s t r a n s f e r e dt or o o t i n gm e d i u m ( c e f s 0 0 m g l ，h y g o m g l ) a n ds t a y e d1 5d a y s t b e e x p l a n t t h e nw a st r a n s f e r r e dt o r o o t i n gm e d i n m ( c e f 5 0 0 m g l h y g l 5 m g l ) 2 0 d a y s a f t e r t h i sd i s p o s a l , w e g o t n i 地r e s i s t a n t s h o o t e x p r e s s i o n o fg u s g e n e o ft h e s e r e s i s t a n ts h o o ta r ep o s i t i v e p e r , s o u t h e r nb l o ta n dn o r t h e r nb l o ta n a l y s i sc o n f i r m e d t h a tp 啪l 矗p tg o n ew a sa l r e a d yi n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo ft o r e n i af o u r n i e r i l b u tt h em o r p h o l o g yo ft h e s es h o o tw e m d i f f e r e n tt ot h a to fw i l dt y p o s t h e s el a t e r a l b u ds e e ml i m i t l e s sp r o p a g a t i o n , t h e s el 睫v a s 辩s m a l la n dc r i s p ，t h er o o t so ft h e s e p l a n ta r es h o r t a n dl i t t l e p h a p a st i l d ea r e8 0 m e s p e c i a lt l a n s - a c t i n gf a c t o r sj nt o r e n i a f o u m i e r i l t h a t c 强a c t i v e s a g 2 p r o m o t e r , a n d t h e l f t g e n e i s o v e r e x p r e s s e d k e yw o r d s ：j k 研2 _ ，p za g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s , t o m n m f o u r n i e r ik g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n v i 华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人主l 乒盏一向本学位论文答辩委员会提交 题为雏盔础熊齄陆垡二望：盟国轻翻珏蠲堕磕的硕士论文， 经答辩委员会审议，本论文答辩合格，特此证明。 学位论文答辩委员会委员( 签名) 主席：己p 磊 委员： 论文指导老师( 签名) ： 朋年6 月旷日 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的p 0 掰，胛基因转化蓝猪耳的研究 缩写名 2 4 d a m p a s b a b s a c a m v c c f c i a b d d h 2 0 d e p c d m s o d d n t p e d i a g u s h h y g i p t k a n k b l b m m c s m o p s m s n a a n a a c n a c l n a o h n g o d 缩略词 英文名 2 , 4 一d i c h l o r op h c n o x y a c e t i c a c i d a m p i c i l i n a c e t o s y r i n g o n e 6 - b c n z y l a m i n o p u r i n e b o v i n es e r u ma l b u m i n c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s c e f t o m i n e c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m c m y l s u l f o x i d e d a y d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e e t h l e n e d i a m i n et c t r a c e t i ca c i d g l u c u r o n i d a s e h o u r h y g m m y c i n i s o p e u t e n y l t r a n s f e r a s e k a n a m y c i n k i l o b a s e i 崩ab e r t a n im e d i u m m o l a r m u l t i c l o n es i t e m o r p h o l i n o p r o p a n e - s u l f 砸c a c i d m u r a s h i g e a n d s k o o g m e d i u m n a p h t h a l a n e a c e t i ca c i d d i c l o f e n a cs o d i u m s o d i u mc h l o r i d e s o d i u m h y d r o x i d e n a n o g r a m o p t i c a ld e n s i t y v 缸 中文名 2 , 4 二氯苯氧乙酸 氨苄青霉素 乙酰丁香酮 6 苄基腺嘌呤 牛血清蛋白 花椰菜花叶病毒 头孢霉素 十六烷基三甲基溴化铵 双蒸水 焦碳酸二乙酪 二甲基亚砜 天 脱氧核糖核苷酸 乙二胺四乙酸 葡糖醛酸酶基因 小时 潮霉素 异戊烯萋转移酶 卡那霉素 千碱基 l b 培养基 摩尔 多克隆位点 丙磺酸 m s 培养基 萘乙酸 醋酸钠 氯化钠 氢氧化纳 纳克 光密度 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的氐。们r 胛基因转化蓝猪耳的研究 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i f r i f a m p i e i n r n a s er i b o n u c l e a s e r p m r o t a t i o n sp e rm i n u t e s d ss o d i u m d o d e c y l s u l f a t e s a gs e n e s c e n c e a s s o c i a t e dg e n e t a q a s e t h e r m u s a q u a t i e u sd n ap o l y m e r a s e t - d n at r a n s f e rd n a t et r i s - e d 呵a t m m e l t i n gt e m p e r a t u r e t r i st r i so a y d r o x y m c t h y l ) a m i n o m e t h a n e i r i s h c l1 r i sh y d r o e h l o r i d e p l m i e r o l i t r e # t o o l m i c r o m o l a r 5 - b r o m o - 4 c h o l r o - 3 i n d o l y l p - d x g l u c 。 g u c u r o n i d e 聚合酶链式反应 利福平 核糖核酸酶 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 衰老特异基因 嗜热水生菌聚合酶 转移d n a t r i s e d t a 缓冲液 解链温度 三羟甲基氨基甲烷 t r i s 盐酸 微升 微摩尔 5 溴4 - 氯3 吲哚b d 葡 糖醛酸 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的( 7 1 2 胛基因转化蓝猪耳的研究 研究概况 1 细胞分离素及g 1 2 - i p t 基因的研究进展 l _ 1 植物衰老及细胞分裂素 植物衰老是一种植物器官或组织在长期进化和适应环境的基础上逐步走向 功能衰竭和死亡的交化过程，是一种程序性的死亡所以又称之为程序化死亡 ( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ，p c d ) ( 余叔文，1 9 9 2 ) ，是植物发育生物学的研究热 点。在植物衰老的过程中，常伴随一些基因表达的变化：一类是在衰老过程中 m r n a 水平下降的基因，称之为衰老下调基因( s e n e s c e n c ed o w n r e g u l a t e d g e n e s , s d g s ) ，如编码与光合作用有关蛋白质、电子传递体、光系统n 的基因等 ( j i a n g ，1 9 9 3 ；k a w a k a m i n ，1 9 8 8 ；m i t s t t h a s h i ，1 9 9 2 ) ；另一类是伴随着衰老过 程m r n a 水平上升的基因，通常称之为衰老相关基因( s e n e s c e n c e a s s o c i a t e d g e n e s , s a g s ) ，如s a g l 2 ，s a g l 3 ( l o b m a n ，1 9 9 4 ) l s c 5 4 ( b u c h a n a n ，1 9 9 4 ) 。 细胞分裂素作为一种植物生长发育的重要调节剂，是一类较活跃的植物激 素，具有促进细胞分裂和扩大、诱导芽分化、延缓叶片衰老、消除顶端优势、促 进侧芽生长的功能( 潘瑞炽，1 9 9 5 ) 。r i c h m o n d ( 1 9 5 7 ) 在观察细胞分裂素阻止 欧龙牙草离体叶片的蛋白质和叶绿体的损失的实验中证实细胞分裂素具有延缓 植物衰老的作用。在植物的衰老过程中，它调节了叶绿体的合成、物质的分解代 谢、矿质营养的转移和再分配等多种生理生化过程，在分子水平上，对衰老相关 基因的表达起到了激活、表达增强和表达抑制等而具有延缓植物衰老的作用。所 以向植物喷施细胞分裂索能增加植物叶绿体的含量、延缓其衰老，但过量施用细 胞分裂素则会导致植物丧失顶端优势，植株矮化，根生长受至q 抑铝l ( d e v f i n ，1 9 8 3 ； h o r g a n ，1 9 8 4 ) ，因此需要采用一种适当的方法来解决细胞分裂素过量表达带来 的问题。 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的氏。删r 脚基因转化蓝猪耳的研究 f 1 2p s a o j z - i p t 基因研究进展 t a y a ( 1 9 7 8 ) 和陈正茂等( 1 9 8 2 ) 分别从微生物粘液菌和高等植物烟草愈 伤组织中分离、鉴定了一种在细胞分裂素生物合成中起重要作用的限速酶，该酶 全称为异戊烯基转移酶( i p t ) ，它在细胞分裂素合成途径中的关键步骤d m a p p ( 二甲基丙烯基二磷酸) 和5 a m p ( 腺苷酸) 发生缩合和去磷酸化反应中起作用 ( 张治礼等，2 0 0 2 ) 。b a r r y ( 1 9 8 4 ) 等从野生型农杆菌质粒的致瘤基因区( t m r ) 分离出一个编码细胞分裂素合成酶的基因( 异戊烯基转移酶f p f ) ，使得采用转基 因方法在植物细胞内合成细胞分裂素得以实现( b a r r y ，1 9 8 4 ：a k i y o s h i ，1 9 8 4 ) 。 而采用组成型表达启动子( c a m v 3 5 s ) 或某些特异表达启动子( 如受热激诱导或 损伤诱导的启动予) 指导的越因表达实验表明，转基因植株虽能表现出一些 抗衰老的特性，但由于激素的过量产生导致了转化株的生长异常( 1 【i c c ，1 9 9 1 ； m e d f o r d ，1 9 8 9 ；s m a r t ，1 9 9 1 ) 。因此只有找到合适的启动子，对泖基因表达进 行严格的调控，即能延缓植物衰老又能使得转化株正常生长，才能达到应用目的。 l o h m a n 等( 1 9 9 4 ) 以m r n a 差异显示法从拟南芥上分离出一组衰老特异表达的 启动子，并证明其中的s a g l 2 是衰老高度特异的，该启动子指导的萋区表达随 衰老进程而加强，而在未衰老的植株中不表达，其基本原理是：当转基因植物叶 片开始衰老时脚口2 开始启动，l it 基阻开始表达，细胞分裂索含爨增加；当 细胞分裂素增加到一定程度时，剐俄2 房动子关闭，i p t 合成也停止，从而防止 了细胞分裂素的过量面导致的转化拣盼生长异常。 g 蛆等( 1 9 9 5 ) 将枷基因置于该扁动予之后导入烟草，结果表明该基因具 有自动调节细胞分裂素产生的功能，能延缓烟草叶片衰老，增加其生物产量及开 花结实率达5 0 以上，而不影响转化株的正常生长。付永彩等( 1 9 9 9 ) 利用基因 枪法将抑制衰老的嵌合基因凡榭r 阳转入水稻，使其表达，叶片衰老受到明显 抑制。曹孟良( 1 9 9 9 ) 通过根癌农杆菌法转化了水稻，并取得了阳性植株。刘丽 君等( 1 9 9 9 ) 将风彻2 _ _ | ：f ，磷入大豆中，得到转基因植株，其抗病性相关的指标 如m d a 、s o d 等都发生了有利于抗病性增强的变化。李洪清等( 2 0 0 0 ) 进行了 木薯的抗衰老、增加产量方面的研究，将p 幽珊2 上嘴过农杆菌法转入木薯中， 获得了转基因植株。n 等( 2 0 0 2 ) 利用农杆菌介导的遗传转化方法 冬珏 o z z - i p t 导入籼稻明恢6 3 ，获得了转基因植株，其叶片表现出衰老显著延缓：( 1 ) 转基因 2 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的r 。研r 胛基因转化蓝猪耳的研究 植株倒三叶的持绿性极显著延长：( 2 ) 两个纯合转基因株系比原品种的结实率 极显著提高，株高极显著降低；( 3 ) 两个纯合转基因株系的有效穗数比原品种极 显著或显著提高。 国外的相关报道有集中在s a g l 2 上，通过将s a g l 2 与一些基因嵌合来研究 一些物质在抗性方面的作用( n a o m i ，1 9 9 9 ：o r i ，1 9 9 9 ；h y e ，2 0 0 1 ：l u d m i l a ， 2 0 0 2 ) 。另外，m c c a b e 等( 2 0 0 1 ) 将尥g j z - i p t 转入莴苣中，来研究i p t 基因在 莴苣的形态发生及衰老中的作用，得到的转基因植株在第6 0 天仍未表现出衰老。 c h u g ( 2 0 0 3 ) 等通过将嵌合基因风4 c l r l p t 转入矮牵牛中，使咖f 在矮牵牛的花 中过量表达细胞分裂素以延长乙烯造成的花冠衰老和死亡。h u y n h ( 2 0 0 5 ) 将 p s a o l z - i p t 转入拟南芥中，得到了转基因株，将转基因株和对照置于淹水的条件 下5 d ，发现转基因株较对照的生物量、叶绿体的含景、碳水化合物的含量都有 提高，说明风4 0 1 2 - i p t 有助于提高植物的抗涝性。 2 蓝猪耳组织培养和遗传转化研究进展 2 。1 蓝猪耳简介 蓝猪耳( t o r e n i a f o u r n i e r il ) 又名夏堇、虎口仔，是玄参科蓝猪耳属的一年 生草本植物，大约有4 0 多个品种，其中大多数生长在亚洲和非洲的热带及亚热 带地区，其它美欧部分地区有引种。 由于蓝猪耳的表皮层能诱导出各种器官而且生长发育很快，所以一直以来， 蓝猪耳被作为离体器官发育研究的很好的材料( c h l y a h , 1 9 7 3 ) ，多用于研究花芽 的形成、分化及衰老( t a n i m o ta n dh a r a f l a , 1 9 8 1 ；t a n i m o t e t a l ，1 9 8 5 ；g o t o e t a l ，1 9 9 9 ) 。 蓝猪耳具备特殊的裸露胚囊( t e t s u y a e ta l ，1 9 9 8 ) ，在胚囊发育的四核期，胚 囊即从珠孔端伸出，在胚囊发育成熟时，助细胞、卵细胞和大部分中央细胞均暴露 在胚珠组织之外，是研究被子植物胚囊发育和受精过程的极好模式植物。 其作为重要的盆栽观赏花卉，不仅在园艺生产实践中占有重要的地位，而且 还具有很高的科研价值。日本、香港、澳大利亚、新西兰、美国等国家和地区的 科学家，已通过传统育种和分子育种等方法已获得了很多蓝猪耳变种，在改变花 3 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的尸量| 6 j r i p t 基n 转化蓝猪耳的研究 色、花型、花期以及提高其对环境的适应性等方面已取得了很多重大的成果。 2 2 蓝猪耳组织培养研究概况 1 9 7 1 年，c h l y a h 发现蓝猪耳的表皮层可形成各种组织器官。研究发现单独 施用6 - b a ( c h l y a h ，1 9 7 3 ) 可以诱导不定芽的产生。k a m a d a 等( 1 9 7 9 ) 发现， n a a 和i a a 能诱导蓝猪耳根和芽的产生，2 ，4 d 能诱导愈伤组织产生。t a n i m o t 等( 1 9 9 4 ) 报道了多胺对蓝猪耳茎段不定芽的形成有促进作用。h a d i 等( 1 9 9 6 1 提出了蓝猪耳组织培养的优化条件。李玲等( 2 0 0 1 ) 认为在1 2 m s 培养基上无 论有无激素都可发生不定根，只是n a a 可提高根的数日，改变根分布，加速根 生长，提高移栽成活率。佟晓南等( 2 0 0 2 ) 认为2 ，4 d 可促进叶和茎愈伤组织形 成，n a a 利于芽诱导。 2 3 蓝猪耳遗传转化研究进展 目前已经通过遗传转化成功地进行了蓝猪耳花期延长、基因沉默及花色改良 等方面的研究。加d a 等在1 9 9 5 年开始了蓝猪耳的遗传转化研究，利用根癌农杆 菌l b a 4 4 0 4 双元载体和叶盘法转化蓝猪耳获得了带有n p t i i 和g u s 活性的转基 因植株，并于1 9 9 8 年发现。蓝猪耳中g u s 基因的沉默不是由于等位基因的交互 作用引起的，而是由基因的剂量效应引起的( a i d ae ta l ，1 9 9 5 、1 9 9 8 、2 0 0 1 ) 。 a i d a 等( 1 9 9 8 ) 将乙烯合成关键酶a c e 氧化酶的正义和反义基因分别转入蓝猪 耳植物都得到了花期延长的新品种。野生型植物花期平均为2 天，而正义转基因 植物花期平均为2 7 7 1 天，反义转基因植物为2 5 - 2 7 天，经过转化得到的转基 因植株花期均比野生型延长。经过后代的遗传性分析，引入的性状可以在后代稳 定遗传。 s u z u k i ( 2 0 0 0 ) 用c 嬲和d f r 转化蓝猪耳，得到了蓝白镶嵌、纯白色转基 因植株。越d a 等( 1 9 9 7 ) 通过正义c h s 、d f r 和反义c h s 、d f r 转化蓝色蓝猪 耳得到白蓝镶嵌型和白色型花。a k a s h i 等( 1 9 9 9 ) 以蓝猪耳为材料克隆得到了一 个黄酮合成酶基因，其产物可催化黄烷酮( 或可能经过二氢黄烷酮中间产物) 直 接转化成黄酮。这推动了蓝猪耳花色形成机理的研究。d f r 基因失活导致黄酮 化合物( 很可能是辅色素) 积累，其与花色素形成复合物( 辅色素化) 使蓝猪耳 4 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的尸h g ，胛基因转化蓝猪耳的研究 花呈蓝色( a i d a 等，2 0 0 0 a 、2 0 0 0 b ) 。f u k u s a k i 等( 2 0 0 4 ) 将c h sm r n a 的编码 区和3 端的非翻译区分别作为r n a i 的靶位点，成功的诱导了基因的沉默，使 原来的蓝色花分别转变为白色和浅色的花。 3 根癌农杆菌介导转化的特点 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u r n 咖c i e n s ) 属于根瘤菌科( r h i z o b i a c e a c ) ，革 兰氏阴性菌，是寄主范围很广的土壤细菌。在自然状态下能通过伤口侵染植物导 致冠瘿瘤的发生。1 9 7 4 年z a e n e n 等发现根癌农杆菌砸质粒；1 9 7 7 年c h i l t o n 等 发现啊质粒中存在的d n a ( t r a n s f e rd n a ) 片断。1 9 8 8 年o o m s 等发现雨质 粒上有致瘤区即v i r ( v i r l e n c c r e g i o n ) 区。 3 1 根癌农杆菌介导基因转化的机理 根癌农杆菌t i 质粒上有多个重要的区域，其中对于基因工程最重要是 上述的t - d n a ( t r a n s f e rd n a ) 区和v i r ( v i r l e n c er e g i o n ) 区，农杆菌浸染植 物时，可分为下列步骤：农杆菌在植物伤口附着；受伤的植物分泌酚类化 合物诱导农杆菌内的t i 质粒的v i r 区基因表达；r d 基因的产物促进t - d n a 产生；t - d n a 与v i r e 2 蛋白结合形成t _ 复合物：t - 复合物从细菌细胞分泌 出来然后进入植物细胞的细胞核；t - d n a 整合到植物基因组并得到表达。 3 2 根癌农杆菌介导基因转化的优点 植物遗传转化技术是通过物理、化学或生物技术将外源基因导入受体 植物的基因组并使之在转化植株中表达的技术，常用的有农杆菌介导法、 病毒介导法、基因枪法、电激法、脂质体法、微注射法、花粉管通道法、 予房注射法等。与其他的转化方法相比，农杆菌介导的转化系统有许多突 出的优点( 王关林等，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 该转化系统转化效率高，重复性好。它利用天然的转化载体系统， t o d n a 在转移过程中受到v i r e 2 、v i r d 2 蛋白的保护，可免受核酸酶的降解。 不管是用菌株接种整体植物的伤口还是直接侵染离体培养细胞，都可以获 得较高的转化频率。 5 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的p s a 。j ，胛基因转化蓝猪耳的研究 ( 2 ) 在所有的转化系统中，农杆菌t i 质粒转化系统的机理研究得最清 楚，方法最为成熟，第一例转基因植物就是用此法获得的，迄今所得的8 0 的转基因植物也是通过该系统获得的。 ( 3 ) 能导入大片段的外源d n a 。t i 质粒的t - d n a 区能容纳较大片段 d n a 的插入，目前可把长达5 0k b 的异源d n a 序列完整的转入植物细胞 中。 ( 4 ) t - d n a 上含有引导d n a 转移和整合的序列，以及能够被高等植 物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入t - d n a 区的外源基 因在植物细胞中表达，或者使得连接不同启动子的外源基因在再生植物的 各种组织和器官中特异性表达。 ( 5 ) 导入的外源基因多为单拷贝，遗传稳定性好，且多数情况下符合 孟德尔遗传规律，能较好地为育种提供中间选育材料。 ( 6 ) 操作相对简便，不需要昂贵的仪器和设备。 4 本研究的目的及意义 植物衰老是植物器官或组织逐步走向功能衰退和死亡的变化过程，在发育生 物学上有着重要意义，而细胞分裂索在控制植物衰老的过程中又有着重要作用。 蓝猪耳是重要的盆栽观赏花卉之一，虽然其盛花期长，但是单朵花的花期较短， 在一定程度上影响观赏价值。目前，蓝猪耳离体培养条件成熟，遗传转化容易， 转基因稳定遗传，通过转弘基因来延长蓝猪耳的花期，在花卉的生产上有着较 为广阔的应用前景。 6 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的p 劓甜r i i ： t 基n 转化蓝猪耳的研究 二s a g l 2 - i p t 基因植物表达载体的构建及工程菌种的制备 1 实验材料 1 1 载体及菌株 质粒载体p c a m b i a l 3 0 1 ( c a m b i a 公司，澳大利亚) 和p s 0 5 1 6 由李洪清 老师提供，p c a m b i a l 3 0 1 带有潮霉素抗性基因和g u s 基因，基因表达由组成 型启动子c a m v 3 5 s 调控，g u s 基因包含一个内含子。p s g 5 1 6 上带有p s a m z - i p t 基因( 图2 1 ) 。 p c a m b i a l 3 0 1 p s g 5 1 6 图2 - 1 实验中用的两种载体 f i g u r e 2 1t h ev e c t o r su s e di no u re x p e r i m e n t s e c o l i d h 5t l 和根癌农杆菌e h a1 0 1 本室自存 1 2 主要试剂 t a q d n a 聚合酶、t 4 d n a 连接酶、限制性内切酶x b ai 、h i n d i i i 、e c o r i 购于t a k a l a 公司，1 k bd n a 、l a d d e rm a r k e r 、d n a 片段纯化回收试 剂盒购予北京鼎国生物技术公司，p c r 引物由赛百胜生物工程有限公司合 7 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的p s 4 g 1 r 胛基因转化蓝猪耳的研究 成。 普通生化试剂购于精科生化试剂公司，为国产分析纯。 1 3 培养基 注：配制固体培养基时加入琼脂( a g a r ) 1 5g i 2 实验方法 2 1 质粒酶切 参考t a k a l a 公司限制性内切酶使用说明书。采用x b ai 单酶切体系 反应体系为3 蛳l ，反应组分如下： p c a m b i a l 3 0 1 2 “l p s g s l 6 3 “l x b ai2 “l 1 0 mb u f f e r3 口l 0 1 b s a3 “l d d h 2 0 1 7 雎l 2 2 酶切产物的纯化 参考分子克隆实验指南( 第三版) ( 1 ) 取酶切混和液3 嘞l 加入水1 7 即l 使混和物体积达到2 0 0 # 1 。 ( 2 ) 加入等体积苯酚轻轻振荡混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 r a i n 。 ( 3 ) 取上清液移入另一支新离心管，加入等体积的氯仿，1 2 0 0 0 r p m 离 8 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的6 j z i p t 基因转化蓝猪耳的研究 心5 m i n 。 ( 4 ) 取上清液移入另一支新离心管，加入1 1 3 体积的n a a c ( p h 5 2 ) 轻 轻混匀。 ( 5 ) 加入两倍体积的无水乙醇，轻轻混匀。放入液氮中1 0 m i n 。 ( 6 ) 从液氮中取出离心管，室温融化，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清 液。 ( 7 ) 加入l m l 7 5 乙醇，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃上清。 ( 8 ) 室温晾干，加入1 础ld d h 2 0 溶解沉淀。 2 3 载体与目的基因的连接 反应体系2 吼l 酶切后的p c a m b i a l 3 和p s a 5 1 6 纯化物l 和 t 4 d n a 连接酶l l 1 0 x t 4 d n a 连接酶b u f f e r弘l 于1 6 连接过夜。 2 4 大肠杆菌感受态的制备 参考王关林、方宏筠主编植物基因工程原理与技术第二版，有改 动。 ( 1 ) 挑取e c o l id h 5 a 单菌落接种子3m ll b 液体培养基( 无抗生素) 中， 3 7 * ( 2 、2 2 0r p m 振荡培养过夜。 ( 2 ) 接2 0 0 p 1 种子液至5 0 m ll b 液体培养基中，3 7 ( 22 2 0r p m 振荡培养 至o d 。o = 0 5 o 6 。 ( 3 ) 将菌液倒入5 0m l 离心管，冰浴1 0 m i n 。 ( 4 ) 4 c ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n 。 ( 5 ) 弃上清，加入1 0 m l 预冷的0 1m o l l c a c l 2 ，轻摇悬浮菌体，冰浴3 0 r a i n 。 ( 6 ) 4 ，4 0 0 0 r p m 离心l o m i n 。 ( 7 ) 加入2m l 预冷的0 1m o l l c a c l 2 ，轻轻悬浮。 ( 8 ) 每管2 0 0 肼1 分装，7 0 ( 2 保存。 9 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的民副r i p t 基因转化蓝猪耳的研究 2 5 连接产物转化 ( 1 ) 取连接产物和l ，加入1 0 叩1 大肠杆菌感受态，冰上放置3 0 m i n 。 ( 2 ) 将l b 固体培养基( 含k a 5 0 m g l ，a m p l 0 0 m l ) 放入4 4 c 恒温 箱中预热。 ( 3 ) 将含连接产物的大肠杆菌感受态迅速而均匀地涂在预热的l b 固体培养 基( 含k a 5 0 m g l ，a m p l 0 0 m g l ) 上，放入3 7 4 c 恒温箱中振荡培养1 2 - - 1 4 h 。 ( 4 ) 挑取菌落入5 m ll b 液体培养基( 含k a5 0 m g l ，a m p l 0 0 m g l ) 中，放入3 7 2 2 恒温箱中1 8 0 r p m 振荡培养1 4 1 6 h 。 2 6 质粒的提取 2 6 1 提取缓冲液 碱裂解液i ：5 0m m o l lg l u c o s e 2 5m m o l l 嘣- h ( 1p h ：8 0 1 0m m o l l e 【) 1 ap h ：8 0 碱裂解液i i ：0 2 m o l l n a o h 1 s d s ( 现用现配) 碱裂解液：5m o l l k a e 6 0 m l 冰乙酸 1 1 5m i h 2 0 2 8 5 m l 2 6 2 提取步骤 ( 1 ) 吸取1 5 m l 菌液至1 5 m l 离心管中。1 2 0 0 0r p m 离心3 0 s 。 ( 2 ) 尽可能地弃上清，加入2 0 ( 0 1 预冷的碱裂解液i 中，用旋涡震荡器充分 振荡悬浮菌体。 ( 3 ) 加入4 0 0 l 新配制的溶液缓慢地上下颠倒离心管1 0 多次，混合 均匀，将离心管置于冰上，放置5 r a i n 。 ( 4 ) 加入3 0 0 l 预冷的溶液，上下颠倒离心管1 0 多次，混和混匀，冰 上放置1 0 r a i n 。 1 0 华南师范大学硕士研究生学位论文根癌农杆菌介导的 d g j r l p t 基因转化蓝猪耳的研究 ( 5 ) 46 c 、1 2 ，0 0 0r p m 离心5m i n 。 ( 6 ) 加入上清液0 7 倍体积预冷的异丙醇，室温放置1 5 2 0 r a i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心 5m i n ，吸去上清液。 ( 7 ) 加入1m l 的7 5 的乙醇洗涤d n a 沉淀，1 2 ，0 0 0r p m 离心1r a i n ，弃上清 液。 ( 8 ) 室温晾干至透明状，加入1 0 0 # 1 的无菌水溶解( 含2 9 l r n a 酶) 。 2 7 载体的酶切检测 参考大连宝生物公司限制性内切酶使用说明书。采用h i n d l r l 单酶切体 系反应体系为3 嘞l ，反应组分如下： p h o i p t 缸l h i n d l l l l 正| l 1 0 kb u f f e r2 “1 d d h 2 0 1 5 “l 2 8 载体构建流程图 见图2 - 2 2 9 根癌农杆菌e h a1 0 1 感受态的制各 ( 1 ) 挑取农杆菌单菡落接种于2 m ll b ( r i f5 0 r a g l ) 液体培养基中，2 8 1 2 2 0 0 r p m 振荡培养过夜。 ( 2 ) 取2 0 ( 0 1 菌液转入5 0 m l y e b 液体培养基中，在三角瓶中继续振荡至 o d 6 0 d = 0 。5 。 ( 3 ) 4 c4 0 0 0 - 5 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ，去上清液。 ( 4 ) 用1 0 m l 预冷的t e 缓冲液( p h7 5 ) 悬浮洗涤。 ( 5 ) 4 4 0 0 0 - 5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，荫体用5 m l 液体y e b 重悬。 ( 6 ) 在1 5 m l 的离心管中每管分装2 0 0 p l 即为制备好的感受态农杆菌，液氮 中速冻后在7 0 ( 2 冰箱中储藏备用。 1 1 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的p i 4 g 1 2 i p t 基因转化蓝猪耳的研究 x b ai 酶切 i t a d n ， x b ai 酶切 连接酶连接 图2 - 2 p s 4 a 1 2 - 1 p t 基因植物表达载体的构建 f i g u r e 2 2t h ec o n s t r u c t i o no fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r 1 p c a m b i a l 3 0 1 ：2 p s g 5 1 6 ；3 p h q i f i 0 ；4 p h q i p t 2 1 0 冻融法将载体p h q i p t 转化根癌农杆菌e h a1 0 1 ( 1 ) 取农杆菌感受态一管( 2 0 噼1 ) 在冰中融化。 ( 2 ) 取1 m 质粒d n a 加入到感受态农杆菌中混匀，在冰中放置3 0 m i n 。 ( 3 ) 将感受态农杆菌离心管放入液氮中冷冻5 m i n 。 ( 4 ) 取出在室温下放置5 - 1 0 m i n ，待融化后将离心管中的农杆菌转入l m ll b 液体培养基( a m p1 0 0m g l r i f5 0 m g l h y g2 5 r a g l ) 中，2 8 0 振荡培养2 4 小时。均匀地涂在l b 固体培养基含( a m p l 0 0 m g lr f f 5 0 m g lh y 9 2 5 m u l ) ， 晾干。 华南师范大学硕士研究生学位论文 根癌农杆菌介导的尸聃6 j r 胛基因转化蓝猪耳的研究 ( 5 ) 将农杆菌培养液离心。加入0 1 m l 的液体l b 重新悬浮