（微生物学专业论文）发根农杆菌转化怀地黄突变体鉴定与基因克隆.pdf

摘要| | l lr l 1ir i l ll l ri 1 l rfllfy 17 3 4 8 4 3本研究旨在对怀地黄转基因和组织培养突变品系( 简称突变品系) h 1 | i 进行扩繁、移栽、田间种植和鉴定，对怀地黄基因克隆进行探索，为怀地黄新品种培育和基因研究提供依据。l 、建立了怀地黄转基因和组织培养突变品系扩繁和移栽技术体系，实现了其田间的成功种植，从形态、叶绿素含量、还原糖和总糖含量、单株块根鲜重和数目、叶脱分化和再分化能力和d n a 分子水平对其进行了鉴定。突变品系叶多上翘，对照8 5 - 5 叶外翻，叶片长于对照，多宽于对照；植株等于或高于对照，其中，h 1 j 一7 和h 1 ：| 一8 两个品系最高，达3 5 c m ；7 个突变品系的叶绿素含量高于对照，5 个突变品系的叶绿素含量低于对照；4 个突变品系的还原糖含量高于或等于对照，1 个突变品系的还原糖含量低于对照，而5 个突变品系的总糖含量都高于对照；5 个突变品系的单株块根鲜重在0 4 6 5 - 0 7 4 2 9 之间，其中3 个突变品系的单株块根鲜重高于对照，h w 一1 2 比对照增加1 5 ；5 个突变品系的单株块根数目均多于对照；在一定培养基上，突变品系h w 一1 2 的愈伤组织诱导率达1 0 0 ，高于或等于对照的。其愈伤组织分化芽的能力也居第二位；一个s r a p引物组合( 鲫2 e m l 7 e m l 8 ) 从突变品系基因组d n a 中扩增出一个对照没有的约4 0 0 b p的d n a 片段。2 、克隆了一个新的怀地黄基因片段及其中的一个开放阅读框。根据已知裂叶牵牛的p n z i p 启动子碱基序列设计一对引物，用p c r 方法从怀地黄基因组中扩增出5 个d n a片段，克隆了其中一个大小近似于裂叶牵牛的p n z i p 启动子的1 0 9 6 b p 的d n a 片段。经在n c b i 中b l a s t 一些基因序列比对分析，发现其是一个类似于转座子的基因序列，而且其中含有一个可以编码1 5 0 个氨基酸的4 5 0 b p 完整的开放阅读框，克隆得到此开放阅读框。关键词：怀地黄，转基因，组织培养，开放阅读框，基因克隆i i，j母a b s t r a c tt h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d ya r et op r o p a g a t e ，t r a n s p l a n t ，p l a n ta n dc h a r a c t e r i z et h ev a r i a n t so fr e h m a n n i ag l u t i n o s a ，h u e n c h i n g e n s i s ( c h a r te ts e c h i h ) h s i a o ( c a l l e dv a r i a n t sf o rs h o r tb e l o w ) h wd e v e l o p e db ya g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o na n dp l a n tt i s s u ec u l t u r e ，a n dt oc l o n ei t sn e wg e n ef r a g m e n ti no r d e rt ol a yt h ef o u n d a t i o nf o ri t sb i o t e c h n o l o g i c a lb r e e d i n ga n dg e n er e s e a r c h l 、e s t a b l i s h e dt h e i rp r o p a g a t i o na n dt r a n s p l a n t a t i o ns y s t e m ，s u c c e s s f u l l ya c c o m p l i s h e dt h e i rc u l t i v a t i o na n dc h a r a c t e r i z e dt h e mb ym e a n so ft h e i rm o r p h o l o g i c a lt r a i t s ，c h l o r o p h y l lc o n t e n t ，r e d u c i n gs u g a ra n dt o t a ls u g a rc o n t e n t ，f r e s ht u b e rw e i g h ta n dt u b e rn u m b e rp e rp l a n t ，t h ea b i l i t i e st od e d i f f e r e n t i a t ea n dr e d i f f e r e n t i a t e ，a n dd n av a r i a t i o na n a l y s i s i nt e r m so fm o r p h o l o g y , t h el e a v e so ft h ev a r i a n t st u mu pw h i l et h a to f8 5 5 ( c k ) d r o o p ，a n dt h el e a v e so ft h ev a r i a n t sa r el o n g e ra n dw i d e rt h a nt h a to f8 5 - 5 ( c k ) t h ev a r i a n t sa r ea sh i g ha so rh i g h e rt h a n8 5 5 ( c k ) ，o fw h i c hv a r i a n th w - 7a n dv a r i a n th w - 8a l et h eh i g h e s t ，3 5 c r nh i g h a m o n g1 2v a r i a n t st e s t e d ，t h ec h l o r o p h y l lc o n t e n t so f7o n e sa r eh i g h e rt h a nt h a to f8 5 5( c k ) ，w h e r e a st h a to f5 0 n e sa r el o w e rt h a nt h a to f8 5 - 5 ( c k ) ，n l et o t a ls u g a rc o n t e n t so fa l lt h ef i v ev a r i a n t st e s t e da r eh i g h e rt h a nt h a to f8 5 - 5 ( c k ) ，b u tm er e d u c i n gs u g a rc o n t e n t so ff o u rv a r i a n t st e s t e da r ea sh i g ha so rh i g h e rt h a nt h a to f8 5 5 ( c k ) ，a n dt h a to fo n ei sl o w e rt h a nt h a to f8 5 5 ( c k ) t h ef r e s ht u b e rw e i g h tp e rp l a n to f5v a r i a n t st e s t e dr a n g e df r o m 0 4 6 5t o0 7 4 2g ，o fw h i c h3 0 n e s f r e s ht u b e rw e i g h tp e rp l a n ta r eh e a v i e rt h a nt h a to f8 5 5 ( c k ) a n dt h ef r e s ht u b e rw e i g h tp e rp l a n to fv a r i a n th w - 12h a sa15 i n c r e a s ec o m p a r e dt ot h a to f8 5 5 ( c k ) a tt h es a l t l et i m e ，t h et u b e rn u m b e rp e rp l a n t so ft h ef i v ev a r i a n t sa r ea l lm o r et h a nt h a to f8 5 5 ( c k ) f o ri t sa b i l i t i yt od e d i f f e r e n t i a t ea n dr e d i f f e r e n t i a t e ，t h ec a l l u si n d u c t i o np e r c e n t a g eo fv a r i a n th w - 1 2r e a c h e d1 0 0 e q u a l i n gt oo n ec ka n dm o r et h a nt w oc k s ，a n di t ss h o o td i f f e r e n t i a t i o np e r c e n t a g ef r o mi t sc a l l u s e sw a st h es e c o n dh i g h e s ta m i n gt h e4 c k st e s t e d a tt h ed n al e v e l ，o n es p e c i f i cd n af r a g m e n to fa b o u t4 0 0 b pw a sn o ta m p l i f i e df r o mt h eg e n o m i cd n ao f8 5 _ 5 ( c k ) b u tt h eg e n o m i ed n ao f v a r i a n th w - 1 2b yo n es r a pp r i m e rc o m b i n a t i o n ( e m 2 e m l 7 e m l8 ) 2 、o n en e wg e n ef r a g m e n ta n di t so w no r fw e r ec l o n e d ，s e q u e n c e da n da n a l y s i s e d b a s e do nt h ek n o w n p n z i pp r o m o t e r , ap a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e db ys o f t w a r et oa m p l i f yt h el e a f - s p e c i f i cp r o m o t e ro fr e h m a n n i ag l u t i n o s af h u e n c h i n g e n s i s ( c h a ne ts e c h i h ) h s i a o h o w e v e r , f i v ed n af r a g m e n t sw e r ei i ig e n e r a t e dw i t ht h ep a i r so fp r i m e r s ，o fw h i c ho n ed n af r a g m e n ts i m i l a rt ot h ek n o w np n z i pp r o m o t e ri ns i z ew a sc l o n e d a f t e ri t ss e q u e n c i n g ，i tw a sf o u n dt h a ti tw a sc o m p o s e do f1 0 9 6 b p t h eb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l ( b l a s t ) f o u n dt h a ti tw a so n ed n af r a g m e n ts i m i l a rt ot r a n s p o s o n - r e l a t e dp r o t e i ng e n e ，i nw h i c ht h e r ew a saw h o l eo r fc o n s i s t i n go f4 5 0 b pa n de n c o d i n gap e p t i d eo f15 0 a m i n oa c i d s t h ew h o l eo r fh a db e e nc l o n e da n ds e q u e n c e d ，w h i c hh a st h es a m eb a s ec o m p o s i t i o na st h a ti nt h ef i a g m c n to fk e yw o r d s ：r e h m a n n i ag l u a n o s a ，h u e n c h i n g e n s i s ( c h a ne ts e c h i h ) h s i a o ，t r a n s g c n e ，p l a n tt i s s u ec u l t u r e ，o r f , g e n ec l o n i n gi v缩略语表( a b b r e v i a t i o n )v3 结果与分析1 93 1 转基因和组织培养怀地黄突变品系的快繁、移栽与田间种植1 93 2 单株和小面积种植怀地黄突变体的性状鉴定2 13 3 怀地黄突变品系和对照的s r a p 分子标记分析2 43 4 怀地黄突变品系和对照的分化与再生能力分析2 44 讨论2 74 1 怀地黄转基因和组织培养突变品系的建立2 74 2 怀地黄转基因和组织培养突变品系的鉴定2 7第二章怀地黄基因片段的克隆3 ll 前言311 1 定位克隆3 l1 2 功能克隆311 3 表型克隆3 2v i i_。1。1 4 应用d n a 芯片技术筛选新基因3 21 5p c r 扩增克隆3 21 6 测序克隆3 31 7 研究的目的和意义3 32 实验材料和方法。3 52 1 实验材料3 53 2 主要药品与试剂3 52 3 实验方法3 53 结果与分析3 93 1 目的片段的克隆3 93 2 目的片段测序3 93 3 序列比对分析4 03 4 开放阅读框的扩增与检测4 03 5 开放阅读框片段的序列分析4 13 6 质粒d n a 的提取和回收4 l4 讨论4 3结论4 5参考文献4 7致谢5 3攻读学位期间发表的学术论文目录5 5独创性声明5 7关于论文使用授权的说明5 7v i i l第一章前言第一章怀地黄转基因和组织培养新品系鉴定j l j -1 日l j 吾1 1 地黄的概述地黄 r e h m a n n i ag l u t i n o s a ( g a e r t n ) l i b o s e h 另1 名怀地黄、山烟根、酒壶花，又名地髓【ij 、芑l z 】，隶属于玄参科( s c r o p h u l a r i a c e a e ) 地黄属。是多年生草本植物。全世界主要有三个地黄品种药用，分布在韩国、日本和中国【j 刮。地黄在我国有非常悠久的栽培历史pj - 大部分省都有引种栽培，广泛的分布于辽宁、内蒙古、陕西、山西、河北、河南、山东、江苏、安徽、浙江、湖南、湖北与四川等地区，其中河南、山西、山东等省分栽培的面积比较大，具有非常重要的经济价值和药用价值，地黄在中国栽培和应用比在其他国家更广泛【o 】，是我国大宗常用中药材之一。从明朝以后，其主产区集中于河南古怀庆府地区( 就是现在的修武、武陟、温县、孟县、博爱等地) 。通常将产于古代怀庆府的地黄，称为怀地黄或怀庆地黄 r e h m a n n i ag l u t i n o s a h u e i c h i n g e n s i s ( c h a ne ts e h i h ) h s i a o ，因其优良的质地而享誉海内外。自明朝起，怀地黄的道地地位就已经确立，作为地黄道地药材已经有数百年的应用历史【卜引。在明、清时代就被列为进贡皇帝的贡品，素有“怀参”之称p j 。而其他地区栽培地黄也都多引自河南怀庆( 即现在的武陟、温县、博爱等县区) 。怀地黄的主要特点是块大、油性足、有菊花心，至今已经有近三千年的栽培历史。地黄的主要药用部分是它的地下部分，以鲜地黄、生地黄和熟地黄三种形式分别入药。秋季采挖地黄，洗净鲜用的称为鲜地黄；将其在5 5 6 0 缓缓烘烤至八成干，且内部颜色变黑时，捏成团块状，称为生地黄；取生地黄蒸至全黑色，称为熟地黄。地黄的应用历史非常悠久，因此积累了大量的关于地黄的研究资料。地黄分别以鲜地黄、干地黄和熟地黄入药，均具有滋阴生津功效，但各有侧重。鲜地黄具有性寒、味甘苦，能清热生津、凉血、止血。生地黄具有性寒，味甘，能清热凉血、养阴生津。熟地黄具有性微温、味甘，能滋阴补血，益精填髓，可用于治疗阴血津液亏虚等诸证，成为中医临床上一味应用十分广泛的补益类中药l i 。地黄中含有梓醇、怀地黄转基因和组织培养品系鉴定和基因克隆糖类、生物碱、维生素a 、b 、c 和d 、多种氨基酸、强心甙及铁、磷等成份【i i 】。l i u等【12 1 ，d i r k 【13 1 ，c h u n g 等 3 1 ，研究发现地黄能够补充活力，增强肝脏、肾脏和心脏的功能，现代药理研究发现：地黄及其有效成分具有调节免疫功能，影响心血管系统、造血系统以及内分泌系统等多方面的活性，并且具有抗肿瘤、抗衰老以及降血糖等功效【1 4 - 1 8 1 。近年来地黄的药理研究引起了国内外专家非常广泛的关注，并不断深入的挖掘它的新的用途。尤其是对地黄多糖b ( i 冲s _ b ) 的研究已经有了新的发现和进展【1 9 - 2 2 1 ，并被非常广泛的应用于临床，均取得了满意的效果。1 2 地黄基因工程1 2 1 植物转基因技术的概念转基因技术也称为基因工程技术或基因( d n a ) 重组技术，是人为地对生命最基本的遗传单位基因进行直接的操作。转基因技术从狭义上来说，是利用分子生物学技术，将某些生物的一种或几种外源基因转移到其他的生物物种中去，从而改造生物的遗传物质从而使其有效地表达相应的产物，并出现原物种不具有的性状或产物。广义上的转基因技术还包括采用其他的方法对生物本身的基因进行修饰从而使生物体获得新的表型的技术【2 3 1 。1 2 2 植物转基因育种的主要手段和方法物的地将转基包括微注因转化方新的动着2第一章前言通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并得以表达，这可以引起植物肿瘤的发生。这段d n a 被称为t d n a 。t d n a 经改造后，能够将外源基因导入植物的细胞中，人们再利用植物细胞的全能性，通过组织培养的技术，由一个细胞或一块组织再生出完整的转基因植株。这就是农杆菌介导的植物转基因技术。根据统计，至今获得的转基因植株中，有8 0 以上的是通过农杆菌介导转化法获得的。1 9 7 9 年，m a r t o n 等利用烟草的原生质体与野生型的农杆菌进行了共培养，从再生植株中检测到l p d h 的活性【3 5 】。随后，z a m b r y s k i 等【3 6 】在去除了全部致瘤基因的t - d n a 上插入了外源d n a ，获得了转基因烟草植株。1 9 8 5 年，h o r s h 等人首先创立了农杆菌介导的叶盘转化法【3 7 】，从而拓宽了农杆菌感染转化外源基因的受体范围。现在可以直接利用植物的子叶、芽、茎、胚轴、未成熟胚甚至是成熟种子进行农杆菌转化。由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，因此农杆菌介导法曾经被认为仅适于双子叶植物转基因技术。从1 9 9 4 年该方法首先在水稻上获得了重要突破以来，在玉米、小麦等粮食作物中也相继的取得了成功【3 引。农杆菌介导的转基因方法与其它方法相比有以下的优点：操作简便、不需要专门的仪器；培养周期比较短，宿主范围比较广，包括大多数的双子叶植物和少数的单子叶植物；插入外源基因的片段比较大，可达5 0 k b 以上；转化率明显高于其它的直接转化方法；外源基因整合到植物基因组上的拷贝数比较少，多为单拷贝，稳定性比较好；可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官特异的表达；很少出现基因沉默现象，可以将较大片段d n a 完整地转移到植物基因组中去，整合的外源基因变异很小，后代的分离规律也遵循孟德尔遗传规律。但是，由于t - d n a 可以在植物染色体的任何区域插入，很有可能导致有益基因的插入失活，需要进行进一步的完善，另外，农杆菌介导转化还受宿主范围和菌株特异性等因素的限制。1 2 3 植物转基因在农业中的应用转基因育种是作物育种技术的延伸，为育种者提供了两种很好的机会；一是导入现在种质库中不存在的新的遗传变异，二是用已知的基因产生希望的表型。转基因对作物改良的潜力已经在近代含有转基因新性状比如病虫害抗性和农药耐性品种以及杂种商品化等方面得到充分的证实。转基因技术正成为作物育种中必不可少的部分。现在转基因研究遍布了全世界，转基因作物的种植面积正迅速的增加，其产值也在逐年的升高。植物转基因在农业上的应用主要表现在以下几个方面：( 1 ) 品质遗传改良怀地黄转基因和组织培养品系鉴定和基因克隆作物的优质一直是人们追求的目标，目前利用转基因植物可以非常有效地改良植物的品质特性。在韩国，用转基因技术育成了一种便于淀粉加工的特异性微型薯种，个体如葡萄，结果性状也似葡萄，但产量可以高达普通马铃薯产量的3 倍，淀粉含量可以达4 0 。目前用于改良作物产品质量的基因主要有：谷物种子的贮藏蛋白基因，控制果实成熟的基因，控制脂肪合成的基因等。中国农业大学成功地将高赖氨酸基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸含量比对照提高了1 0 。华中农业大学和中国科学院植物研究所分别获得了延迟成熟的转基因番茄，其储藏时间可延长1 2 个月，有的可达8 0 天以上【3 9 1 。( 2 ) 抗虫害遗传改良植物病害和虫害往往是使农业生产蒙受严重损失因素。人们通过使用农药，采用高水平的生产管理技术和培育、种植抗病虫的作物品种等手段与病虫害做斗争，虽然取得了长足进步，但远未胜利。基因工程的发展为培育抗病虫作物提供了新的手段，从而开辟了植物抗病虫育种的新时代。近年来，这方面的成就主要有：将病毒外壳蛋白基因移植到农作物中，使农作物能够抵抗病毒感染，培育出抗病毒烟草、番茄、黄瓜等作物新品种。例如从黄瓜花叶病毒( c m v ) 和烟草花叶病毒( t m v ) 中提取外壳蛋白基因，通过载体拼接到烟草的基因上，实现基因重组，培育成双价抗病转基因烟草。将外源抗真菌的基因导入小麦，可以防治小麦纹枯病、赤霉病、根腐病等真菌性病害。抗植物虫害的基因有很多种，目前经常使用的主要有3 种：第一种是从微生物苏云金杆菌分离出的苏云杆菌杀虫结晶蛋白基因，简称b t 基因；第二种是从植物中分离出的昆虫的蛋白酶抑制剂，其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因；第三种是植物凝集素基因。这些转基因作物能够减少杀虫剂和农药的用量，降低杀虫剂和农药及其残留物对食物链、水体造成的污染，非常有利于生态环境的保护。( 3 ) 抗逆性遗传改良植物在自然界生长过程中很容易受到外界环境的影响，如旱涝、盐碱、寒冷、强光、高温、低温等作用于植物，会引起植物体内发生一系列生理代谢反应，主要表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至可引发不可逆伤害，从而导致整个植株的死亡。经研究发现，将与脯氨酸、甜菜碱及脂质合成有关的酶的基因克隆后转入植物，可以提高植物相应的抗逆性。我国在抗盐基因工程研究方面已经取得了一些进展，克隆了山菠菜碱脱氢酶、脯氨酸合成酶、磷酸甘露醇脱氢酶等与耐盐相关的酶的基因，通过遗传转化获4第一章前言得了耐盐的转基因草莓、苜蓿和烟草，这些转基因植物已进入田间的试验阶段【删。1 2 4 地黄转基因研究地黄转基因研究方面却有少数的报道。韩国，p a r k 掣4 1 】用根癌农杆菌介导方法把g u s 基因转入地黄，使用组织化学定位和n o r t h e r nb l o t 证明该基因整合到地黄基因组中，建立了稳定的遗传转化系统。l i m 掣4 2 】也用根癌农杆菌介导方法把花生白藜芦醇合酶基因转入地黄，使用s o u t h e r nb l o t 和n o r t h e r nb l o t 和p c r 扩增证明该基因整合到地黄基因组中，获得表达白藜芦醇合酶而且抗尖孢镰刀菌的转基因地黄植物；我国，2 0 0 2 年王敏4 3 1 将目光转向利用转基因技术从根本上防治地黄病毒病，采用生物学鉴定、血清学鉴定、分子生物学鉴定和电镜观察等多种手段，对河南、山东地黄产区的病毒病进行了鉴定，根据鉴定结果，建立了地黄的再生体系，并对地黄进行了t m v 和c m v 外壳蛋白基因转化的前期工作。2 0 0 4 年，胡传银【删利用发根农杆菌r 1 6 0 1 转染怀地黄叶片，经纸电泳分析检测到毛状根中农杆碱和甘露碱的存在，经p c r 检测，证明毛状根基因r o l b转移到毛状根基因组中。周延洲4 5 1 于2 0 0 5 年5 月博士论文第一次报道发根农杆菌转化咚怀地黄获得毛状根克隆，从其中提取梓醇，再生转基因植株，同年1 2 月，s u n 9 4 6 1 也报道用发根农杆菌1 5 8 3 4 转化地黄，获得毛状根克隆，从其中提取梓醇。但是，没有报道- 喜获得转化植株；周延清等【4 7 】于2 0 0 7 年发表发根农杆菌转化怀地黄获得毛状根和转基因植株的文章。同年，张慧等【4 8 1 报道用发根农杆菌感染地黄外植体诱导其产生毛状根，并。加以培养，为今后选择合适的培养方式，大规模培养毛状根来生产地黄的次生物质奠定竹基础。近来，z h o u 等【4 9 】报道发根农杆菌转化怀地黄获得毛状根和转基因植株。1 3 地黄的组织培养研究地黄的组织培养是于1 9 8 3 年开始的，毛文剧5 0 1 等最先开展了怀地黄茎尖培养的研究，迄今为止，国内外关于地黄组织培养的研究已经有了大量的报道，在日本，赤野地黄也实现了脱毒苗的生产【5 1 1 。1 3 1 培养条件培养基大多以m s 为基本培养基，琼脂浓度为0 7 0 8 ，蔗糖浓度3 ，p h5 8 6 0 ，培养温度2 2 2 8 ，湿度7 0 - - 8 0 ，光照强度l0 0 0 - 30 0 0i x ，日光灯和白炽灯都可以光照时间为每天1 2 1 4 小时。1 3 2 研究成果( 1 ) 以茎尖和茎段为外植体的研究_ _ _ _ 。_ 。一一怀地黄转基阏和组毛文岳【删等把田间表现退化的怀地织培养品系鉴定和基因克隆黄“金状元”茎尖作为为外植体，接种于以m s 为基本培养基中，加以不同的激素进行培养。茎尖培养的最适宜激素浓度为6 - b a 0 3 0 4m g l 1 + n a a0 0 2m g l - 1 + g a 0 1m g l - 1 ，地黄茎尖成苗率高达1 0 0 ，如果6 - b a 浓度大于o 5m g l 一1 ，虽然仍可以成苗，但出现了畸形的叶片。吴美芬【5 2 】等以5n l l n 新鲜嫩茎为外植体，将其接种于m s + 6 - b a 3 0m g l + n a a 0 2m g l 1 培养基上，分化出愈伤组织并长出芽后，经切割转移，1 块外植体经2 个月的培养，平均可以产生2 0 棵左右的无根苗。无根苗经生根培养后可形成完整植株，再经过温室炼苗就可以移植到土中。毛文岳【矧，张爱刚5 3 1 等先后对怀地黄茎尖培养苗进行了病毒学的鉴定，结果表明用茎尖培养技术获得的地黄种苗以电镜检查和病毒血清学检测都未曾发现黄斑病毒，经小块地试验产量提高了5 0 以上。( 2 ) 以根为外植体的研究吴美芬等【5 2 】以怀地黄“北京一号”新鲜块根为材料，用在含有m s + k t 0 5m g l 。1 + 2 4 d l 2m g l - 1 的培养基上进行愈伤组织的诱导，经4 周后，可诱导出黄色、致密、颗粒状的愈伤组织，继续培养2 周后，转移至分化培养基m s + 6 b a2m g l 1 + n a a 0 1m g l 1 上，2 周后就有绿色芽点的出现。幼芽长出后，分割并转移到新鲜的培养基上，幼芽可以继续长高，并分化生出大量的丛生芽。再把无根苗转到含生根培养基1 2 m s + n a a 0 1m g l 1 的培养基中，l 周左右后可以长出根，即成为完整的植株。李明军【蚓等也对地黄块根诱导形成愈伤组织和植株再生进行了系统的研究，其研究结果表明：m s + 2 4 d 2 m g l 。1 + n 儿址m g l - 1 有利于“北京一号”块根愈伤组织的形成，m s + 6 b a l m g l - 1 + n a a 0 1 m g l - 1 有利于它的植株再生；1 2 m s + 6 b a 0 5m g l - 1 +n a a 0 0 2m g l1 + g a 3 0 1 m g l - 1 利于“9 3 0 2 ”块根愈伤组织的形成和植株的再生。由此可见，用不同的基因型材料诱导块根愈伤组织的形成和植株再生的最佳激素组合也是不同的。薛建平【5 5 】等把无菌的试管苗在1 2 m s + i b a lm g l 。的培养基中诱导生根，生出了o 5 - l c m 的根后，再转入诱导培养基m s + 6 一b a2m g l - 1 + n a a 0 1m g l - 1 + 蔗糖5 上，在2 5 ，光照20 0 0 - 30 0 0 i x 的条件下进行培养，结果根膨大可形成试管地黄【5 6 1 。( 3 ) 以叶片为外植体的研究。杨丽军5 7 】等以盆栽和试管苗上完全展开的叶片为材料，将叶片切割成块状后，接种于添加了1m g l1 6 - b a 和不同浓度的认a 或n a a 的培养基上，在室温2 8 ，光强l0 0 0i x 条件下进行培养，每天光照l l 小时。结果表明，试管苗的叶片分化能力明显优6第一章前言于盆栽苗的叶片，并指出利用试管苗外植体旺盛的再生能力，可用于大量无菌苗的生产。薛建平【5 8 】等以试管苗叶片为外植体，剪切或保留完整的叶片，正接或背接于附加了不同浓度的培养基中，诱导叶片直接产生再生植株和试管苗地黄。结果表明，最适合叶片直接再生植株的培养基是m s + 6 - b a2 0 m g l - 1 的培养基，m s + 6 一b a1 0m g l 1 + n a a0 5m g l - 1 培养基最适合诱导试管地黄块根形成，并指出叶片的完整性、取材位置、接种方式均会对叶片器官的形态建成产生重要影响。李明军等【5 9 1 研究表明：6 b a lm g l - 1 + n a ao 1m g l 1 的组合有利于怀地黄叶片愈伤组织的形成。陈永勤等【删研究表明：以怀地黄叶片为外植体，i b a2 0m g l - 1 + 6 一b ao 5m g l - 1 糖浓度4 0g l - 1 培养基生根效果比较好，根多、粗壮，移栽后成活率可高达9 8 2 ；i b a 2 0m g l 1 + 6 b a2 0m g l + n a a0 2m g - l 1 ，糖浓度为4 0g l - 1 ，是诱导微型块茎的最佳培养基。许智宏和d a v e y _ 【6 1 】也都曾报道了地黄叶肉的原生质体培养，并对地黄大田栽培、盆栽和试管苗的叶肉原生质体的分离和培养进行了比较，结果表明大田苗和盆栽苗叶肉原生质的分离和培养难度明显大于试管苗，分离的原生质体在m s p l 2 9 m 2 a a 培养液中培*养2 天即可产生分裂现象，而在m s p l 2 9 m 培养基中则需较长时间。因为m s p l 2 9 m 2 a a培养液中添加了氨基酸混合液，它能促进原生质体的分裂和集落细胞群的建成，但芝m s p l 2 9 培养基则更有利于集落细胞群的长期生长，原生质体发生分裂后经4 周的培养，即可通过肉眼观察到形成的集落细胞群。( 4 ) 以花粉为外植体的研究声许智宏【6 1 】等以小饱子时期的单核花粉粒为材料，接种于添加了不同激素的m s 或h的培养基上，2 0 3 5 天就可以诱导出愈伤组织，然后把愈伤组织再转接到m s + 6 b a2m g l 1 + l 认o 5m g l - 1 培养基上，就可诱导植株再生。形成了完整植株后对其根尖进行了核型分析，发现根尖具有2 8 条染色体，而正常的地黄根尖细胞则有5 6 条染色体【6 1 1 。所以证明通过花粉培养获得了单倍体植株，单倍体植株经过染色体加倍成为纯合二倍体植株。1 4 研究目的和意义地黄生产上品种混杂、长期采用营养繁殖和严重的病毒病等因素造成了地黄品种退化。其主要表现为根茎变细，产量下降，质量变差等，直接影响着药农和国家的经济效益。利用发根农杆菌转化获得再生植株，进行药用植物良种繁育，提高药材的质量，为高等植物品质和性状的改良开辟了非常广阔的前景。目前已有上百种植物获得了发状根7怀地黄转基因和组织培养品系鉴定和基因克隆转化植株，这些植株常表现出一些形态或生理生化特性的变异，展示出发根农杆菌介导的遗传转化在植物性状改良及新的有益性状发现方面的巨大潜力。同时，r i 质粒t - d n a随机插入植物基因组可能引起宿主基因组发生突变，从而导致新化合物的产生，这对于发现新的药用化合物是非常有意义的。另外，通过组织培养手段实现植物脱毒快速繁殖和通过体细胞突变选育新品种，对农业生产具有非常重要意义。因此，本研究的研究目的和意义如下：( 1 ) 对已经经过发根农杆菌介导的遗传转化和长期组织培养所获得的怀地黄新品系h w 进行形态、产量、生理生化和s r a p 分子标记等分析鉴定，筛选出高产优良怀地黄新品系( 种) ，应用于怀地黄农业生产。( 2 ) 探索怀地黄分子育种途径，加快其育种进程，提高其育种水平。( 3 ) 建立该怀地黄突变体快速繁殖和高产栽培技术体系，为其大面积推广应用奠定基础。82 实验材料和方法2 1 实验材料2 1 1 植物材料( 1 ) 转基因和组织培养怀地黄突变体品系：h w - i 、h w - 2 、h w - 3 、h w - 4 、h w - 5 、h w - 6 、h w - 7 、h w - 8 、h w - 9 、h w - 1 0 、h w - 1 l 和h w - 1 2 由本研究室保存。( 2 ) 栽培品种：武陟6 号、野生地黄、北京3 号和8 5 5 采自地黄( r e h m a n n i a g l u a n o s an 的主产区河南温县、武陟等地，由华芝芸研究员鉴定。2 1 2 主要药品与试剂( 1 ) 试剂配制il m s 培养基的配制见表1 1 和表1 2 。表i - im s 培养基微量元素和有机母液的贮存液【6 3 】t a b l 一1p r e p a r a t i o no f m i c r o e l e m e n t sa n do r g a n i cs t o c ks o l u t i o n si nm sm e d i u m( 2 ) 所用植物生长调节剂的配制植物生长调节剂一般配制成浓度为0 1m g m l 的溶液( 表l 一3 ) ，4 贮存备用。9怀地黄转基因和组织培养品系鉴定和基因克隆表1 3 地黄组织培养中所需植物生长调节剂的配制t a b 1 - 3p r e p a r a t i o no fp l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sf o rr e h m a n n i at i s s u ec u l t u r e注：用孔径为0 2 2 9 m 的滤膜过滤除茵。s t e r i l i z e dw i t haf i l t e ro f 0 2 2 a m( 3 ) 怀地黄组织培养培养基的配制基本培养基：m s 培养基；愈伤组织诱导培养基：m s + n a a ( 不同浓度) + 6 b a ( 不同浓度)芽分化培养基：m s + n a a ( 不同浓度) + 6 b a ( 不同浓度) ；快繁培养基：m s 培养基+ 1 3m gl 1 6 b a( 4 ) 叶绿素测定试剂丙酮、9 5 乙醇( 5 ) 糖的测定试剂3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 试剂：称取6 5 9d n s 溶于少量热的蒸馏水中，溶解后移入1 0 0 0 m l 的容量瓶中，加入2 m o l l 氢氧化钠溶液3 2 5 m l ，再加入4 5 9 的丙三醇，摇匀，冷却后定容到1 0 0 0 m l 。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖2 0 0 m g ，加入少量的蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至1 0 0 m l ，即含葡萄糖为2 0 m g m l 。6 m o l lh c l i 取2 5 0 m l 的浓h c l ( 3 5 3 8 ) 用蒸馏水稀释到5 0 0 m l 。碘一碘化钾溶液：称取5 9 碘，1 0 9 碘化钾溶于1 0 0 m l 的蒸馏水中。6 m o l l n a o h ：称取1 2 0 9 n a o h 溶于5 0 0 m l 蒸馏水中。0 1 酚酞指示剂。( 6 ) s r a p 分子标记分析所用试剂1 0第一章材料和方法主要药品c t a b ( 溴代十六烷基三甲胺) ，s r a p 弓i 物序列见表1 4 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ，m a r k e r ( 2 0 0 0 b pl a d d e r ) 。t r i s 碱( 郑州宝赛生物科技有限公司) ；二水7 , 2胺四乙酸钠( e d t a n a 2 2 h 2 0 上海生工生物工程技术服务有限公司) ；p 一巯基乙醇( p m e r c a p t o e t h a n o lb b i 公司原装) ；琼脂糖( 郑州宝赛科技有限公司) ；c t a b ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ；聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) ；m g c l 2 ( 2 5m m o l l ) 、d n t p s( 1 0m m o l l ) 、t a q 酶( 北京天根生物科技有限公司) 、上样缓冲液为溴酚兰和二甲基苯青、r n a 酶( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 、a g n 0 3 、过硫酸胺( a p s ) 、酒精、氯仿异戊醇、琼脂糖、硼酸、冰乙酸、溴化已锭( e b1 0 9 9 m l ) 、饱和酚、n a o h和n a c l 等。基因组d n a 制备试剂2 x c t a b 提取液：10m l lm t r i s h c i ( p h 8 0 ) ，4m l 0 5m e d t a ( p h 8 0 ) ，2 8m l 5 m n a c l ，先加入大约5 6m l 热水中，溶液加热时再加入2g 的c t a b 中。使用时临时加入2 的p - 巯基乙醇( p - m e r c a p t o e - t h a n 0 1 ) ，再加入2 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 。氯仿：异戊醇( 体积比为2 4 ：1 ) ：氯仿：异戊醇：无水乙醇( 体积比为8 0 ：4 ：1 6 )r n a s e a l 0m m o l l ，t i r s - h c i ( p h 7 5 ) 1 5m m o l l ，n a c i 配成1 0m g m l ，使用前进行1 0 0 热处理1 5m i n ，目的除去残留的d n a r a s e 活性。琼脂糖凝胶电泳试剂t a e ( 5 0 x ) ：4 8g t r i s 碱，1 1 4 2m l 冰乙酸，2 0m l 0 5me d t a ( p h8 o ) ，用时稀释至5 0 倍。1 5 的琼脂糖凝胶：1 5g 琼脂糖溶于1 0 0m ll x t a e 缓冲液中，在微波炉中反复加热，直至完全溶解。加样缓冲液( 6 x ) ：0 2 5 的溴酚蓝，4 0 ( w v ) 蔗糖水溶液。溴化乙锭( e b ) ：将e b 配成o 5i t g m l ，装在棕色瓶中用铝箔包裹，存放于4 。c 冰箱中备用。k d n a l a d d e r ：使用前于在6 5 水浴中加热1 0m i n ，然后在室温下冷却后使用m e1 3m e1 4t g g g g a c a a c c c g g c t tt g a g t c c aaa c c g g a t ce l t l1 3e m1 4g a c 眦g t a c g aa i mg a c t g c g t a c g aa r r a c g第一章材料和方法在超净工作台上，将转基因和组织培养怀地黄突变品系h w 组培苗的顶芽切下，将其茎切成段，每段具有一对叶，放在快繁培养基上培养，进行扩大繁殖，统计繁殖系数。( 2 ) 转基因和组织培养怀地黄突变品系h w 快繁芽的生根诱导按照路淑霞等人方法【删，将长约3c m 左右的快繁芽接种到m s 培养基上进行生根培养，观察生根情况，统计生根率。( 3 ) 炼苗和移栽将培养了2 5 天左右，具有长势良好的发达根系的快繁怀地黄突变体苗的培养瓶打开，在温室炼苗4 天。然后，将其移栽到沙：土= l ：1 的花盆中，置温室培养一段时间后，移至实验室培养。最后，将其移至阳台培养直至开花成熟。( 4 ) 大田种植将上述怀地黄突变品系h w - 1 至h w - 1 2 的快繁苗或者其块根从花盆中移入大田种植，观察其生长情况和形态特征，测定其叶片叶绿素含量、糖含量和产量。2 2 2 转基因和组织培养怀地黄突变品系h w 叶绿素含量的测定5 】( 1 ) 样品的制备取大田生长的转基因和组织培养怀地黄突变品系h w 幼苗叶片，洗净，用滤纸吸干，去大叶脉后剪碎混匀，称取o 0 5 克，放入比色管中，分别加入1 0 m l 的丙酮：9 5 乙醇= l ：1 ，定容，在避光处浸取2 4h ，重复3 次( 2 ) 叶绿素含量的测定方法以相应的试剂为参比，室温下分别在6 4 5 n m 和6 6 3 n m 处测定吸光度，由下面公式计算叶绿素a 与叶绿素b 的含量：叶绿素a 的含量= 1 2 7a 6 6 3 2 6 9a 6 4 5 】v 1 0 0 0 x w ；叶绿素b 的含量= 【2 2 7a 6 4 5 4 6 8a 6 6 3 】w 10 0 0 x w ；叶绿素总含量= 【2 0 2a 6 4 s + 8 0 2 觚3 w 10 0