L05076钟东红结题论文

降解抗菌肽Cecropin B的植物细胞外蛋白酶的分离、纯化与基本性质鉴定钟东红 江榕欣（华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642）摘要：抗菌肽Cecropin B是目前国内外广泛应用的一类植物活性肽，利用信号肽将抗菌肽分泌到胞外以提高其在转基因植株体内的稳定性。目前这方面研究取得了一定的效果，但是细胞外仍然存在降解抗菌肽的酶类，这些酶类是影响抗菌肽积累的主要障碍。本实验目的是检测出这些酶，分离及纯化，以便进一步研究酶的作用机理，有利以后的抗菌肽Cecropin B基因改造。关键词：胞外酶、抗菌肽、葡聚糖、DEAE-纤维素抗菌肽(antibacterialpeptide,)又称抗微生物肽(antimicrobialpeptide,)或肽抗生素(peptideantimicrobiotics),广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内,是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。由于具有广谱抗菌作用,能杀死抗生素耐药菌株,且杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变,以及能抑杀一些真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞和实体瘤等特点,抗菌肽有望开发成为新一代抗细菌、抗真菌、病毒和抗癌药物,若能将其基因转入动植物体内则可提高动植物抗病能力1。由由于其应用前景广阔,现已成为生命科学领域的一个研究热点。Cecropins是其中的一类,由3739个氨基酸组成,相对分子质量约4000Da,具有广谱的抗菌能力和抗病毒活性。CecropinB(天蚕素B)最早是由Boman从天蚕体内分离得到的,是一类热稳定和广谱抗菌的可溶性多肽。2利用信号肽将抗菌肽分泌到胞外以提高其在转基因植株体内的稳定性。目前这方面研究取得了一定的效果，但是细胞外仍然存在降解抗菌肽的酶类，这些酶类是影响抗菌肽积累的主要障碍。本实验目的是检测出这些酶，分离及纯化，以便进一步研究酶的作用机理，有利以后的抗菌肽Cecropin B基因改造。1 材料与方法1.1 材料试剂与仪器设备1.1.1 材料试剂小辣椒苗，田间采集；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；丙烯酰胺（Acr）；甲叉双丙烯酰胺（Bis）；过硫酸铵；四甲基乙二铵（TEMED）；甘氨酸；丙氨酸；蔗糖；考马斯亮蓝R250；甲醇；冰醋酸；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；NaOH；NaCl；12mol/LHCl；DEAE-纤维素；葡聚糖G-100凝胶；抗菌肽Cecropin B；大肠杆菌；1.1.2 仪器北京市六一仪器厂DYC-23A型电泳槽；eppendorf 5810R高速离心机；HWS24型电热恒温水浴锅；低温冰箱；真空冷冻干燥仪；DZG-6050SA真空干燥箱；DBS-160电脑全自动部分收集器；保定格兰恒流泵B100-50M；分光光度计。1.2 方法1.2.1辣椒叶片细胞胞外酶的提取 把辣椒苗连根、茎、叶从土壤中取出，用水冲洗干净，用剪刀剪下叶片，蒸馏水反复浸泡冲洗，直至浸泡液呈无色。把水倒掉，加入pH=7.0磷酸缓冲液PBS，真空抽滤5分钟，间隔2分钟，再真空抽滤5分钟。取出叶片，并用滤纸吸干叶子表面液体，分别整齐地放入特制离心管中，离心1000转/分钟5分钟，取上清液，即为辣椒叶片细胞胞外酶提取液。1.2.2辣椒叶片细胞胞外酶提取液降解抗菌肽Cecropin B试验31. 细菌的培养 用培养平板法培养大肠杆菌2. 辣椒叶片细胞胞外酶提取液降解抗菌肽活性的检测 在大肠杆菌平板培养基等距打孔，加入抗菌肽Cecropin B和辣椒叶片细胞胞外酶提取液，另有一个孔只加入抗菌肽Cecropin B以作对照1.2.3辣椒叶片细胞胞外酶提取液的电泳检测4 pH值4.3聚丙烯酰胺凝胶提纯电泳（PAGE）1.试剂配制：（1）30%胶体母液：30克丙烯酰胺和0.8克甲叉丙烯酰胺，加水至100ml，4避光保存。（2）分离胶缓冲液：1mol/LNaOH30ml，冰醋酸10.7ml，加水至500ml, pH值4.3。（3）过硫酸铵：临用前配制成10%，4保存。（4）电极缓冲液：3.12克丙氨酸，冰醋酸0.8ml，加水至1L。 2.配制分离胶：30%胶体母液8ml，分离缓冲液6.7ml，蒸馏水5.2ml，10%过硫酸铵80l，TEMED85l，得12%分离胶。 3.染色与脱色。常温下R250染色过夜，脱色。结果如图 pH值8.9聚丙烯酰胺凝胶提纯电泳（PAGE） 试剂配制：（1）30%胶体母液：30克丙烯酰胺和0.8克甲叉丙烯酰胺，加水至100ml，4避光保存。（2）分离胶缓冲液：Tris18克，1mol/LHCl24ml，加水至100ml。（3）电极缓冲液：Tris3克，甘氨酸14.3克，加水至500ml。1.2.4辣椒叶片细胞胞外酶提取液的分离、纯化1. DEAE-纤维素阴离子交换层析分离5DEAE-纤维素阴离子交换剂预处理：先用0.5mol/LNaOH浸泡1小时，浸泡过程中慢慢搅拌，用蒸馏水洗涤至中性，然后再用0.5mol/LHCl浸泡1小时，用蒸馏水洗涤至中性，最后用0.5mol/LNaOH作以上处理。DEAE-纤维素阴离子交换剂装柱：先用pH值7.0的0.04mol/L磷酸缓冲液（PBS）浸泡平衡。然后装柱，得到DEAE-纤维素层析柱，柱高8.5cm,直径2cm。加样：加辣椒叶片细胞胞外酶提取液1.2ml洗脱：分别用含0mol/L、0.3mol/L、0.5 mol/L、0.8mol/L 、1.0 mol/L NaCl的0.04mol/L磷酸缓冲液（PBS）进行梯度洗脱。控制洗脱液流速在6分钟收集1管，每管4ml。分别用分光光度计测取其OD280值。收集活力峰,透析除盐，聚乙二醇浓缩。 2. 交联葡聚糖（S-ephadex）G-100柱层析分离6 交联葡聚糖（S-ephadex）G-100柱层析：柱高14cm，直径2cm。 加样： DEAE-纤维素阴离子交换层析的活力峰2 ml洗脱：用0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS）洗脱，控制洗脱液流速在6分钟收集1管，每管4ml。分别用分光光度计测取其OD280值。1.2.5纯化后酶液的抗菌活性检测收集DEAE-纤维素阴离子交换层析洗脱（图表 1）活力峰和交联葡聚糖（S-ephadex）G-100柱层析（图表 2）活力峰，透析脱盐浓缩，再分别利用纯化后酶液进行抗菌试验，检测其降解抗菌肽活性。2 结果与分析2.1辣椒叶片细胞胞外酶提取液的电泳检测 图1.提取液pH值8.9 PAGE电泳结果 图2. 提取液pH值4.3 PAGE电泳结果在图1的pH值8.9 PAGE电泳结果中，可以看到电泳出2条明显的蛋白带。而图2的pH值4.3 PAGE电泳结果中的蛋白带数目远多于图1。两图的结果比较后，可知辣椒叶片细胞胞外酶提取液中蛋白酶大部分的等电点在pH值8.9以上，在pH=8.9的电泳环境中，蛋白分子还带正电荷，没能电泳出多数蛋白带。相反，采用pH=4.3 的PAGE电泳时，电泳效果较好。这说明了叶片细胞胞外提取液的主要蛋白酶的等电点在pH7.0以上。2.2辣椒叶片细胞胞外酶提取液降解抗菌肽Cecropin B试验图3胞外提取液抗菌实验结果 图3所示培养大肠杆菌的平板培养基，两个孔都滴加了抗菌肽Cecropin B，上面的孔A还加入了辣椒叶片细胞胞外酶提取液。结果只加入抗菌肽Cecropin B的孔B的周围出现了没有生长大肠杆菌的抑菌圈，显示了抗菌肽的抑菌作用。而加入混合液的上孔A周围都有菌落生成，这说明了辣椒叶片细胞胞外酶提取液对Cecropin B有降解活性。2.3辣椒叶片细胞胞外酶提取液的分离、纯化1. DEAE-纤维素阴离子交换层析分离图 4 DEAE-纤维素洗脱曲线 从图4得出，在用0mol/L、0.3mol/L NaCl的0.04mol/L磷酸缓冲液（PBS）进行梯度洗脱时出现峰值，OD值分别是1.148和0.192。在其他的洗脱梯度下，洗脱曲线没有出现明显的峰值。所以，收集第5管到第9管洗脱液得到峰；收集第19管到第21管洗脱液得到峰。2. 交联葡聚糖（S-ephadex）G-100柱层析分离图5 交联葡聚糖G-100柱洗脱曲线 将收集到的峰蛋白液经冷冻浓缩后，再经葡聚糖G-100柱洗脱， 从图5可以看出，效果不是很好，经交联葡聚糖G-100柱层析洗脱只出现一个峰，蛋白最高出现在第11根管，OD值0.114。收集第11管和第12管洗脱液得到峰。1.2.5纯化后酶液的抗菌活性检测图6洗脱液抗菌实验结果(上排孔AC：只加入抗菌肽做对照；下排孔DG: 除加入抗菌肽外依次加入胞外酶提取液、峰、峰、峰) 图6所示培养大肠杆菌的平板培养基，上排的三个孔只加入了Cecropin B，孔周围都出现了抑菌圈；下排孔除了加入Cecropin B外，还分别加入辣椒叶片细胞胞外酶提取液、DEAE-纤维素阴离子交换层析分离的峰、峰、交联葡聚糖G-100柱层析分离峰，结果四个孔都没有出现抑菌圈，说明了以上个组分均有降解Cecropin B的活性。3 讨论本试验提取了辣椒的胞外酶液，并检测到具有降解抗菌肽Cecropin B的活性。辣椒胞外酶液经过葡聚糖G-100和DEAE纤维素分离、纯化，并作了抗菌试验，但发现经过以上的分离、纯化步骤后得到的各成分都能降解抗菌肽Cecropin B，没有出现单一蛋白降解的情况，分析原因可能为：1.可能有多种蛋白酶均有降解Cecropin B活性；2.纯化效果不够好，理论上阳离子交换树脂最适合本实验，但由于过于昂贵，经费所限，没有条件。经过创新课题的实验，本人对抗菌肽Cecropin B性质有了一个比较清晰的了解，增强了查找，阅读和提取有参考价值的资料文献的能力，深入地理解了蛋白酶的分离纯化原理和实验操作熟悉如何开展一个实验项目的流程和实验设计，提高了善于独立思考，解决问题的能力，为今后进行生物学方面的工作打下了基础。参考文献：1吴金梅，陈丽颖，王艳玲.抗菌肽的研究进展及应用前景.动物医学进展，2005，26(9):27 30