食品微生物检验总结

1 / 54 食品微生物检验总结 1. 食品微生物检验是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律、对人 和动物健康的影响及其检验方法与指标的一门学科。 2. 食品微生物检验指标：菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后 1g1ml 或 1cm2检样中 所含细菌菌落的总数。大肠菌群：指一群在 37 摄氏度培养24小时能发酵乳糖、产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。致病菌：即能够引起人们发病的细菌。 3. ICMSF 取样方案： A.三级法 用做菌落总数和大肠菌群；B.二级法 用做致病菌。根据食品危害程度和 指标严重程度划 分。 2 / 54 4. 美国 FDA 取样方案 P69 自已画图 5. 样品可分为大样、中样、小样。要准确区分。大样指一整批；中样是从样品各部分取的混合样，一般为 200g;小样又称 为检样，一般以 25g为准，用于检样 . 6. 食品常用的采样方法：液体食品：充分混匀，用无菌操作拆开包装，用 100ml无菌注射器抽取，注入无菌盛样容 器。半固体食品：用无菌操作拆开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌盛样容器。固体样品：大块整体食的代表性，小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌盛样容器冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取，大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻快上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品，放入无菌盛样容品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取，割取时应兼顾表面与深部，注意样品器若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应取深部样品。 3 / 54 7. 样品的制备是指对所采集的样品再进行分取、粉碎以及混匀等过程。制备的方法可以根据被检食品的性状和检验要求， 采取剪碎振摇法、捣碎均质法、胃蠕动均质法、研磨法等。 8. 检样处理： 25+225 做成一个均匀的 1： 10 的 10 倍递增稀释液。 9. 菌落总数的测定：自已画示意图 菌落总数检验程序 水样 做几个适当倍数的稀释度 选择 3个适宜稀释度，各取 1ml加入到灭菌平皿内 每个平皿内加入 45摄氏度左右的适量琼脂 摄氏度 h 菌落计数 4 / 54 报告 10. 大肠菌群的检验 :自已画示意图 大肠杆菌为革兰氏阴性菌 检样的处理初发酵分离培养 (4）证实实验报告：查 MPN表 11. 致病菌的检验：自已画示意图 沙门氏菌的检验：沙门氏菌为革兰氏阴性菌 A.增菌：冻肉、蛋 品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、 鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。B 选择性增菌 C分离 D生化实验 E 血清学检验 金黄色葡萄球菌的检验： 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌 A 检样的处理 B增菌 C分离培养 D 证实实验 心得体会 5 / 54 本次为期一周的实验课，让我更加深入的了解了酸乳中的各种微生物和丰富的微生物的世界。正如我们所知，微生物也有着不同的特征和生活方式，对人类的生活产生着或好或坏的影响。只有当我们能真正的了解这些微生物之后，我们才可以更好地与它们和谐共处。 这次酸乳中微生物检验实验给予了我许许多多的锻炼，从最开始实验课题的选取，实验材料的寻找，小组分工协作完成实验，到最后实验报告的完善，一切都是我们小组共同努力的结果，所以说这次大型实验给我们带来的益处是无法估量的。 当然在这次实验也暴露出了我们很多的问题。实验前我们准备的资料不充分，导致了我们实验开始时就手忙脚乱，实验用的原料比例我们都没能很好的把握。不 过随后经过我们的不懈努力，最终还是比较圆满的完成了任务。实验中我们先对培养基进行了制备，后来我们计量了菌落的总数并加以分析辨别。并对主要的菌种大肠杆菌、霉菌、酵母菌、致病菌，乳酸菌等进行了测定和研究。本次实验我们忙中有乐，十分的开心。 6 / 54 这次实验还增强了我们小组之间配合的默契程度，我们小组分工合作，有条不紊，通过大家共同的努力，我们的实验完成的很快。而且也使我们每个人的动手能力的都得到了较好的锻炼 。实验中其他组做的实验也给予了我们很大的帮助，我们在思路比较阻塞的时候，大家相互帮助，给了我们很多恳切实用的建议。并且在不懂的地方老师也耐心细致的给予了我们指导，使我们受益匪浅。这段实验时光让我觉得大家就是一个完美的大家庭，很好的团结在了一起。可以说这次实验不光对于我自己，对于我们整个班级都是一个很好的契机。让我感觉我们的大家庭变得更加融合，更有凝聚力了。 总的来说我们这次实验是比较成功的，但是 我们在实验中也存在着很多错误并且也走了不少弯路。这给我们的警示是，在科研过程中要秉着严谨认真的态度，在实验前做好周密的计划，预想到各种状况，避免错误的出现。这样才能更好完美的完成各自的任务。 对于这次实验我有一些建议，我觉得实验中应该进行多种产品的对比和比较，在进行活性检验时应当设置空白对照。这样实验会更加严谨，我们分析的数 据也会更准确，而且我觉得还可以放映一些相关的影视资7 / 54 料，让我们更加深入的了解现代食品行业并根据现阶段的发展情况确定实验的主流方向，使实验更接近现实工业生产。我觉得通过这些我们会更有针对性的完成实验，并且有可能发现不同的问题，并给出比较合理的处理手段和实现方式。 最后我还是很感谢这次实验，因为我们获得了这样一次机会，一个可以证明自己能力的机会。我们相信我们能行，相信自己会把实验任务完成的很出色。我希望这样的实验能不断开展下去，让更多的同学了解微生物，了解我们丰富多彩的食品世界。 1 食品微生物检验定义： 应用微生 物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。 2 食品微生物检验的特点： 1.研究对象及范围广 2.涉及学科多样 3.实用性及应用性强 4.采用标准化 3 食品微生物检验的意义： 8 / 54 食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。 首先，它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。 其次，通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施 。 再次，食品微生物检验是以贯彻 “ 预防为主 ” 的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治 上和经济上的重大意义。 总之，食品微生物检验的目的：为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。 4 食品微生物检验的范围： 5 食品微生物检验的指标 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和9 / 54 致病菌。 、菌落总数 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得每 g检样中形成的微生物菌落总数。 、大肠菌群 包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。寄居于人及温血动物肠道内随大便排出体外。大肠菌群数越多，说明食 品受粪便污染的程度越大。 、致病菌 、霉菌及其毒素 有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应检验。 6 食品微生物检验的发展： (一 )致病菌检测阶段 指示菌检测阶段 微生态制剂检测阶段 10 / 54 现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测 7 微生物检验实验室 微生物检验室基本条件 总要求：对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌条件。 基本条件：微生物检验实验室必须具备显微镜工作，微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本条件。 具体要求： 1、光线明亮，但避免阳光直射室内； 2、洁净无菌，地面与四壁平滑，便于清洁和消毒； 3、空气清新，应有防风、防尘设备； 4、要有安全，适宜的电源和充足的水源； 5、具备整洁、稳固、适用的实验台，台面最好有耐酸碱、耐腐蚀的黑胶板； 11 / 54 6、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱柜。 微生物检验室实验守则 在进行微生物检验时要时刻记住：我们实验的许多对象可能是 病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的传播。 检验实验室必须遵守以下守则： 1、包、衣物等勿带入实验室 2、应戴口罩、帽子，换用专用鞋。 3、保持安静、有秩序，禁止饮食、吸烟等。 4、检验前应登记日期、批号，详记检验序号，日期，程序和结果5、室内保持整洁，完毕后清理桌面。 6、无菌室应备有专用开瓶器、金属勺、接种针等，使用前后应灼烧灭菌。 7、无菌室内应备有盛放 3来苏水或 5石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有 75酒精棉球；无菌室每 次使用前后，用紫外灯照射。 8、吸过菌液的吸管，投入上述玻璃筒中，不得放桌上；菌液流洒桌面，用抹布浸沾上述溶液泡在污染部位，半小时后可抹去。若手上沾有活菌，也12 / 54 应在上诉消毒液中浸泡 10 20min，再以肥皂及水洗刷。 9、遇火险，应立即关闭电门、煤气门，如果酒精、乙醚、汽油等着火，切勿用水，应以沙土等灭火。 10、离开前用肥皂将手洗净，脱去工作服、帽、专用鞋。关闭门窗以及水电煤气等开关。 几种意外情况的处理： 皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水和生理盐水洗净后，涂以2碘酒。 灼烧伤：涂以凡士林、 5的鞣酸或 2的苦味酸。 化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用 50g/L碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和；若为强碱腐蚀，也 先用大量清水冲洗后，再用 5醋酸或 5硼酸溶液洗涤中和。若受伤的是眼部，经上述处理后，最后滴入橄榄油或液体石蜡 1 2滴。 使用前准备： 用紫外线杀菌灯进行空气消毒，开灯照射 30min后关灯，间隔 30min 后方可进入室内工作； 13 / 54 霉菌较多时，先用 5石炭酸全面喷洒室内，再用甲醛熏蒸；细菌较多时，可采用甲醛与乳酸交替熏蒸。一般情况下，可酌情间隔一定时间用 2ml/m3 甲醛溶液或 20 ml/m3 丙二醇溶液熏蒸消毒。 无菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。 1、加热熏蒸 2、氧化熏蒸 无菌室无菌程度测定 测定无菌室无菌程度一般采用 平板法： 灭菌的 15ml 营养琼脂培养基盖暴露于无菌室内不同地方，10min后，盖好皿盖。倒置于 37摄氏度培养 24h后，观察菌落情况，统计菌落数。每皿内菌落数不超过 4个，则可认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，灭菌后再检验。 常用仪器 超净工作台是箱式微生物无菌操作 工作台，占地面积小，使用方便。其工作原理是借助箱内鼓风机将外界空气强行通过一组过滤器，净化的无菌空气连续不断地进入操作台面，并14 / 54 且台内设有紫外线杀菌灯，可对环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。 高压蒸汽灭菌锅是应用最广、效果最好的湿热灭菌器，可用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、采样器械等的灭菌。高压蒸汽灭菌锅的种类有手提式、直立式以及横卧式等多种，它们的构造和灭菌 原理基本相同。 高压灭菌锅为一双层金属圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而器内蒸汽压力可升高，其温度也相应增高。高压蒸汽灭菌锅上还装有排气阀、安全阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力表，指示内部温度与压力。 常用玻璃器皿 微生物检验室所用玻璃器皿，通常以中性硬质玻璃制成。硬质玻璃能耐受高热、高压，同时，其中游离碱含量较低，不至于影响基质的酸碱度。 试管，培养皿，三角瓶，刻度吸管，试剂瓶，玻璃缸，玻璃棒，玻璃珠，滴瓶，玻璃漏斗，载玻片、凹玻片及盖玻片，发酵罐，注射器及其大小针头，量杯、量筒。 新玻璃器皿15 / 54 洗涤 新玻璃器皿因含有游离碱，应先在清洁液或 2%盐酸内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。 温度计检查法 用一支 150 的水银温度计，使用前先将其水银柱甩到 0以下，插入灭菌物品内层，按常规灭菌，灭菌完毕后，取出观察，确定是否达到要求的温度 2.灭菌效果检验常用方法 将有芽孢的细菌放在培养皿内，用纱布包好，按常法灭菌。灭菌 后取出培养皿，经培养后若无细菌生长，即表示灭菌效果良好。 玻璃器皿的灭菌 一般常用的玻璃器皿，在洗净晾干后，才能灭菌。试管、三角烧瓶等，在灭菌之前，管口和瓶口塞好棉塞，在干热灭菌器内 160 ， 2h灭菌。培养皿灭菌前，用牛皮纸或废报纸包好，每二对或五对为一包，排列在灭菌箱搁架上进行干热灭菌。吸移管灭菌前，口上塞一小棉球，每支用纸包扎好，或16 / 54 置于金属盒里，放在灭菌器内灭菌。 几个基本概念回顾： 一、灭菌 杀灭物体中或物体上所有微生物的繁殖体和芽孢的过程称为灭菌，即灭菌是杀灭或消灭一定环境中的所有微生物。灭菌的方法分为物理灭菌法和化学灭菌法两大类。 二、消毒 用物理的、 化学的或生物学的方法杀灭病原微生物的过程称为消毒。具有消毒作用的药物称为消毒剂，一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对于细菌芽孢则无杀灭作用。 三、防腐 防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时是防腐剂，在高浓度时则为消毒剂 四、无菌 无菌是不含有活的微生物的意思。防止微生物进入机体或物体的方法叫无菌技术活无菌操作。进行微生物学实验操作时，须严格注意无菌操作。 8 食品微生物检验的一般步骤 17 / 54 9 采样的要求 1、严格遵守样品采集的操作规程。 2、所采样品必须具有代表性。 3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。 4、不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现 场测定必须有二人以上参加 。 10 食品微生物检验的取样方案 国际食品微生物学规范委员会取样方案； 美国 FDA微生物学取样方案； 世界粮农组织取样方案 ;4 其他方案。 一、 ICMSF 方法 根据危害度的分类，将取样方案分成二级法和三级法。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样 方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。 I 类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品； 18 / 54 类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变； 类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。 将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档 在进行详细叙述之前，先解释四个代号： n：系指同一批次产品应采集的样品件数。 c：最大可允许超出 m值的样品数。 m：微生物指标可接受水平的限量值。 M：微生物指标的最高安全限量值。 二级法：设定 取样数 n，指标值 m，允许有 c 个样品其相应微生物指标检验值大于 m值。 二级抽样方案 :自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准 m值，超过 m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过 m值的，来判定该批是否合格。 以生食海产品鱼的副溶血性弧菌为例 ， n=5， c=0， m=100，n=5即抽样 5个， c=0即意味着在该批检样中，不得有超过 m值的检样，此批货物为合格品。如果 c 0 表明该批产品不19 / 54 合格。 三级法：设定取样数 n，指标值 m，附加指标值 M，介于 m与 M 之间的样品数 c。 按照三级采样方案设定的指标，在 n 个样品中，允许全部样品中相 应微生物指标检验值小于或等于 m 值；允许有 c 个样品其相应微生物指标值在 m值和 M 值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于 M值。 例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5， c=3， m=10， M=100，其意义是从一批产品中，取 5 个检样，经检样结果，允许 3个检样的菌数是在 mM值之间，如果有 3 个以上检样的菌数是在 mM 值之间或一个检样菌数超过 M值者，则判定该批产品为不合格品。 11食品微生物检验采样原则 能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装 取样的应按无菌操作进行取样。 12样品的送检要求 20 / 54 1、要快速运送：不要超过 3小时； 2、若路途遥远，可在 15 低温下运送； 3、要注意防污染、防散漏、防变质； 4、要填写检验申请单。 13样品的保留 阴性样品：在发出报告可及时处理； 阳性样品：在发出报告以后 3天才能处理样品； 进口食品的阳性样品：要保留 6 个月才能处理。 微生物检验不进行复检 14 无菌技术 什么是无菌技术 指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 无菌环境 无菌室；无菌柜；超净工作台 1、无菌室 21 / 54 无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间 无菌室的消毒和防污染 每日紫外线照射 . 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸 . 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 2、超净工作台 超净台的使用与保养 : 风速保持在米 /秒 ; 使用前开启紫外灯照射 30分钟以上 ; 让超净台预工作 1015分钟 ; 使用完毕后，用 70%酒精将台面和台内四周擦拭干净 . 无菌操作 1、无菌操作目的： 保证待检物品不被环境中微生物的污染； 22 / 54 防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。 2、进入无菌室前的准备 定期检查无菌环境的空气是否符合规定； 用紫外线灭菌处理 3060 分钟； 检查无菌器材是否完备； 洗手消毒； 手部消毒后，再穿戴无菌工作服。 3、检验操作过程的无菌操作要求 在操作中不应有大幅度或快速的动作； 使用玻璃器皿应轻取轻放。 在正火焰上方操作； 接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； 在接种培养物时，协作应轻、准。 不能用嘴直接吸吹吸管。 23 / 54 带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有 5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 15微生物的接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 常用的接种方法有以下几种： ）划线接种 ）三点接种 ）穿刺接种 ）浇混接种 ）涂布接种 ）液体接种 ）注射接种 ）活体接种 分离纯化方法： .倾注平板法 .涂布平板法 .平板划线法 16菌落形态学 Bacterial Colony Morphology ? 有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙； ? 具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。 ? 没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常 形成较24 / 54 小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等； 17细菌的生化反应检查法 由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生 化反应试验。 1. 在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的 PH 值变化。 2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。 生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养 18-24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为 24 或 48小时。 25 / 54 4、应做必要的对照试验。 5、 提高阳性检出率，至少挑取 2-3 个待检的疑似菌落分别进行试验。 生化试验分类 糖类代谢试验 氨基酸和蛋白质代谢试验 有机酸盐和铵盐代谢试验 酶类试验 18 糖 (醇 )发酵试验 原理 糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自有不同的酶系统，故对糖 (醇 )类的分解能力不尽相同。有的能分解某些糖类，生 成酸又生成气体，有的 虽能分解这些糖类但只能生成酸不能生成气体，有的则根本不能分解。借此特点，可作为鉴定细菌的依据之一。该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊26 / 54 的糖发酵 (降解 )后产酸或产酸产气能力。 方法 (1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等。前二者颜色反应较敏感，但稳定性较差。后二者比较稳定。特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，则以后二者为优。 (2)培养基：液体 糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖 (或三糖 )高层斜面发酵管。 (3)操作：以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌接种到糖 (醇 )发酵培养基中，置温箱内，按各类菌所要求温度 (通常为 37) 经一定时间 (数小时至二周 )培养，然后观察结果。 记录： 产酸不产气，阳性，以 “+” 表示 产酸产气，阳性，以 “”表示 不产酸产气，阴性，以 “ -” 表示 19 甲基红 (MR)试验 原理：某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的 pH 下降27 / 54 至以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的酸类较少，培养基 pH 较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。因此该试验是 检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。 方法 (1)培养基：葡萄糖蛋白胨水 (MR/VP 培养基 )。 (2)试剂：甲基红指示剂。 (3)操作：待检菌 18 24h 纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中； 37 培养 2 3d， 每2ml培养液加 2滴甲基红指示剂，立即观察。 结果 MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色 ()； MR阴性：培养基表面呈黄色 ()； 延迟反应：橙色，应继续孵育到 4 天，并重复试验。 28 / 54 20硫化氢试验 原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成 H2S， H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。 方法与结果 (1)琼脂穿刺法： 培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁 (或醋酸铅 )的半固 体培养基。 操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经 37 24h 培养后，观察结果。 结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。 (2)醋酸铅试纸法： 培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。 操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条， 37 培养 24 48h。 结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。 21 血浆凝固酶试验 原理 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白29 / 54 原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，可用试管法测出。 方法 (1)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结 果，如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性。 (2)试管法：小试管 3 支内各加入 l 4稀释的新鲜人或兔血浆，其中一支加待检菌 18 24h肉汤培养物，另一支加阳性菌株 18 24h肉汤培养物，再一支加肉汤培养基为阴性对照，轻振混匀。 3支试管放 37 水浴中 3 4h，观察结果。 结果 待检菌株管和阳性菌株管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阴性。 21 抗原 定义：抗原 是指进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 ? 完全抗原包括下面两方面的免疫性能： 30 / 54 A 免疫原性指抗原进入体内刺激免疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞特性，具有这种能力的物质称为免疫原； B免疫反应性指抗原能和对应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性，又称为反应原性。 ? 半抗原：有些物质，例如某些真菌毒素，单独存在时只有反应原性而无免疫原性，是非免疫原物质，被称为半 抗原。半抗原必须经过改造后才具有免疫原性。 22抗体 定义：抗体 Ab 是由抗原刺激动物的免疫系统后，由 免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白Ig。通常 Ab 和 Ig 可作为同义词使用。 23抗原抗体反应 概念：即抗原和抗体之间的特异性反应，可以发生在体内，也可以发生在体外，前者可以介导体内毒素中和、杀菌和溶菌等作用，后者在体外进行，是免疫检测技术的基础，但是它们的基本反应特性是相同的。在进行体外免疫学实验时，通常是以存在于血清中的抗体 (也是抗体的主要存在形式 )为材料进 行的，所以体外免疫学反应31 / 54 又称为血清学反应。 原抗体反应的原理 抗体主要由蛋白质构成，是细菌的运动器官，由鞭毛丝、鞭毛钩和基体三部分组成 3 芽孢：某些细菌在一定的生长阶段， 可在细胞内形成一个圆形，椭圆形或圆柱形高度折光、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造，称为芽孢或内生孢子。 4 菌落：在固体培养基的表面或深层由一个活细胞繁殖起来，形成能为肉眼观察到的群体堆积物叫菌落。 5 纯培养：纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而 产生的后代。只有一种微生物的培养物称为纯培养物。 6 放线菌：是一类能形成分枝菌丝和无性孢子的 G+原核微生物，属于真细菌范畴。 7 诞生痕：酵母出芽繁殖时，子细胞与母细胞分离，在子、32 / 54 母细胞壁上都会留下痕迹。在母细胞的细胞壁上出芽并与子细胞分开的位点称出芽痕，子细胞细胞壁上的位点称诞生痕 8 霉菌：为丝状真菌的一个俗称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体，但又不产生大型肉质子实体结构的真菌统称为霉菌。 9匍匐丝 : 某些真菌在固体基质上常形成与基质表面平行、具有延伸功能的菌丝，称匍匐菌丝 10病毒：病毒到宿主的核 DNA上，并且可以随宿主 DNA 的复制而进行同步复制的噬菌体，这类寄主细胞称为溶原细胞。 14细胞受体：病毒的细胞受体亦称病毒受体，系指能被病毒吸附蛋白特异性地识别 ，并与之结合介导病毒进入细胞，启动感染发生的细胞表面组分。 15裂解性周期：从烈性噬菌体吸附至细菌溶解释放出子代噬菌体的过程称为烈性噬菌体的裂解性周期或增殖性周期或溶菌性周期。 16 生长因子：那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。狭义的生长因子：一般仅指维生素。 17化能异养微生物：以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量为能源，合成细胞物质，这类微生物33 / 54 称为化能异养微生物。绝大多数微生物属于这种类型。 18微生物的生长曲线：在培养条件保持稳定时，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，如果已培养时间为横坐标，以单细胞增长数目的对数为纵坐标，就可以作出一条曲线，这条曲线叫生长曲线。 19 生物氧化：物质 在细胞内经过一系列连续的氧化还原反应，逐步分解并释放能量的过程称为生物氧化。 a生物氧化的过程：脱氢、递氢、受氢 b 生物氧化的功能：产能、产还原力 H和小分子中间代谢产物 c生物氧化的类型：发酵、呼吸 20呼吸作用 : 微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物，并释放能量的过程，称为呼吸作用。 21 氧化磷酸化 :物质在生物氧化过程中形成的 NADH 和FADH2，可通过线粒体内膜或细菌细胞膜上的电子传递链将电子传递给氧或其它氧化型物质，这个过程偶联 ATP的合成。这种产生 ATP的方式称为氧化磷酸化。 22 生物固氮 : 生物固氮是指大气中的分子氮通过微生物固34 / 54 氮酶的催化而还原成氨的过程，生物界中只有原核生物才具有 固氮能力。 23 微生物的次级代谢 :指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。这一过程的产物称为次级代谢产物。 24遗传型 : 又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。其实质是遗传物质上所负载的特 定遗传信息 25 表型 : 又称表现型，指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。 26 诱变育种 : 是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 27 完全培养基 (CM): 满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 28基本培养基 (MM): 凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基 29 营养缺陷型 :经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。 35 / 54 30 基因重组 : 凡把两个不 同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。 31 转化 : 受体菌在自然或人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离 DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。 32转导 : 以噬菌体 为媒介，将供体细胞的 DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。 33 衰退 : 由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象 34抗原 : 是一类能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与之相结合发生特异性免疫反应的物质。即具有抗原性的物质。 35 抗体 : 机体受到抗原刺激后，由分化成熟的终末 B细胞 -浆细胞合成、分泌的一类能与 相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 36抗原提呈 : 以能被 T细胞识别的形式展示肽 MHC分子复合体的过程称为抗原提呈，以这种形式展示抗原的细胞称为36 / 54 抗原提呈细胞 37 免疫活性细胞 : 能接受抗原物质刺激而增殖活化，发生特异性免疫应答的淋巴细胞，称为抗原特异性淋巴细胞或免疫活性细胞，主要包括 T淋巴细胞和 B 淋巴细胞。 38干扰素 : 动物机体的细胞或组织培养的细胞，在病毒或其它干扰素诱生剂的作用下由细胞基因组编码而产生的一组低分子量的可溶性蛋白质。 39大肠菌群 : 是一群在 37 ， 24h 能发酵乳糖产酸、产气、好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 (包括：肠杆菌科里面的：埃希氏菌属，柠檬酸杆菌属，克雷伯氏菌属和肠杆菌属。其中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其他三属称为非典型 大肠杆菌。 ) 40 内源性污染 : 凡是作为食品原料的动植物体在生活过程中，由于本身带有的微生物而造成食品的污染称为内源性污染，也称第一次污染 。 41 食品中微生物的消长 : 食品中微生物的种类和数量会随食品所处环境和食品性质的变化而不断地变化。表现为食品中微生物出现的数量增多或减少，即称为食品中微生物的消长。 37 / 54 1、微生物的共同特点有哪些？ ? 繁殖快，易培养 ? 体积微小，分布广泛，结构简单 ? 观察和研究手段特殊 ? 物种多，食谱杂 ? 适应性强，易变异 2、革兰氏染色法的主要步骤和染色原理是什么？ 基本步骤： 涂片固定 结晶紫初染 1min 碘液媒染 1 min 95%乙醇脱色 番红复染 1 2min 结果：革兰氏阳性菌 紫色； 革兰氏阴性菌 红色 意义：将所有的细菌分成 G+、 G-两大类。因此它是分类、鉴定菌种的重要指标。 机理：基于细菌细胞壁在化学组分和结构上的不同。 革兰氏染色原理： 38 / 54 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 . 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因 脱水而孔径缩小，故结晶紫 -碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 G -菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂 量高 ,乙醇将脂溶解 ，缝隙加大，结晶紫 -碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，复染后呈红色。 3、简述细菌原生质体的特点。 39 / 54 a.对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其 破裂； 4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均 b.有的原生质体具有鞭毛，但不能运动，也不被相应噬菌体所感染； c.在适宜条件可生长繁殖、形成菌落，形成芽孢，及恢复成有细胞壁的正常结构。 d.比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原 生质体育种的良好实验材料。 4、简述细菌芽孢的特性。 具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。 含水量低、壁厚而致密，通透性差，不易着色。 新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。 一个芽孢萌发产生一个个体。 5、酵母菌常见的个体形态，繁殖方式有哪些 ？ ? 个体一般以单细胞状态存在 繁殖方式：分无性繁殖和有性繁殖两大类，主要是无性繁殖。 40 / 54 无性繁殖：包括芽殖、裂殖和产生无性孢子 有性繁殖：主要是产生子囊孢子。 假酵母： 只有无性繁殖过程。 真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。 6、霉菌有性孢子繁殖的特点有哪些？ a）霉菌的有性繁殖不如无性繁殖那么经常与普遍，多发生在特定条件下，往往在自然条件下较多，在一般培养基上不常见。 b）有性繁殖方式因菌种不同而异，有的两条营养菌丝就可以直接结合，有的则由特殊的性细胞来相互交配，形成有性孢子。 c）核配后一般立即进行减数分裂，因此菌体染色体数目为单倍，双倍体只限于接合子。 d）霉菌的有性繁殖存在同宗配合和异宗配合两种情况。 e）霉菌的有性孢子包括接合孢子、卵孢子、子囊孢子、担孢子等。 7、病毒的基本特征有哪些？ 41 / 54 1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征 2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸， DNA 或者 RNA。 3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。 分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。 5）个体微小，在电子显微镜下才能看见 6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。 7）在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持 其侵染活力。 8）有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。 8、病毒培养的目的和方法及细胞培养病毒的优点有哪些？ a 病毒培养的目的： 分离和鉴定病毒 制备病毒作为疫苗用 进一步研究病毒的结构、繁殖情况、遗传和对寄主细胞的影响。 b病毒的培养方法 利用活体动物 培养 利用鸡胚培养 42 / 54 利用细胞培养 c 细胞培养病毒的优点 没有隐性感染的危险 没有免疫力 容易选择易感细胞 接种量大 培养条件易于控制 9、营养物质进入微生物细胞的四种方式各有什么特点？ a 单纯扩散特点 物质进入细胞的动力是细胞内外的浓度差 ; 这种运输方式不消耗能量 ; 没有特异性，被运输物质不与膜上物质发生任何反应，自身分子结构也不 发生变化。 b 促进扩散特点 物质运输动力是细胞膜内外的浓度差。 运输过程不消耗能量。 43 / 54 有载体蛋白参与，载体蛋白有特异性。运输葡萄糖的载体只运输葡萄糖。 c 主动运输特点 被运送的物质可逆浓度梯度进入细胞内。 要消耗能量。 有膜载体参加，膜载体发生构型变化，这种变化需要消耗能量。 被运送物质不发生任何变化。 d 基团转位运输特点： 需要磷酸酶系统进行催化 被运输的物质发生化学变化，被磷酸化 需要能量 10、细菌的生长曲线中四个时期各有什么特点 ? 1. 延滞期的特点 :分裂迟缓、代谢活跃 生长速率常数为零； 细胞形态变大或增长，细胞内 DNA 尤其是 rRNA 含量增多，为分裂做准备。许多杆菌可长成丝状，如巨大芽孢杆菌在延滞期末，细胞的平均长度比刚接种时长 6倍；一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大！ 合成代谢旺盛，核糖体、酶类和 ATP合成加速，易产生各种诱导酶； 对外界不良条件如pH、 NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。 在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升 2.对数生长 期的特点 生长速率常数 R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间 代时或原生质增加一倍所需的倍增时间最短； 细胞进行平衡生长，菌体各部分的成分十分均匀。酶系活跃，代谢旺盛； 抗不良环境的能力强。 3.稳定期特点 新繁殖的细菌数44 / 54 与衰老细胞数几乎相等，生长速度趋向于零，总的活菌数达到最高水平 。 细菌代谢物积累达到最高峰。 芽孢杆菌这时开始形成芽孢 这是生产收获时期 4.衰亡期特点 细胞的死亡速度超过了新生速度，群体中活菌总数明显下降； 细胞形态出现异常；革兰氏染色反应出现异常，如阳性变为阴性； 有些菌体细胞因蛋白水解酶活力增强，而发生自溶等。 对于某些微生物的次生代谢产物在这时产生，芽孢细菌，芽孢的释放也在这一时期。 11、缩短延滞期的方法有哪些？如何延长稳定期？ a 缩短延滞期的方法：接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄；加大接种量；用与培养菌种相同组成分的培养基；通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短 b延长稳定期生产上的措施：补充营养物质；移走代谢产物；调节 pH；调节温度；对好氧菌增加通气、搅拌或振荡可延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。 12、原核微生物和真核 微生物基因组各有什么特点？ a 原核微生物基因组特点： 基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 功能相关的结构基因组成操纵子结构； 结构基因的单拷贝及 rRNA 基因的多拷贝； 基因组的重复序列少而短； 45 / 54 个别细菌和古生菌的 rRNA和 tRNA中也发现有内含子或插入序列 b真核微生物的基因组特点 : 具有 典型的真核染色体结构：核小体； 基因组分子量大； 没有明显的操纵子结构； 有外显子和内含子序列，重复序列多； 存在于细胞核内，转录和翻译不偶联。 13、简述基因突变的特点及微生物突变株的表型有哪些？ 自发性 各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理下自发地产生 非对应性 突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。 稀有性 自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在 10-6 10-9 间 独立性 某基因的突变率不受它种基因突变率的影响 可诱变性 自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高。 稳定性 基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。 可逆性 野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种的特点 : 46 / 54 提高 突变率，扩大突变谱 有效地改良个别、单一性状 缩短育种年限 定向变异和有益突变的频率低 15、影响诱变效果的因素有哪些？ 外部环境条件 温度、氧气、 pH、水分都影响诱变效果。 如使用化学诱变剂时， pH影响很大。亚硝基胍必须在酸性或碱性条件下进行诱变，而中性条件诱变效果很差。 使用物理诱变剂，温度会有很大影响。 出发菌株的选择 A：最好是生产中正在使用的菌株； B：采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低的菌株 C：选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株； D：细菌中发现称为增变菌株的变异菌株，更适宜作出发菌株。 47 / 54 诱变剂量 要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，在一定的剂量范围内 ，突变率往往随剂量的增高而提高，但正变较多出现在偏低的剂量中，而负变则较多出现在偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。 因此，在诱变育种工作中，目前大家比较倾向于采用较低的剂量。 出发菌株的生理状态 对数生长期微生物 DNA复制较频繁，容易发生突变。 幼 龄孢子比成熟孢子对诱变剂更敏感。 诱变效应的测定方法 可采用直接法或浓缩法。 直接法是将诱变处理过的细胞接种到固体培养基上，以获得单菌落，然后检测发生变异的情况。 浓缩法通常在变异频率比较低的情况下采用，如抗生素浓缩法。 诱变方法：物理诱变还是化学诱变 优良突变菌株的筛 选方法 16、什么是菌种衰退，简述微生物菌种衰退的表现形式，防止菌种衰退的方法有哪些？ 48 / 54 衰退的含义：由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象 衰退的表现形式 原有的形态不典型 生长速度变慢 代谢产物生产能力下降 致病力下降 抗性下降 衰退的防止方法 控制传代的次数 创造良好培养条件 采用有效的菌种保藏方法 采用不易衰退的细胞进行传代 17、抗原诱导机体免疫应答的特点是什么？ 特异性：其产物与相应的刺激物之间是特异的； 多样性：机体具有的抗原特异性的淋巴细胞数量非常巨 大，可区分大量的决定簇； 记忆性：