（临床检验诊断学专业论文）egfil18融合蛋白在大肠杆菌的表达纯化及复性研究.pdf

温州医学院硕士学位论文 英文缩写词表 2 温州医学院硕士学位论文 氨基酸缩写 温州医学院硕士学位论文 e g f i l 1 8 融合蛋白在大肠杆菌的表达纯化及复性研究 中文摘要 目的： 构建e g f i l 一1 8 融合基因的原核表达载体，分离纯化有活性的e g f i l 一1 8 融合蛋白，为进一步研究其体外和动物体内的生物学作用奠定基础。 方法： 1 e g f i l 1 8 融合蛋白原核表达载体的构建和表达采用p c r 方法，以质粒 p f u s e g f i l 一1 8 为模板，扩增e g f i l 一1 8 融合基因，并将其分别亚克隆入原 核表达质粒p e t l 2 a ( + ) 、p e t 3 2 a ( + ) ，构建二种表达载体p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一 1 8 、p e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 ，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正 确。将二种表达质粒转化ec o l ir o s e t t a ( d e 3 ) ，i p t g 诱导其表达，s d s p a g e 和免疫印迹分析表达产物。 2 表达上清中的e g f i l 1 8 融合蛋白的纯化以n i - n t a 亲和层析和阴离子交换 柱层析d e a e 一5 2 二步法纯化表达上清中的e g f i l 一1 8 融合蛋白。纯化产物经 肠激酶酶切切除t r x a 标签，进一步经n i n t a 亲和层析纯化获得天然n 端的 e g f i l 一1 8 融合蛋白。s d s p a g e 和免疫印迹分析纯化产物。 3 e g f i l 1 8 融合蛋白包涵体的复性及纯化大量表达分离e g f i l 一1 8 融合蛋白 包涵体，并用2m 尿素和1 t r i t o nx 一1 0 0 反复洗涤。以8m 尿素溶解包涵 体，将包涵体裂解液上样于弱阴离子交换柱d e a e 一5 2 ，进行柱上复柱，复性 产物进一步用分子筛s e p h a d e xg 一7 5 纯化。复性纯化产物与人外周血单个核细 胞( p b m c ) 共培养2 4h ，r t p c r 检测p b m ci f n ym r n a 的表达情况来评 价复性效果。 4 体外实验检测e g f i l 1 8 融合蛋白的初步生物学活性将纯化的e g f i l 1 8 融合蛋白作用于人单核细胞性白血病细胞( k g 。1 ) ，e l i s a 法检测培养上清 中i f n 吖的分泌水平来初步评价e g f i l 1 8 融合蛋白生物学活性。 结果： 1 原核表达载体的构建和表达双酶切分析以及测序结果表明原核表达载体 p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 、p e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 与设计相符；工程菌e c o l i 温州医学院硕士学位论文 r o s e t t a ( d e 3 ) p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一18 诱导表达后在分子量为2 5k d a 处可产生 特异的表达条带，并能够被抗人i l 1 8 单克隆抗体所识别。工程菌ec o l i r o s e t t a ( d e 3 ) p e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一18 诱导表达后在分子量为3 7k d a 处可产生 特异的表达条带，并能够被抗人i l 一1 8 单克隆抗体所识别，与预期一致。 2 表达上清中的e g f i l 1 8 融合蛋白的纯化e g f i l 1 8 融合蛋白经n i - n t a 亲 和层析柱和阴离子交换层析柱d e a e 一5 2 二步法纯化后纯度达9 5 。肠激酶酶 切e g f i l 一1 8 融合蛋白可产生分子量为为1 6 7k d a 和2 lk d a 的两个蛋白，与 预期一致。免疫印迹分析证实肠激酶酶切、纯化后的e g f i l 一1 8 融合蛋白能 够被抗人i l 一1 8 单克隆抗体所识别。 3 e g f i l 一1 8 融合蛋白包涵体的复性及纯化变性的e g f i l 一1 8 融合蛋白包涵体 经阴离子交换层析柱d e a e 。5 2 柱上复性和分子筛s e p h a d e xg 一7 5 进一步纯化 后纯度达9 5 。r t p c r 检测结果表明复性产物具有诱导人p b m ci f n - 3 , 基因 表达的能力。 4 体外实验检测e g f - i l 1 8 融合蛋白的初步生物学活性i f n ve l i s a 结果显 示，e g f i l ，1 8 融合蛋白具有明显地诱导k g 一1 细胞产生i f n v 的能力，但活 性低于标准m e t i l 1 8 。 结论： 我们成功构建原核表达载体p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 和p e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 分离纯化获得了具有天然n 端的、有活性的e g f i l 一1 8 融合蛋白，同时建立了 一套e g f i l ，1 8 融合蛋白包涵体的复性和纯化方法，为进一步研究融合蛋白的 体内外生物作用及其工业化生产奠定基础。 关键词： 白介素一1 8 ；表皮生长因子受体；融合蛋白；原核表达；包涵体；复性；肿瘤 靶向性 温卅i 医学院硕士学位论文 e x p r e s s i o n p u r i f i c a t i o n a n d r e f o l d i n g o fe g f i l 一1 8 f u s i o np r o t e i ni ne c o l i a b s t r a c t o b j e c t i v e t oc o n s t r u c tap r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rf o re g f i l 一1 8f u s i o ng e n e ，t o e x p r e s st h ef u s i o ng e n ei ne c o l i , a n dt op r e l i m i n a r i l ye v a l u a t et h eb i o a c t i v i t i e so f e g f i l 一1 8f u s i o np r o t e i ni nv i t r oa n di nv i v o m e t h o d s 1 t h eg e n ef r a g m e n to f e g f i l 一1 8w a sa m p l i f i e db yp c rf r o mp f u s e g f i l 一1 8 ，a n d t h e nw a si n s e r t e di n t op e t - 1 2 ao rp e t - 3 2 at oc o n s t r u c tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 a n d p e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 1 1 1 e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o nv e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) a n di n d u c e d t oe x p r e s s b yi p t g n ep e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8i sd e s i g n e df o re x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n t p r o t e i nf u s e dt ot h e1 0 9a m i n oa c i dt h i o r e d o x i n ( 1 1 7k d a ) ，a6a m i n oa c i dh i s t a g ， a n d1 5a m i n oa c i ds - t a gs e q u e n c e su p s t r e a mo ft h ec l o n i n gs i t e t h ef u s i o nt a g s t o g e t h e rc a nb er e m o v e df r o mt h er e c o m b i n a n tt a r g e tp r o t e i nb yp r o t e a s ec l e a v a g e u s i n ge n t e r o k i n a s e 2 t h et r x a e g f i l 一1 8f u s i o np r o t e i nf r o ml y s a t es u p e m a n tw a sp u r i f i e db yn i - n t a a n di o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yd e a e 一5 2 t h ep u r i f i e dt r x a e g f i l 一18w a s d i g e s t e db yr e c o m b i n a n te n t e r o k i n a s ea n dp u r i f i e db yn i n t at oe l i m i n a t et r x a t a g 3 t h et r x a - e g f - i l 一1 8i n c l u s i o nb o d yw a sr e p e a t e dw a s h e db y2m o l lu r e aa n d1 t r i t o nx 1 0 0a n dd i s s o l v e di n8m o l lu r e a t h ed e n a t u r e dt r x a e g f i l 一18w a s l o a d e do n t ot h ed e a e 一5 2c o l u n ma n dr e f o l d e dd u r i n gal i n e a r8 - 2m o l lu r e a g r a d i e n ta tf l o wr a t e0 5m l m i n f u r t h e r m o r e ，t h er e f o l d e ds a m p l ew a sp u r i f i e d w i t hs i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h ys e p h a d e xg 一7 5 t h ee x p r e s s i o no fi f n - 7 m r n ai np b m ci n d u c e db yt h er e f o l d e de g f i l 一18w a sd e t e r m i n e db yr t - p c r 4 i f n - 7 i n d u c t i o n a n a l y s i s w a su s e d t o i l l u s t r a t e t h e b i o l o g i c a la c t i v i t i e so f e g f i l 一1 8 f u s i o np r o t e i nw i t h o u tt a g s 6 温州医学院硕士学位论文 r e s u l t s 1 t h ep l a s m i dp e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8a n dp e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8p r o v e dt ob er i g h t w h i l ea n a l y z e db yd n as e q u e n c i n ga n dd o u b l e e n z y m ed i g e s t i o n t h et a r g e t p r o t e i n 、i t l lm o l e c u l a rs i z e2 5k d aw a sh i g h l ye x p r e s s e di ne c o l tr o s e t t a ( d e 3 ) p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8a n dw a sm a i n l yp r e s e n ti ni n c l u s i o nb o d ya b s e r v e db ys d s p a g ea n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s t h e n ，t h et r x a e g f i l 一1 8f u i o np r o t e i nw i t h m o l e c u l a rs i z e3 7k d aw a sh i g h l ye x p r e s s e di nec o l tr o s e t t a ( d e 3 ) p e t 3 2 a ( + ) 一 e g f i l 一18d e m o n s t r a t e di ns d s p a g ea n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s 2 t h et r x a - e g f i l 一1 8f u s i o np r o t e i no f h i 出p u r i t yw a sr e c o v e r e da n dp u r i f i e df r o m t h es u p e m a n tl y s a t eu s i n gn i n t aa n di o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y s d s - p a g e a n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i so fe n t e r o k i n a s ec l e a v a g eo f t a g g e d p r o t e i ne x h i b i t e dt w o b a n d si nt h er e g i o no f1 6 7k d aa n d2 1k d ar e s p e c t i v e l y ，i n d i c a t i o n gt h et r x a e g f i l 一1 8w a sc l e a v e dc o r r e c t l y 3 t h ed e n a t u r e dt r x a e g f i l 一1 8w a ss u c c e s s f u l l yr e f o l d i n gb yd e a e 一5 2 c o l u m n t h er e f o l d e dt r x a e g f i l 一1 8s h o w e di f n v i n d u c i n ga c t i v i t yi np b m c o b s e r v e db yr t p c r 4 i f n y i n d u c i n ga c t i v i t y o fe g f i l 一1 8f u s i o n p r o t e i n ( w i t h o u tt a g s ) w a s d e m o n s t r a t e du s i n gae l i s ak i t w ef o u n dt h a te g f i l 一18f u s i o np r o t e i nc o u l d i n d u c et h ee x p r e s s i o no fi f n - 7i nk g l ，t h o u g ht h i st y p eo fa c t i v i t y , c o m p a r e dt o s t a n d a r dm e t i l 一1 8 ，w a ss o m e w h a tc o m p r o m i s e d c o n c l u s i o n w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t l 2 a ( + ) - - e g f - i l 一1 8a n dp e t 3 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8 e f f i c i e n te x p r e s sp e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 一1 8a n d p e t 3 2 a ( + ) - e g f i l 一18i nec o l t , a n dh a r v e s t e db i o a c t i v ee g f i l 一18f u s i o np r o t e i n h a r b o r i n ga u t h e n t i cn t e r m i n a l m e a n w h i l e ，w ef o rt h ef i r s tt i m ee s t a b l i s h e das e r i e s o f m e t h o d s a n d p r o t o c o l s f o rr e f o l d i n g a n d p u r i f i c a t i o n o f e g f - i l 一1 8 f u s i o n p r o t e i n i n c l u s i o nb o d ya n dl a yas o l i db a s ef o rd e t a i l e de v a l u a t i o no fb i o a c t i v i t i e so fe g f i l 一1 8i nv i t r oa n di nv i v oa sw e l la sf o ri t sm a s s p r o d u c t i o n k e y w o r d si n t e r l e u k i n - 18 ；e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ；f u s i o np r o t e i n ； p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；i n c l u s i o nb o d y ；r e f o l d i n g ；t u m o rt a r g e t i n g 7 温州医学院硕士学位论文 前言 恶性肿瘤是威胁人类的常见病，也是人类生命的主要“杀手”之一，因此癌症 的治疗始终是人们十分重视的课题。传统的放、化疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指 数过小、副作用大等一系列缺点。为了增加疗效减少毒性，人们提出介入治疗和 定向放疗的方法，希望能以此达到特异性杀灭癌组织的目的，但由于肿瘤的一些 微小转移灶难以被检测到，这种物理学方法对肿瘤的靶向治疗非常有限。近年， 针对某些受体、基因或关键物质的靶向治疗药物正在成为药物研制的重要方向。 这类药物主要靶向作用于相关的肿瘤细胞上，一方面提高对肿瘤细胞的杀伤力， 另一方面减少对正常组织细胞的不良作用。靶向治疗药物正在使肿瘤内科治疗从 姑息性治疗向根治过渡，其最大优势就在于针对性强、效果显著，在杀伤癌细胞 时基本上不损伤正常组织，被认为是未来癌症治疗中最具前景的研究方向。 白细胞介素一1 8 ( i n t e r l e u k i n 1 8 ，i l 1 8 ) 又称为i f n - 7 诱导因子，于1 9 9 6 年 由u s h i o 等克隆，其前体含1 9 3 个氨基酸，成熟肽为1 5 7 个氨基酸，以单体形式 发挥作用i 。“。其主要生物学活性是诱导t 细胞产生i f n y ，促进t 细胞和n k 细 胞增殖活化以及促进f a s 配体表达，抑制血管生成等1 - i - 7 1 。i l 一1 8 诱导i f n y 的能 力以及诱导c t l 细胞生长的能力均强于i l 1 2 ，并与i l 1 2 有协同效应吼动物 实验表明，i l 一1 8 具有明显的抗肿瘤作用，这一作用通过诱导小鼠体内的n k 细 胞和c d 8 + t 细胞的细胞毒活性而间接发挥l “l 。因此，i l 一1 8 在肿瘤生物治疗方 面具有潜在的应用前景。但由于i l 一1 8 的效应细胞n 1 和n k 细胞广泛分布于 人体各部位，容易激发炎症反应，产生副作用。因此，需要一种导向序列来加强 i l 一1 8 对肿瘤细胞的靶向性，即如何使细胞因子在体内定向地作用于肿瘤细胞。 另一方面，表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 受体( e g fr e c e p t o r ，e g f r ) 是跨膜受体酪氨酸激酶，介导e g f 等生长因子的生物效应1 ”，其功能失调与几 乎所有癌细胞关键特征诸如自发性生长、侵蚀性、促血管生成和远距离转移等的 出现有关| 】。i ，约三分之一的人类肿瘤细胞中可检测到e g f r 的过表达，这与患 者对放化疗的敏感性及预后直接相关f 1 。研究结果表明，e g f r 配体的第三个环 状结构保守基序( c l o o p ) 可特异性结合肿瘤细胞表面的e g f r 但并无活化 e g f r 的功能，即可干扰e g f r 介导的肿瘤细胞的刺激效应，被称为e g f 受体 干扰基序i j 。”。如果融合e g f 受体干扰基序和i l 一1 8 成熟肽分子，能够得到一个 温卅医学院硕士学位论文 具有肿瘤细胞靶向性和抗肿瘤效应的多功能融合蛋白，而且融合蛋白特异性的靶 向作用可减少i l 、1 8 在肿瘤治疗中的负反应。 大肠杆菌是目前体外重组蛋白表达系统中应用最广泛的表达宿主，具有遗传 背景清楚、生产研究周期短、成本低、表达量高和易于操作等优点。本课题中我 们利用原核表达载体在大肠杆菌中高效表达了e g f i l 一1 8 融合蛋白。从表达上清 中，我们通过n i - n t a 亲和层析、阴离子交换柱层析d e a e 一5 2 和肠激酶酶切等多 步纯化，获得了具有天然n 端的e g f i l - 1 8 融合蛋白，同时建立了一种简便有效 的复性纯化e g f 、i l 1 8 的方法，并对纯化产物进行了免疫印迹及初步的生物学活 性鉴定，为进一步开展e g f i l l8 的动物实验及其大量纯化制备打下基础。 温州医学院硕士学位论文 第一部分e g f i l 一1 8 融合基因序列分析及其在p e t - 1 2a ( + ) e c o l i r o s e t t a ( d e 3 ) 系统中的表达 材料与方法 材料 一、菌株及质粒 p f u s e g f i l 一1 8 ：由盂哲峰硕士构建，内含e g f 受体干扰序列连接区一白介 素1 8 ( 下简称e g f i l 一1 8 ) 的基因。p m d l 8 一ts i m p l e ：t a 克隆载体，购白 t a k a r a 公司。p e t 3 2 a ( + ) ：t r x a ( 硫氧还蛋白) 融合蛋白表达载体，购自美国 n o v a g e n 公司，质粒图谱见图i - 1 。p e t l 2 a ( + ) ：信号肽o m p t 融合蛋白表达载 体，购自美国n o v a g e n 公司，质粒图谱见图1 - 2 。菌株ec o l id h 一5 c 【、 b l 2 1 ( d e 3 ) 、r o s e t t a ( d e 3 ) 、r o s e t t a - g a m i ( d e 3 ) 眭t 本实验室保存。 图1 - ip e t 3 2 a ( + ) 融合蛋白表达载体 f i g 1 1v e c t o rm a p o fp e t 3 2 a ( + ) 温州医学院硕士学位论文 图1 - 2p e t l 2 a ( + ) 表达载体 f i g 1 2v e c t o rm a po fp e t l 2 a 二、抗体 鼠抗人i l 一1 8 单克抗隆抗体购自m b l 公司，h r p c o n j u g a t e dg o a ta n t i m o u s e i g g 一购于珠海百奥公司。 三、主要试剂及材料 限制性内切酶b a m hi 、b p u l l 0 2i 、n d ei 、k p ni 、x h oi ，p y r o b e s t d n a 聚 合酶、t 4d n a 连接酶，质粒小量抽提试剂盒、p c r 产物纯化试剂盒、胶回收试 剂盒购于大连宝生物工程有限公司。核酸分子量标准、预染蛋白质分子量标准购 自f e r m e n t a s 公司。标准m e t i l 1 8 、鼠抗人i l 一1 8 单克抗隆抗体购自m b l 公 司，e c l 发光试剂盒购自珠海百奥公司。r n a 酶购自r o c h e 公司，i p t g 购于 a m r e s c o 公司；p v d f 膜为美国b i o r a d 产品。其他所用化学试剂均为国产 分析纯。 四、主要溶液及培养基的配制 e l b 培养液及培养基： 温州医学院硕士学位论文 成分量 酵母提取物 胰蛋白胨 n a c l 5g 1 0g 1 0g 加双蒸水至9 5 0m l ，用1 0mn a o h 调p h 值至7 0 7 2 ，1 5 磅高压灭菌2 0 - 3 0 m i n ，置4 储存备用。在每升l b 液体中加入1 4g 琼脂粉即为固体l b 培养基， 经1 5 磅高压灭菌2 0 3 0r a i n ，置4 c 储存备用。 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 0 t a e ) ： 成分量 t r i s2 4 2 g 冰乙酸5 7 1 m l 0 5 me d t a ( p h8 0 、10 0m l 加蒸馏水定容至1 0 0 0m l ，工作液稀释5 0 倍。 质粒小提： 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖，2 5 m m t r i s h c l ( p h8 0 ) ，1 0 m m e d t a ( p h8 0 ) 溶液i i ：o 2m n a o h ，l s d s ( 临用前配) 溶液m ：6 0 m l5 m 乙酸钾，1 1 5 m l 冰乙酸，2 8 5 m l 蒸馏水 o t e 缓冲液( p h8 0 ) ：1 0m mt r i s h c l ，1m me d t a ( p h8 o ) o s d s p a g e 电泳与免疫印迹的主要溶液 1 5 mt r i s ( p h8 8 ) 2 0 0 m l ：称量t r i s3 6 3 3 9 ，加蒸馏水1 5 0 m l ，用h c l 调p h 8 8 ，加水定容至2 0 0m l ，置4 储存备用。 1 0 mt r i s ( p h6 8 ) 1 0 0 m l ：称量t r i s1 2 1 1 4g ，加蒸馏水8 5m l ，用h c i 调 p h 至6 8 ，加水定容至1 0 0 m l ，置4 c 储存备用。 1 0 s d s ( 1 1 1 v ) ：取s d s1 0g ，加蒸馏水9 0m l ，加热至6 8 。c 助溶，用h c l 调p h 至7 _ 2 ，定容至1 0 0 m l 。 0 1 0 a p ( 咖) ：取1g 过硫酸铵，加蒸馏水定容至1 0m l ，分装后于一2 0 。c 保 存备用。 3 0 a c r b i s 母液( 拧咖) ：取b i s1g ，加入3 0m l 蒸馏水，于3 7 。c 溶解完全 后，加入a r c2 9g ，搅拌溶解后定容至1 0 0m l ，滤 纸过滤后4 避光保存。 1 2 温州医学院硕士学位论文 1 2 分离胶1 0m l 0 5 聚合胶7 5m l 0 2 x 蛋白上样缓冲液1 成分量 d d h 2 0 3 0 a c r b i s 1 5 mt r i s ( p h 8 8 、 1 0 s d s 1 0 a p t e m e d 3 2 m l 4m l 2 7 m l 1 0 0l l l 5 0u l 5 3 i x l 成分量 d d h 2 0 4 5 5m l 3 0 a c 腮i s1 0m l 1 0 mt r i s ( p h 6 8 、1 9m l 1 0 s d s7 5l l l 1 0 a p7 5u l t e m e d 7 5g l 1 m t r i s h c l ( p h6 8 ) 2 0 0r n m d t t 0 2 溴酚兰( m v ) 2 0 甘油( v v ) 4 s d s ( m v ) 1m l o 3 0 8g o 0 2g 2m l 0 4g 加蒸馏水至1 0m l 。可配成2 或4 缓冲液，室温保存，d t t 临用前加。 考马斯亮蓝染色液1 0 0m l ： 成分量 甲醇 蒸馏水 冰乙酸 4 5m l 4 5m l 1 0 m l 称取考马斯亮蓝r 一2 5 00 2 5g ，溶解，过滤除去杂质。 温州医学院硕士学位论文 凝胶脱色液1 0 0 m l ： 甲醇45 m l 蒸馏水45 m l 冰乙酸 1 0m l t r i s 甘氨酸电泳缓冲液： 2 5 0 m m 甘氨酸( p h 8 3 ) 1 4 4g 2 5 m m t r i s3 0g 0 1 s d s ( m v ) 1g 溶于蒸馏水并定容至10 0 0m l 。 转移缓冲液： t r i s 一甘氨酸电泳缓冲液中含2 0 q a 醇。 1 0 x p b s ( p h 7 4 ) ： 1 4mn a c l ，2 7m mk c l ，1 0 1m mn a 2 h p 0 4 ，1 8m mk h 2 p 0 4 ，p h7 4 。 5 脱脂奶粉： 取5g 脱脂奶粉，溶于1 0 0m l p b s ( p h 7 4 ) o 一 t p b s ： 含o 0 5 ( v v ) t w e e n 2 0 的p b s ( p h7 4 ) 。 五、主要仪器 a i r t e c h 超净工作台( 苏净集团安泰公司) m y c y c l e p c r 仪( 美国b i o r a d 公司) m i c r o f a g e2 2 r 型离心机( 美国b e c k m a nc o u l t e r ) d y y - 5 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) h a n g p i n gf a 2 0 0 4 分析( 称量) 天平( 上海精科天平实业有限公司) 优普超纯水机( 优普公司) 蛋白电泳及电转移系统( 美国b i o r a d 公司) j y 9 2 2 d 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝生物科技股份有限公司) i - i z q x 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) g e n eg e n i u s 生物成像系统( 英国s y n g e n e 公司) d u - 8 0 0 核酸蛋白分析仪( 美国b e c k m a nc o u l t e r ) 温卅i 医学院硕士学位论文 s a n y o 生物医学冷柜( 日本s a n y o 公司) 方法 一、目的基因e g f i l 一1 8 的获得 ( 一) 引物设计与合成 根据e g f i l 一1 8 基因序列，用p r i m e r 5 0 ，设计一对特异性引物：上游引物 p 1： 5 - c g c 鱼鱼盟c g c t g c t c c c a t g 一3 ；下游 引 物 p 2 ：5 一 c g c 鱼! q c 1 a g t c t t c g t t t t g 一3 。p 1 、p 2 的5 端分别包含了b a m hi 、 肋u 1 1 0 2i 两个限制性内切酶酶切位点并在酶切位点前加了3 个保护性碱基。引 物由上海生工合成。用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为1 0 0g m o l l ，使用 浓度为2 0g r n o l l 。 ( 二) 高保真p c r 反应 p c r 反应体系： r e a g e n t sv o l u m e ( g l ) p c r 反应条件如下：9 4 5 r a i n ；9 4 3 0s e c ，6 0 3 0s e c ，7 2 6 0s e c ， 3 5 个循环；7 2 5r a i n ，4 保存。取5u l 产物以1 s na g a r o s e 凝胶电泳鉴 定。 ( 三) p c r 产物加a 反应 在上述p c r 反应产物中按每5 0 止加入5u 的比例加入e xt a q 聚合酶，7 2 1 0m i n 。 ( 四) 目的基因e g f i l 1 8 的纯化回收 加a 反应产物用p c r 产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的t e 或d d h 2 0 溶解洗脱备用。 温州医学院硕士学位论文 ( 五) 目的基因片段与p m d l 8 - ts i m p l e 载体连接 按t a k a r a 公司的p m d l 8 一ts i m p l ev e c t o r 试剂盒说明书进行t 载体与目的 基因的连接。连接反应体系： r e a g e n t sv o l u m e ( _ t l ) p m d l 8 一ts i m p l ev e c t o r e g f i l 一1 8 回收产物 d d h o l i g a t i o ns o l u t i o n 连接反应于1 6 。c 过夜。 ( 六) 转化 l 、大肠杆菌d h 一5 a 感受态细胞的制备( c a c l 2 法) ： ( 1 ) 将一7 0 。c 冻存的d h 一5 c t 接种于约2 3 m l 的l b 液体培养基中，3 7 。c ，2 0 0 r p m ，振荡培养过夜。 ( 2 ) 将振荡培养过夜的细菌5 0 0 此加入含有5 0m ll b 液体培养基的三角烧瓶 中，振荡培养3h 3 5 h 。 ( 3 ) 将菌液移入冰预冷的5 0 m l 聚丙烯管中，冰上放置1 0 m i n 。 ( 4 ) 4 c ，4 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清，收集菌体。 ( 5 ) 以1 0m l 冰预冷的o 1mc a c l 2 重悬沉淀，置于冰上。 ( 6 ) 4 c ，4 ，0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。 1 7 ) 用2m l 冰预冷的0 1 mc a c l 2 重悬沉淀，分装( 1 0 0 此，每管) 。直接用于转 化或加入1 5 甘油，放于一7 0 。c 冻存。 2 、连接反应产物的转化 ( 1 ) 取1 0 0i x l 感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴3 0 m i n 。 ( 2 ) 4 2 。c 热休克9 0 1 2 0 秒一冰浴3 5m i n 。 ( 3 ) 加8 0 0g l l b 液体培养基，摇匀，3 7 。c1 0 0r p m 振荡培养1 小时。 ( 4 ) 分别用l b 液体培养基稀释1 0 倍、1 0 0 倍，并各取o 1 m l 分别涂于l b a m p + 的平板上。 ( 5 ) 待菌液完全吸收后，倒置培养皿，3 7 。c 过夜。 温州医学院硕士学位论文 ( 七) 重组克隆p m d l 8 t - e g f i l 一1 8 的双酶切和目的片段e g f i l 一1 8 的回收 1 、碱裂解法小量质粒d n a 的制备( 按分子克隆中的方法进行) ( 1 ) 用接种环从l b a m p + 平板上随机挑选几个白色单个菌洛，接种于新鲜的 ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) ( 6 ) l b 液体培养基中，1 0 0 - 1 5 0r p m ，3 7 c 过夜。 取1 5 m l 过夜培养菌液加入e p 管中，4 ，1 0 ，0 0 0r p m x lr a i n 离心，尽弃 上清。 加入1 0 0 9 l 溶液i 剧烈振荡，悬浮沉淀。 加入2 0 0g l 溶液i i 轻轻颠倒几次，冰上放置3 5r a i n 。 加入1 5 0u l 溶液i i i 轻轻颠倒几次，混匀，5 1 0r a i n 。 4 ，1 2 ，0 0 0r p m 1 0 r a i n 离心，将上清移入另一e p 管，加等体积的饱和 酚：氯仿，上下颠倒混匀。 ( 7 ) 4 ，1 2 ，0 0 0r p m 1 0m i n 离心( 酚、氯仿抽提这一过程可反复几次) 。 ( 8 ) 将上清移入另一e p 管中，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀，一2 0 。c ，3 0 m i n 。 ( 9 ) 4 ，1 2 ，0 0 0r p m 1 5 r a i n 离心，弃上清，7 0 7 , 醇洗涤两次。 ( 1 0 ) 4 ，1 2 ，0 0 0r p m 1 5m i n 离心弃上清，室温干燥3 0m i n ，使乙醇挥发干。 加适量的t e 或d d h 2 0 溶解备用。 2 、p m d l 8 t e g f i l 一1 8 质粒的双酶切和目的片段e g f i l ，1 8 的回收 随机挑取转化平板上的白色单个菌落接种于3m ll ba m p + 夜体培养基中， 3 7 培养过夜。按上述碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切，其反应体系如下： r e a g e n t sv o l u m e ( 此) p m d l 8 t - - e g f - i l - 1 8 b a m hi ( 1 0 u 山) 印u 1 1 0 2i ( 1 0 u i t l ) 1 0 b u f f e r d d h 2 0 2 0 1 l s 2 3 t o t a l 5 0 3 7 。c ，酶切3 小时。 目的片段e g f i l 一1 8 的切胶回收： 酶切反应后产物行o 8 低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的 温州i 医学院硕士学位论文 d n a 片段，以t a k a r a 公司胶回收试剂盒进行回收。 析仪对回收产物定量。 二、p e t l 2 a ( + ) 载体片段的制备 ( 一) 碱裂解法中量制备p e t l 2 a ( + ) 载体 1 、挑一个单菌落接种于3m ll ba m p + 夜体培养基， 1 6 2 0 小时。 最后以d u 一8 0 0 核酸蛋白分 3 7 。c ，1 5 0r p m 振荡培养 2 、移1m l 菌液至3 0 m l 经3 7 c 预热的l b a m p + 夜体培养基，3 7 。c ，1 5 0r p m 继续振荡培养约8 1 2 小时。 3 、将菌液转至5 0 m l 离心管中，4 。c ，5 ，0 0 0r p m x 2 0 r a i n 离心，弃上清，菌体沉 淀用5m l s t e 溶液重悬，4 。c ，5 ，0 0 0r p m x 2 0r a i n 离心。弃上清，沉淀用2 m l 溶 液i 重悬，室温放置1 0 分钟。 4 、加入4 m l 溶液i i ，颠倒离心管数次，混匀内容物，室温静置5 分钟。 5 、缓慢加入2 m l 溶液，颠倒离心管数次，混匀，冰浴5 分钟。 6 、4 。c ，3 ，0 0 0r p m 1 0m i n 离心，取上清，加入0 6 倍体积的异丙醇，混匀，一 2 0 。c 放置3 0 分钟。4 。c ，3 ，0 0 0r p m x l o m i n 离心， 7 、4 。c ，3 ，0 0 0r p m 1 0 m i n 离心，弃上清，加入1 m l t e 缓冲液溶解沉淀，n a 等 体积5 m l i c l 2 ，混匀，冰浴1 0 分钟。 8 、4 。c ，3 ，0 0 0r p m x l o m i n 离心，取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，一2 0 。c 放 置3 0 分钟。 9 、4 c ，3 ，0 0 0r p m 1 0m i n 离心，弃上清，加入2 0 0 此t e 缓冲液溶解沉淀，转入 一个e p 管中。 1 0 、加入5 此的2i _ t g l x l r n a s e 溶液混匀，置3 7 。c 温浴3 0 分钟。 1 1 、1 4 ，0 0 0g x 离心2 0 分钟，4 。c 。取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇( 2 4 ： 2 4 ：1 ) ，旋涡混合器上混匀。 1 2 、4 。c ，1 4 ，0 0 0g “1 0 m i n 离心，取上层水相，转入一个新的e p 管中，加入0 1 倍体积的3m 乙酸钠( p h 5 2 ) 和两倍体积的无水乙醇， 2 0 。c 放置过夜。 1 3 、1 4 ，0 0 0g 2 0 r a i n