（微生物学专业论文）转甲状腺素蛋白基因在酵母中的非融合表达.pdf

复旦大学硕：匕学位论文 摘要 转甲状腺素蛋白( t r a n s t h y r e t i n ，1 r r r ) 是一种主要由肝脏和脉络丛产生，分子 量约为5 4 9 8 0 d a 的同源四聚体血浆蛋白，参与体内的甲状腺素的运输和维生素a 的代谢。早期研究表明，转甲状腺素蛋白基因与家族性淀粉样病变( f a p ) 有关， 直到1 9 9 1 年上海肿瘤所首次报道t t r 基因与肝癌有密切关系。研究发现刀喂基 因在人类正常肝脏中是高表达的，而在肝癌样品中其m r n a 表达是受抑制的。体 外实验表明人血浆中提取的1 1 r 对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用。因此， t t r 基因可能是与人肝癌相关的抑癌基因的候选者。 1 9 9 9 年，复旦大学和上海肿瘤所联合报道，在毕赤氏酵母中表达的转甲状腺 素融合蛋白( t t r f ) 对肝癌细胞同样具有抑制作用。因此，我们决定进一步探索 转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达。用限制酶将p s k - t t r 质粒上 t t r 基因切下，分别插入分泌型载体p p i c 9 和p p i c 9 k 。将重组的p p i c 9 k - - t t r 用职f i i 酶切后，转化p c h ap a s t o r i sg s l l 5 菌株，筛选到t t r 基因多拷贝串联 整合的转化予。转化予经摇瓶发酵后，上清液用s d s - p a g e 检测，有明显的t t r 表达。经d e a e s e p h a r o s e f f 离子交换柱和分子筛层析，得到纯化的t t r 。经 w e , s t e r nb l o t ，分子量和等电点测定等证明，毕赤氏酵母表达的t t r 与人血浆分 离得到的们限十分相似。 我们成功地用基因工程手段制各t t r ，可以克服从血浆中提取r r r 产量低、 步骤繁、安全性差的缺点，为进一步研究1 f r r 的生物学功能和临床应用奠定了基 础。 关键词：转甲状腺素蛋白分泌型载体毕赤氏酵母多拷贝串联蛋白质印记 复咀大学顾士学位论文 a b s t r a c t t r a n s t h y r e t i n f i r r r ) i sas e r u mp r o t e i ne x p r e s s e da b u n d a n t l ya n ds p e c i f i c a l l y i n o n l y t w o o r g a n s 一- t h e l i v e ra n dt h ec h o r o i d p l e x u s i t o c c u r sa sa5 4 9 8 0 d a h o m o t e t r a m e r i cc o m p l e xa n di sp o s s i b l yi n v o l v e di nt h et r a n s p o r t a t i o no ft h y r o x i n e a n dv i t a m i na t r a n s t h y r e t i ng e n eh a sb e e nd e s c r i b e da sag e n el i n k e dt of a m i l i a l a m y l o i d o t i cp o l y n e u r o p a t h yf l a p ) i np r e v i o u sr e p o r t s u n t i l1 9 9 1 ，i tw a s f i r s tr e p o r t e d b ys h a n g h a ic a n c e r i n s t i t u t et h a tt t r g e n ew a s a l s ol i n k e dt oh u m a nl i v e rc a n c e r m g e n e i s h i g h l ye x p r e s s e d i nn o r m a ll i v e rt i s s u ew h i l ei t sm r n at r a n s l a t i o ni s s u p p r e s s e d i nm o s t h e p t o m as a m p l e s nv i t r oe x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tt h eg r o w t hr a t e o f h e p a t o m ac e l l st r e a t e d w i t ht t ri s o l a t e df r o mh u m a ns e r u mw a si n h i b i t e d i ts e e m s p o s s i b l et h a t t t rg e n em i g h tb eac a n d i d a t eo fc a n c e rs u p p r e s s o rg e n ef o rh u m a n h a p a t i c c a n c e r i tw a sr e p o s e db yf u d a nu n i v e r s i t ya n ds h a h g h a ic a n c e ri n s t i t u t et h a tt h ef u s e d t r r p r o t e i ne x p r e s s e di na n ds e c r e t e db yp i c h i ap a s t o r i sa l s os h o w e dt h eh e p a t o m a c e l l i n h i b i t i v ea c t i v i t y t h e r e f o r ew ed e c i d e dt of u r t h e ro u rr e s e a r c ho nt h eu n f u s e d e x p r e s s i o n o ft t ri np i c h i a p a s t o r i s t t rg e n ew a s o b t a i n e db y d i g e s t i n g t h ep l a s m i d p s k t t r w i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e s a n dt h e ni n s e r t e di n t os e c r e t i o nv e c t o r sp p i c 9a n d p p i c 9 k t h er e c o m b i n e dp p i c 9 k - t r rw a sd i g e s t e db yb g l i ia n dt r a n s f o r m e di n t o p i c h i a p a s t o r i ss t r a i ng s l l 5 a n dt r a n s f o r m a n t sc o n t a i n i n gt t rg e n ei nam u l t i c o p y t a n d e mf o r mw e r e p i c k e d o u t a f t e rt h et r a n s f o r m a n t sw e r eg r o w ni nt h es h a k i n gf l a s k , t h es d s p a g ea n a l y s i so fs u p e m a t a n ts h o w e dt h a tt h e yc o u l de x p r e s sa n ds e c r e t e t r r t t rw a si s o l a t e da n dp u r i f i e db yd e a e s e p h a r o s ef f a n dg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h ya n dt h e r e s u l t sw eo b t a i n e dt h r o u 【g h e x p e r i m e n t ss u c h a sw e s t e r n b l o ta n dm wa n dp id e t e r m i n a t i o ns h o w e dt h a to u rp u r i f i e d1 t r p r o t e i nh a dv e r y s i m i l a rc h a r a c t e r i s t i c sc o m p a r e dw i t ht h o s eo fn a t u r a lt r rp r o t e i n p u r i f i e d f r o m h u m a ns e r u m mi ss u c c e s s f u l l yp r o d u c e d b ym e a n s o fg e n e t i ce n g i n e e r i n ga n dt h ed i f f i c u l t i e s o fl o w p r o d u c t i o n ，c o m p l i c a t e dp r o c e d u r ea n dp o o rs e c u r i t ye n c o u n t e r e di nt r a d i t i o n a l m e t h o d so ft t r p r o d u c t i o n f r o ms e r u mw e r eo v e r c o m e t h ew o r kw ec a r r i e do u tw i l l 复旦人学顾i ? 学位论文 p r o m o t e t h es t u d yo nt h eb i o l o g i c a le f f e c ta n dc l i n i c a la p p l i c a t i o n so ft t r k e yw o r d s ：t r a n s t h y r e t i n s e c r e t i o nv e c t o rp i c h i ap a s t o r i s m u l t i c o p yt a n d e m w e s t e r nb l o t - 3 - 复日_ 人学硕【：学位论文 ：l 口 转甲状腺素蛋白( t r a n s t h y r e t i n ，t t r ) ，又称前白蛋白( p r e a l b u m i n ，p a ) 分子量约为5 5 k d ，是一种由四个相同弧基组成的富含b 折叠的血浆四聚体蛋白” 每个亚基包含1 2 7 个氨基酸汹4 ”。其在体内主要由肝脏和脉络丛产生，耐热耐酸。 在正常人体内，转甲状腺素蛋白( t t r ) 是甲状腺素的转运蛋白，并且能与 r e t i n o l r b p ( r e t i n o lb i n d i n gp r o t e i n ) 形成复合物，参与视黄醛的运输“。 一7 t r 基因 目前已知刀狞基因为单拷贝基因，位于1 8 号染色体的q “1 ，含有四个外 显子，如图i 。丌宵的信号肽为2 0 个氨基酸，成熟蛋白包括1 2 7 个氨基酸，分子 量约为1 4 k d ，如图2 。在该基因的一2 4 一一3 0 之间为类似t a t ab o x 的序列，一9 0 一 一1 2 0 之间为类似c a a tb o x 序列。一5 0 一一1 9 0 之间的序列在人和啮齿类动物之间是 相当保守的，而且包含了肝细胞中特异表达的关键性元件，如h n f 一1 ，c e b p ，h n f 一3 和h n f - 4 的结合位点。人类刀耳基因的转录起始点上游约一3 4 一一3 6 k b 处区域与 鼠t t r 组织特异性增强子( 一l _ 9 6 一一1 8 5 k b ) 即h n f 一4 结合位点以及两侧序列显 示出极高的同源性，人类的t r 基因的一3 4 一一3 6 k b 区域在肝脏中也起着增强子 的作用“”1 。 图1 ：人类，研基因结构示意图 a l u ：a l ur e p e t i t i r ef a m i l ys e q u e n c e ：l 1 ：l 1r e p e t i t i v ef a m i l ys e q u e n c e ：t a t a ：t a t a b o x ：c a a t ：c a a tb o x ：( c a ) n ：p u r i n e p y r i m i d i n es t r e t c h e s ：h - 1 ，c e 。h - 3 ，h - 4 ：b i n d i n g s i t e so fh e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o rl 狮一1 ，c eb p ，麟f 一3a n dh n f 一4 ，r e s p e c t i v e l y ：t f ： am o t i fc o m m o nt ot f _ l f _ 1 ，t f l f _ 2 ，l f _ a l ：e n h a n c e r ：ar e g i o ns h o w i n gh i g hh o m o l o g y t oat i s s u e s p e c i f i ce n h a n c e ro ft h em o u s et t rg e n e ：a f p ：ah e p a t o m an u c l e a rf a c t o r a f p - ls i t e 】“u，l h h h h 复旦大学硕士学位论文 二t t r 的性质 转甲状腺素蛋白( t t r ) 是大型哺乳动物血液中三种甲状腺素结合蛋白之一。其 与其它两种血浆甲状腺素结合蛋白甲状腺素结合球蛋白和白蛋白相比，有三 个不同的地方：首先，编码t t r 的基因在大脑的脉络丛中高度表达；其次，t t r 在脑脊液中非常丰富：再者，与白蛋白和甲状腺素结合球蛋白相比，t t r 从来没 有过关于由基因引起的缺失的报道。“。 t t r 为耐热耐酸的四聚体形式，经s d s 变性后仍能部分保持双体或四体结构。 h i r o k a z u 等人曾在大肠杆菌中表达发生个氨基酸替代的突变体t t r ，分离到带 有来自o m p a 信号肽的七个额外氨基酸的融合蛋白。通过凝胶过滤分析表明重组的 突变体t t r 能有效地折叠形成与天然t t r 相似的四聚体”1 。 图2 ：f re d n a 的核苷酸序列及其对应的氨基酸顺序 三t t r 与s s a 和f a p 的研究 t t r 与两个 临床形式的淀粉样病变有联系：s s a ( 老年痴呆症) 和f a p ( 家族 性淀粉样病变) 。s s a 通常是比较轻微的功能紊乱且主要发病于超过8 0 岁的老年 复a 大学硕士学位论文 人，在此类病中，由完整的正常t t r 及其片段组成了淀粉样纤维o “】。而f a p 是一 种常染色体显性遗传的致命性疾病，该病在成人期发作。1 9 8 4 年首次发现，册基 因与家族性淀粉样病变( f a p ) 有关”。最早对f a p 进行分子遗传学研究的是c o s t a 及其同事，发现当仃冲基因发生突变时，机体可发生心肌及神经系统广泛的淀粉 样病变。有报道表明可导致淀粉样病变的淀粉样b 蛋白( ab ) 可与胞外蛋白如存在 于脑脊液和血浆中t t r 结合，以阻止淀粉样纤维的形成和沉积“”。以后的研究 揭示f f r 的点突变增加了淀粉样病变纤维蛋白的沉积，导致f a p ，其特征是外周 神经系统的淀粉样沉积，但是也发生在肾、脾、心和眼等器官。近2 0 年来类淀粉 纤维的特征已被阐明，为一组具有扭型b 折叠的纤维蛋白( t w i s t e db - p l e a t e d s h e e tf i b r i l ) ，来源于血浆蛋白中的t t r o 。己发现患者因t t r 单体上有单一 的氨基酸被取代，而表现为不同的临床类型，患者为杂合子，有1 个f 常的及1 个突变的t t r 等位基因。f h pi 型为t t r 单体上第3 0 位m e t 取代了v a l o 。f a p i i 型t t r 单体上第8 4 位s e r 取代了l l e 。”。到目前为止，至少已发现7 4 种不同 点突变能引起f a p ，其中最经常发生的突变是位点3 0 位上的v a l 被m e t 所代替的 突变。“”。人们对f a p 形成的初始原因已明了，但突变体t t r 形成淀粉样的过程 仍在不断研究之中。 四t t r 与肝癌的研究 最近的研究过程中发现7 砑基因的突变除了与f a p 相关外，还与肝癌有关。 1 9 9 1 年由上海市肿瘤研究所首次报道7 7 r 基因与肝癌发生的关系“”。其实在 此之前的临床研究中发现，血清中前白蛋白的浓度变化与肝细胞的损害程度平行， 损害越严重降低越明显。前白蛋白( p a ) 是反映肝实质急、慢性损害的一项较敏 感的指标，而前自蛋白在肝脓肿、原发性肝癌和胆道梗阻时下降也明显。由于这 些疾病的肝实质损伤往往并不十分显著，推测其血清前白蛋白的降低主要非由于 肝合成减少，而可能与体内应激状态有关。机体遭到各级刺激如：炎症、创伤、 坏死、感染和肿瘤时，血浆蛋白即发生改变。一般机体遭到应激刺激后i - 2 天内 前白蛋白的浓度下降，如无炎症和组织损伤的证据，则考虑到体内有感染或肿瘤 存在的可能性“”。”1 。由上海市肿瘤研究所从正常的肝对原发性肝癌的递减式 c d n a 文库中筛选出d g s c d n a 克隆，n o r t h e r n 杂交证明它在正常肝中高度转录，而 在9 例肝癌中转录严重受阻。9 例d n am s p l 酶杂交信号提示，4 例肝癌中该基因 同样存在部分的片段丢失。c d n a 序列分析证明它与转甲状腺素蛋白基因的编码区 全部同源。该文首次报道了在人肝癌中刀耳基因转录严重受阻遏及在基因结构上 可能存在丢失或缺陷，提示7 7 开基因可能是人肝癌中基因缺陷的一个标记或抗癌 基因之一，对 狞基因在癌细胞中的生物学功能的研究j 下在进行“。 复口人学顾l 。学位论文 1 9 9 9 年，上海肿瘤所从人的血浆中提取t t r ，并研究其对人肝癌细胞生长的 抑制作用。”。 从血浆中提取的t t r 纯度为8 5 ，经蛋白质印迹鉴定正确。体外 实验初步证实，t t r 对肝癌细胞的生长有明显抑制作用。本次实验从蛋白质水平 证实了t t r 可以抑制人肝癌细胞的生长，第3 天抑制率可达6 3 。t t r 对肝癌细 胞抑制作用的机理仍未知，但是从实验结果( 第4 天，抑制作用反而有些下降) 推测t t r 可能参与细胞的生长代谢过程，并且随着代谢过程的进行要被消耗。该 实验进一步证实t t r 基因可能是与人肝癌相关的肿瘤抑制基因的候选者。人血浆 中提纯的t t r 对肝癌细胞的抑制实验也为基因工程生产t t r ，用于临床治疗肝癌 提供了可行性依据。t t r 对肝癌细胞的明显抑制作用为肝癌的临床治疗提供了一 种新的候选治疗药物。 五本实验室的工作 从人血浆中提取t t r ，产量低，步骤繁，成本高，安全性差，很难在临床上 广泛应用。所以本实验室开始探索用基因工程生产t t r 。 我们成功地用毕赤氏酵母系统表达t t r 融合蛋白t t r f ) ，该蛋白比天然t t r 多3 5 个氨基酸。体外实验证明t t r f 对肝癌细胞有抑制作用。 在t t r f 表达成功的基础上，我们又进行了脚基因在毕赤氏酵母中非融合表 达的研究。 本研究工作分为三大部分： ( 一) 表达载体的构建及酵母转化子的筛选。 从p s k - t t r 质粒上切下脚基因的c d n a 片段并插到载体p p i c 9 上，再转克隆 到载体d p i c g k 上。重组的p p i c 9 k t t r 经b g l i i 酶切后，转化到毕赤氏酵母g s i1 5 菌株中，筛选 汗基因多拷贝串联整合的转化子。 ( 二) t t r 的发酵表达及纯化 t t r 表达菌株经摇瓶发酵和甲醇诱导，高水平表达t t r 。发酵上清液经d e a e - - s e p h a r o s e f f 离子交换柱和分子筛层析，得到纯化的t t r 。 ( 三) t t r 的鉴定 测定纯化t t r 的分子量和等电点，并用w e s t r e nb l o t 对其鉴定。 复丑人学硕上学位论文 材料 1 质粒与菌种 1 ) 质粒：p b l u e s c r i p t s k ( 一)( 携带人t t r 基因) p p i c 9 p p i c 9 k ( 携带g 4 1 8 抗性基因) 2 ) 菌种 扩增菌种e c o l ij m l 0 9 ，e c o i n v of ， 表达菌种所曲i ap a s t o r l sg s i1 5 2 分子克隆与发酵主要试剂与培养基 1 ) 试剂：多种限制性内切酶，连接酶均购自b o e r i n g e r 公司：所有氨基酸生物 素甘油甲醇山梨醇购自华美生物公司；标准分子量蛋白购自东风丽珠 公司异丙醇，重蒸酚，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，7 0 乙醇，无水乙醇，碘 化钠，溴酚蓝，琼脂，0 1 m 氯化钙溶液，1 ms o b i t e l ，生理盐水，甲醇， 6 蛋白处理液 限制性内切酶：x h o i ，b a m h i ，n o t i ，e o o r i ，船- i i 缓冲体系：i o x n eb u f f e r ，1 0 hb u f f e r ，t 0 x jb u f f e r ，l o db u f f e r ， t eb u f f e r ，w a s h i n gb u f f e r ，t a eb u f f e r ，t r i s g i yb u f f e r 其它：玻璃粉，t 4d n al i g a s e ，r n a s e a 2 ) 培养基 l b 培养基：1 0 0 0 m l 蒸馏水中含p o l y p e p t o ni 0 克，y e a s te x t r a c t5 克， n a c l1 5 克，g 1 u c o s e2 克( 再加1 5 克琼脂即为l b 固体培 养基) ，调p h 7 2 - 7 4 ，蒸汽灭菌1 5 磅2 0 分钟。 l b a 培养基：l b 培养基中加氨苄青霉素至终浓度为1 0 0ug m l ，即为l b a 培养基。 y p d 培养基：在9 0 0 m l 蒸馏水中溶解1 0 克酵母粉和2 0 克蛋白胨( 如需固 体培养基，加2 0 克琼脂) 蒸汽灭菌1 5 磅2 0 分钟，加l o o m l i 0 x d ( 见储备液) ，液体培养基室温保存。y p d 固体培养基 4 保存。 r d b 培养基：7 0 0 m l 蒸馏水中溶解1 8 6 克山梨醇和2 0 克琼脂，灭菌后冷却 至6 0 。c ，加入下列储存液：l o o m l1 0 d ，1 0 0 m l1 0 y n b ， 复q 人学顾士学位论义 m d 培养基 m m 培养基 l o m l1 0 b ，2 m l5 0 0 x a a 和8 8 m i 蒸馏水，混匀后立即例 平板4 保存。 8 0 0 m l 蒸馏水中加2 0 克琼脂，灭菌后冷却至6 0 c ，加入下列 储存液：l o o m l1 0 x y n b ，2 m l5 0 0 x b ，t o o m l1 0 d ，混匀 后立即倒平板4 c 保存。 8 0 0 m l 蒸馏水中加2 0 克琼脂，灭菌后冷却至6 0 ，加入下列 储存液：l o o m li 0 x y n b ，2 m 1 5 0 0 x b ，l o o m l1 0 x m ，混匀 后立即倒平板4 c 保存。 b m g y 培养基：7 0 0 m l 蒸馏水中加1 0 克酵母粉和2 0 克蛋白胨灭菌冷却 至室温后加入：i o o mi m 磷酸缓冲液，i o o m1 0 x y n b ，2 m 1 5 0 0 x b ，l o o m l1 0 x g y ，4 保存。 b 眦y 培养基：7 0 0 m l 蒸馏水中加1 0 克酵母粉和2 0 克蛋白胨，灭菌冷却至 室温后加入：1 0 0 m 1 1 m 磷酸缓冲液，l o o m l l o x y n b ，2 m 1 5 0 0 b ，l o o m l l 0 x m ，4 c 保存。 储备液： l o x y n b ：l o o m l 蒸馏水中含1 3 4 克y n b ( w i t h o u ta m i n oa c i d ) 5 0 0 x b ：i 0 0m l 蒸馏水中含2 0 毫克b l o t i n i 0 x d ：1 0 0 0 m l 蒸馏水中含2 0 0 克d - g l u c o s e 1 0 m ：9 5 m i 蒸馏水中加5 m l 甲醇 l o x g y ：9 0 0 m l 蒸馏水中加l o o m lg l y c e r o l i 0 0 a a ：l o o m l 蒸馏水中含l - g l u t a m i ca c i d ，l - m e t h i o m n e ， l - l y s i n e ，l l e u c i n e ，l - i s o l e u c i n e 各5 0 0 毫克 l m 磷酸缓冲液，p h 6 0 ：1 3 2 m ii m 磷酸氢二钾和8 6 8 m il m 磷酸二氢钾 调至p h 6 0 3 分离纯化的主要试剂 磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠，柠檬酸钠，酚试剂，碳酸钠，酒石酸钾 钠，e d t a ，咪唑，柠檬酸，氯化锌，p v d f 膜，脱脂奶粉，小牛血清，吐温一2 0 ， 双氧水等。 复旦_ 大学硕士学位论文 方法 1 - p s k t t r 质粒的构建 携带人，册基因的质粒p s k 由上海肿瘤所提供。采用p c r 法对冲基因的5 端序列进行改造，使5 端加上x h o i 酶切位点和a 从a g a 核苷酸序列。用x h o i 和 n o t i 双酶切后获得7 7 r 基因片段，其长度为4 2 7 b p 。 2 质粒p s k t t r 的转化 2 1 制各感受态细胞 挑取ec o l i 单菌落接于含3 m ll b 的试管中，3 7 c2 2 0 r p m 振荡培养过夜。 将种子液接2 m l 于含3 0 m ll b 的2 5 0 m l 三角瓶中，3 7 c2 2 0 r p m 振荡培养1 小时 4 0 分。收集菌液于4 0 m l 离心管中，4 5 k r p m 离心5 m i n ，弃上清，用2 0 m l 预冷 的0 1 mc a c l 。温柔悬浮。冰浴2 0 m i n 后，4 ( 2 5 k r p m 离心5 m i n ，弃上清，悬浮菌 体于l m l 预冷的0 1 mc a c l ：中，置于冰浴中，此时菌体已处于感受态。 2 2 c a c l 。法转化p s k t t r 质粒 于2 0 0 l a1 感受态宿主菌中加入1 | llp s k - t t r 质粒d n a ，冰浴l h ( 间歇轻摇) 后，置于4 2 y 2 热诱导2 m i n ，再冰浴2 m i n 后加入预热的6 0 0pll b 混匀，3 7 c 水 浴l h ，各取1 0 0 pl 涂布于3 块l b a 平板，另取2 0 0 l al 感受态菌液涂布对照平板， 3 7 c 培养过夜。相对空白对照平板，实验平板上长出的菌落为转化子。 3 碱法大量抽提质粒p s k - t t rd n a 3 1 试剂 擅i 龃( 5 0 m mg l u c o s e ，l o m me d t a ( p h8 0 ) ，2 5 m mt r i s h c l ( p h8 0 ) ) ：吸 取母液2 5 0 n 堋e d t a4 m l ，1 mt r i s h c l2 5 m l ，加入0 9 9 9g l u c o s e 溶解，用d d h 2 0 定容至l o o m l ，高压蒸汽灭菌，4 c 保存。 渣邃! ! ( o 2 mn a o h ，1 s d s ) ：吸取母液i o mn a o h4 m l ，2 0 s d s1 0 m l ，用 d d h ：0 定容至2 0 m l 。 渣遗i i ! ( 3 mn a a c ( p h4 8 ) ) ：称取无水乙酸钠4 9 2 9 ，用1 4 0 m ld d h ：0 加热 溶解，再加冰乙酸约4 0 m l 调p h 至4 8 ，用d d h ：0 定容至2 0 0 m l 。 3 2 方法 复旦人学顶， ：学位论文 将携带p s k t t r 质粒的大肠杆菌单菌落接于l b 培养基斜面，再由斜面接至 含4 m ll b a 培养基的试管，3 0 c 培养过夜。种子液以l 的接种量接种于含2 0 0 m l l b a 培养基的三角瓶3 0 摇瓶培养过夜。菌液于4 c6 k r p m 离心l o m i n ，去尽上 清。加入6 m l 溶液i ，充分混匀，冰浴1 0 m i n 。加入1 2 m l 溶液i i ，用无菌玻棒轻 搅，准确冰浴5 m i n 。再加入9 m l 预冷的溶液i i i ，上下颠倒数次温和混匀，冰浴 3 0 m i n 。4 。c1 3 k r p m 离心2 0 m i n ，严格取上清，加入等体积异丙醇混匀，置于一2 0 1 5 h 。4 1 3 k r p m 离心2 0 m i n ，去尽上清，烘去有机溶剂后用2 m lt e 溶解， 并转移至e p p e n d o r f 管( 1 m l 管) 。各加入1 5 0 pgr n a s e ，5 5 处理3 0 m i n 后加 入等体积的重蒸酚，充分振荡。5 k r p m 离心5 m i n 后取上清，加等体积氯仿：异戊 醇( 2 4 ：1 ) 剧烈振荡并重复一次。5 k r p m 离心5 m i n ，取上清，加1 1 0 体积的溶液 i i i 和等体积的异丙醇，混匀后置于- 2 0 l h 。4 。c1 3 k r p m 离心2 0 m i n ，去上清， 用7 0 乙醇洗涤一次，4 1 3 k r p m 离心2 0 m i n ，去尽上清并烘去有机溶剂，各加 入l o o ult e 溶解备用。 4 t t r 基因片段的获得 4 1 碱法大量抽提质粒p s k t t r ( 方法同前) 4 2 玻璃粉法回收力田基因片段 用限制性内切酶肋d i 和n o t i 双酶切切得t t r 基因d n a ，经1 5 的琼脂糖凝 胶电泳，在紫外监视灯下用干净刀片切下含目的片段d n a 的凝胶( 尽量除去多余 的胶) 置于g p p e n d o r f 管中。估计凝胶的体积，加3 倍体积的6 mn a i ，5 5 。c 水浴 溶解5 - 1 0 m i n ，加3 - 5 u1 玻璃粉，冰浴1 0 m i n ( 间歇轻摇) 。1 2 k r p m 离心l m i a ， 去上清，用2 0 0ulw a s h i n gb u f f e r 悬浮洗涤3 次。1 2 k r p m 离心i m i n ，去尽上清 并烘去有机溶剂，加入1 0ult e ，5 5 水浴5 m i n ，1 2 k r p m 离心l m i n ，吸取上清。 5 载体质粒片段的获得 5 1 碱法大量抽提质粒p p i c 9 ( 方法同前) 5 2 玻璃粉法回收载体质粒用劢d i ，n o t i 双酶切的大片段( 方法同前) 6 连接与转化 6 1 连接 1 0 ul 反应体系中加： 6 uld d h 2 0 ；1ul1 0 xb u f f e r ；1 lp p i c 9 x h o i ，n o t i 1u17 1 册基因片段肋d i ，n o t i ；1 t ilt 4 d n al i g a s e 1 4 反应2 h 后l o 反应过夜。 复咀大学顶i ：学位论文 6 2 转化 先制备感受态的c o l i n v af ( 方法同前) ，于2 0 0ul 感受态宿主菌中加 入1 0 ul 连接液，冰浴l h ( 间歇轻摇) 后，置于4 2 。c 热诱导2 m i n ，再冰浴2 m i n 后加入4 0 0 1 11l b 混匀，3 7 。c 水浴1 h ，各取2 0 0 ul 涂布于3 块l b a 平板，另取 2 0 0ul 感受态菌液涂布对照平板，3 7 培养过夜。对照平板应为空白，转化平板 上长出的菌落则可能为转化子。重组质粒p p t c 9 一t t r 示意图参见图3 。 幅tt t r ( 4 0 9 b )。 脚i 图3 ：重组质粒p p i c 9 - - t r r 酶切位点示意图 7 重组质粒的鉴定 7 1 碱法快速少量抽提质粒d n a 从转化平板上挑取若干菌落，分别接种于含4 m ll b a 培养基的试管，3 7 c 振 荡培养过夜。取3 m l 菌液4 1 4 k r p m 离心3 0 s ，去尽上清。加入1 0 0 ul 溶液i ， 振荡均匀，室温放置5 m i n ，再加入2 0 0ul 溶液i i ，盖紧管盖颠倒数次，冰浴5 m i n ， 再加入1 5 0u1 溶液i i i ，摇匀后冰浴5 m i n 。4 。c1 4 k r p m 离心5 m i n ，取上清液加 入等体积重蒸酚剧烈振荡。4 c1 4 k r p m 离心2 m i n ，取上清液加入等体积氯仿：异 戊醇剧烈振荡。4 c1 4 k r p m 离心2 m i n ，上清液转入新e p p e n d o r f 管，加等体积异 丙醇，混匀后于- 2 0 放置3 0 r a i n 。4 c1 4 k r p m 离心5 m i n ，去尽上清，用7 0 乙 醇洗涤一次。4 1 4 k r p m 离心5 m i n ，去尽上清并烘去有机溶剂，用1 0ul 无菌水 溶解，4 暂存备用。 复q 大学顶 ：学位论文 7 2 转化子质粒d n a 的酶切电泳检验 转化子d n a2 0 ul 反应体系中包含： 5 ul 转化子d n a ；9 i tld d h ：o ；2 ull o n eb u f f e r ； 0 2 ul1 0 0 x b s a ；lulr n a s e ；1 5 ul 肋o i ：1 5 pln o t i 3 7 水浴酶切l 小时。 对照p p i c 9d n a 和对照p s k t t ri ) n a 同样用x h o l 和, b t l 双酶切，其反应体 系同上。 。 样品与占总体积1 5 的溴酚蓝混匀，1 5 琼脂糖凝胶电泳( t a eb u f f e r ) 检 测，恒压l o o y3 0 m i n 。 7 3 重组质粒的d n a 序列测定 挑取含重组质粒的单菌落进行b n a 序列测定，证明该菌落中克隆的，掰基因 的d n a 序列完全正确。 8 i r l r r 克隆到p p i c9 k 上 9 电转化法转化毕赤氏酵母 9 1 毕赤氏酵母g s1 1 5 菌株的鉴定 9 2 重组质粒d n a 的抽提、酶切、纯化 碱法大量抽提重组质粒p p i c 9 kd n a ( 方法同上) ，用b g t i i 完全酶切，以1 5 琼脂糖凝胶电泳检测。在酶切反应液中加入2 5 倍体积的无水乙醇和0 1 倍体积 的3 mn a a c ，摇匀，于一2 0 沉淀过夜。摇匀后4 01 4 k r p m 离心5 m i n ，去上清， d n a 沉淀用7 0 乙醇洗涤一次。再于4 1 4 k r p m 离心5 m i n ，去上清并烘去有机 溶剂，用l o u1 无菌水溶解d n a 备用。 9 3 电击转化毕赤氏酵母细胞 接p i c m ap a s t o r i sg s i1 5 单菌落于含2 m ly p d 培养基的试管，3 0 。c 振荡培 养过夜。种子液重新接于含4 0 m ly p d 培养基的2 5 0 m i 三角瓶，接种量分别为1 0 ul ，2 0 ul ，3 0 p1 ，3 0 2 2 0 r p m 摇瓶培养。取o d 。值于1 3 - i 5 间的菌液，4 5 k r p m 离心5 m i n ，去上清。分别用5 0 m l 冰浴的无菌水悬浮，4 c5 k r p m 离心 5 m i n ，去上清，2 5 m i 冰浴的无菌水悬浮，4 。c5 k r p m 离心5 m i n ，去上清，2 m l 冰 浴的i ms o b i t o l 悬浮，4 5 k r p m 离心5 m i n ，去上清，最后用1 5 0 1 8 0 “l 冰浴 的i ms o b i t o l 悬浮。将8 0 ul 悬浮液与5 ul 备用的d n a 液于e p p e n d o r f 管中混 匀，冰浴5 m i n ，转移至转化槽中，以1 3 0 0 v 电压，2 0 0 q 电阻，2 5 uf 电容的条件 复旦大学硕上学位论史 下电击转化。另取仅有酵母细胞悬浮液的电极杯电击对照。电击后立即加入l m l 冰浴的l ms o b t t o l 混匀，并转移至无菌e p p e n d o r f 管中，3 0 。c 水浴2 3 h 。耿出 2 0 0u1 涂布r d b 平板( 总共涂5 皿) 。另外未电击的细胞取4 0 ul 涂布r d b 平板， 作为对照。3 0 培养2 3 天。 1 0 g 4 1 8 抗性转化子的筛选 将r d b 平板上的原始菌落点种到含g 4 1 8 的y p d 平板上进行g 4 1 8 抗性筛选。 若在低浓度g 4 1 8 平板上，菌落能够正常生长，则进一步用较高浓度的g 4 1 8 平板 进行筛选。分别选用的g 4 1 8 浓度为1m g m l ，2m g m l ，3 m g m l ，4m g m l ，5m g m l 和6m g m l 。 1 1 摇瓶发酵及诱导表达鉴定 1 1 1 摇瓶发酵及诱导表达 从含g 4 1 8 的y p d 平板上挑取抗性菌落2 7 个接种于含2 m lb m g y 培养基的试管 中，3 0 2 8 0 r p m 振荡培养1 6 h ，将种子液接于含5 0 m lb m g y 培养基的2 5 0 m l 三角 瓶中，3 0 c2 8 0 r p m 摇瓶培养，至o n 。值为3 6 左右。菌液于室温5 k r p m 离心5 m i n ， 去尽b m g y 上清培养液，用1 5 m lb ) 田v l y 培养基悬浮转移菌体，3 0 c2 8 0 r p m 摇瓶培 养五天，每天补加甲醇至终浓度为0 5 。从培养的第二天起每天取样l m l ，室温 l o k r p m 离心l o m i n ，上清液于一2 0 保存，以备s d s p a g e 蛋白分析。 l l t2s d s - p a g e 1 1 z 1 配制试剂： 1 5 分离胶浓缩胶( s m l ) ( 1 0 m 1 ) d d f l 2 0 2 4 m l3 4 m l 3 0 a r c - b is5 o m l8 3 0 u l 3 0 m2 ，5 m l t r i s ( p h 8 9 ) o 。5 m6 3 0 ul t r i s ( p h 6 8 ) 2 0 s o s5 0 ul2 5 斗l t e m e dl o “l5ul 1 0 a p s 5 0 ul2 5 “l 复q 人学顾 ：学位论文 此外还有6 s d s p a g e 凝胶上样缓冲液，t r i s g y c i n e 电泳缓冲液，考马 斯亮蓝染色液，脱色液。 1 1 2 2 电泳： 所甩电泳设备为b i o - r a d 公司m i n i p r o t e a n 回i ic e l la s s e m b l y ，步骤详见 m i n i p r o t e a n i ic e l la s s e m b l yg u i d e 。 1 2 , t t r 蛋白的分离纯化 1 2 1 试剂 ( 1 ) s t o c k a ：0 2 mn 钆h p o 。 ( 2 ) s t o c k b ：0 2 mn 巩p 0 。 ( 3 ) 超滤液( 2 0 m mp b sp h 5 8 ) ：8 m ls t o c k a + 9 2 m ls t o c k b ，用蒸馏水稀释至 1 0 0 0 m 1 ( 4 ) d e a e 柱上样和洗脱缓冲液：同( 3 ) ( 5 ) d e a e 柱洗涤液1 为含0 1 mn a c i 的p b s ( p h 5 8 ) ：用上述p b s 缓冲液配制 0 1 mn a c i 。 ( 6 ) d e a e 柱洗涤液2 为含o 4 mn a c l 的p b s ( p h 5 8 ) ：用上述p b s 缓冲液配制 0 4 mn a c l 。 ( 7 ) 分子