斑马鱼的性腺发育.ppt

斑马鱼的性腺发育,精巢的组织学结构和不同发育阶段生殖细胞形态,精巢一对，位于腹腔背部两侧，体积较小，以系膜与体壁相联，左右精巢彼此分开，在尾端合并成一条很短的输精管，和一般鲤科鱼类相同。生殖上皮随着结缔组织向精巢内部延伸，形成许多隔膜，把精巢分成许多不规则的精小叶，从其横切面上可见许多精小叶紧密排列，但没有一定的规律性，精小叶为精巢的实质部分，因其呈管状又可称为精小管。在精小叶内由许多精小囊组成，随着精巢的发育，精小叶内各精小囊间生精细胞发育不同步，而在同一精小囊内生精细胞发育是同步的。精小叶中央为小叶腔，小叶腔在精巢内相互连接成网状，最后通到输精管，精原细胞位于精小叶的边缘处，在分化过程中，当生殖细胞在精小囊内发育成为成熟的精子时，精小囊破裂，成熟的精子释放到小叶腔中，各小叶腔内的精子最后汇集到输精管内并可借助于输精管排出，因此成熟的精子只在小叶腔和输精管内存在。生殖细胞在发生上由外向里可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。,繁殖期，V期精巢,III期精巢；小叶腔明显，初级精母细胞排列多层，比例尺示24m,Sg，精原细胞；Sc，初级精母细胞；Sc，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊,VI期晚期精巢，示精小囊内发育同步的各期生殖细胞，比例尺示24m,Sg，精原细胞；Sc，初级精母细胞；Sc，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊,V期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和精子，比例尺示24m,Sg，精原细胞；Sc，初级精母细胞；Sc，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊,V期中期精巢，示成熟的精子充满整个精小叶，比例尺示24m；,Sg，精原细胞；Sc，初级精母细胞；Sc，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊,期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔内有少量残存的精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生的初级精母细胞.,Sg，精原细胞；Sc，初级精母细胞；Sc，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊,卵巢的组织学结构和不同发育阶段生殖细胞形态,斑马鱼卵巢一对，左右两叶，大部分对称；成熟卵巢呈囊状，位于体腔内，外被由平滑肌和结缔组织形成的卵巢膜，卵巢膜不发达。卵巢位于腹中线两侧，在鱼体后端汇合成一短的输卵管，进入泄殖腔，由泄殖腔开口于体外。卵母细胞直径、核径和核质比在不同时相中的变化:,卵母细胞在时相增长不明显，在、时相期增长迅速胞核的直径在时相增长迅速，在时相中期、时相增长缓慢，几乎没有变化核质比在第时相最大，随着卵母细胞的发育，核质比越来越小,卵巢壁:由两层被膜构成，外层为腹膜，内层为白膜。白膜由外到内依次为扁平上皮细胞、疏松结缔组织、间质组织和生殖上皮。产卵板:白膜中的结缔组织向卵巢内部伸展与卵巢生殖上皮共同构成板层状结构，称产卵板，是卵子产生的地方。卵巢腔:存在于卵巢内部的空腔，与输卵管相通。,SB产卵板,不同龄雌鱼卵巢发育,016日龄:没有观察到性腺发育情况。1722日龄:原始生殖细胞没有两性分化，数量开始增多，并逐渐聚集成团，细胞质嗜酸性，核较大，嗜碱性，有一明显核仁。27日龄:原始生殖细胞分化为卵原细胞，体积变大，数量增多，成排排列，在腹腔后背部分布，与肝胰脏相连。3257日龄:卵巢体积较小，位于腹腔后背部，靠近肝胰脏。卵巢内主要为第时相卵母细胞，细胞体积小，圆形，细胞质少，有一明显细胞核。核中部有12个核仁，核内染色质细丝状。62日龄:主要为第时相卵母细胞，细胞为多角形、圆形。细胞质较多，染色较深，为淡紫红色。核相应增大，弱嗜酸性，核仁数个，靠近核膜内侧分布。卵母细胞外面有一层滤泡细胞。6772日龄:卵巢粗短，主要存在第时相和发育早期的第时相卵母细胞。早期第时相卵母细胞比第时相卵母细胞体积大，圆形或椭圆形，染色较浅，核周细胞质内出现少量空泡。细胞核较大，弱嗜酸性，核仁多个，分布在核膜内缘，被染成深蓝色。卵母细胞外周辐射带很薄，结构不明显，细胞外隐约能看到两层滤泡膜。,77日龄:以第、时相卵母细胞为主，大部分第时相卵母细胞处于发育中期。中期第时相卵母细胞近圆形，体积明显增大。胞质的空泡内出现了嗜酸性的卵黄颗粒，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。卵核体积增大，染色较浅，核仁多个，分布在核膜内缘。随卵母细胞的发育，核仁逐渐向核中央移动，呈深蓝色。细胞周围辐射带明显，并随着细胞体积的增大而增厚，细胞外两层滤泡膜发育明显。8290日龄:以第、第时相卵母细胞为主。晚期第时相卵母细胞体积较大，空泡内充满卵黄。第时相卵母细胞由于卵黄物质不断积累，细胞体积继续增大，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质。细胞核逐渐由中央向动物极移动。卵巢壁随卵母细胞的数量增多和体积增加而逐渐变薄，放射带明显增厚。成熟小鱼:卵巢白膜变得很薄。卵巢以第时相卵母细胞为主，也存在有发育早期的卵母细胞。第时相卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵黄颗粒相互融合，细胞质中充满粗大的卵黄颗粒，散布于整个卵母细胞的胞质内。至此，卵母细胞发育成熟，不久，核膜崩解、消失，卵母细胞进入第2次成熟分裂中期，形成次级卵母细胞，排到卵巢腔。产卵后小鱼:卵巢细长，结构松散，包含有排卵后的空滤泡、第时相、第时相和第时相卵母细胞。,繁殖期，IV期卵巢,期：初级生长期(primarygrowthstage)，卵母细胞(卵泡)体积小(7140m)，卵母细胞开始生长。期：皮质泡时期(corticalalveolusstage)，卵泡直径140340m。卵母细胞体积进一步增大，卵母细胞外周的皮质区出现许多小泡。期：卵黄增生期(vitellogenesisstage)，卵泡直径340690m。卵母细胞体积增加很快，卵黄颗粒物质快速积累，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。期：卵母细胞成熟期(oocytematurationstage)，卵泡直径690730m。由于卵黄颗粒数量和体积的增长，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞的细胞质。期：成熟卵期(matureeggstage)，卵泡直径730750m。卵母细胞成熟，细胞内充满了粗大的卵黄颗粒。,1时相卵母细胞(皮层滤泡期或卵黄生成前期),主要是处在小生长期的卵母细胞。卵母细胞直径在约为54.5694.24m，核径约为29.7659.52m，核质比约为：0.110.42。核形不规则，呈圆形、椭圆形或多角形，细胞质嗜碱性，H.E染色呈深紫色，核浅蓝色，位于细胞中央。在同一切面上核内有3-10个核仁，沿核膜内缘分布。根据卵径大小和结构形态的不同，这个时相又可以分为三个阶段；在早期，卵母细胞形态仍然不规则，形状多变；在发育中期，卵母细胞呈近圆球形；发育晚期，卵母细胞内生长环迅速扩大。滤泡膜仅一层。,时相卵母细胞(卵黄生成期),主要是处在大生长期早期的初级卵母细胞。第3时相卵母细胞比第2时相卵母细胞大，但染色要浅。卵母细胞呈圆球形，该时相卵母细胞开始出现液泡，内含物被H.E染成淡红色。滤泡膜上皮细胞开始分裂，并与卵母细胞的质膜分离，出现不明显的放射带。根据卵母细胞的大小、卵黄沉积的多少以及放射膜的有无将其分为早、中、晚三个时期。,时相早期,卵母细胞直径在约为97.3155.68m之间，核径约为38.9268.11m，核质比约为：0.020.14。胞质弱嗜碱性。核质嗜酸性，核仁位于核膜内缘，主要为小核仁，35个左右。细胞质外缘出现少许小液泡，直径12m，较透明，内含物极少。卵母细胞外周的放射带很薄，结构不明显。此时已经形成两层膜结构。,时相中期,卵母细胞明显增大，卵母细胞直径在约为124198.4m，胞核约49.6119.04m，核质比为0.030.36。核质被染成浅紫色，大核仁少见，小核仁约40个左右，其中较大的分布于核膜内侧，较小的散在于核质中。放射带发育明显。内层膜的细胞呈立方形，而外层的仍为扁平形。,时相晚期,卵母细胞增大为145.95330.82m，核径为48.6558.38m，核质比0.0060.06。液泡充满卵黄，放射带的外周形成均染粉红色的胶质膜结构，小核仁45个左右，多位于核膜内侧周边。,IV时相卵母细胞(卵母细胞成熟期),主要是处在大生长期晚期的初级卵母细胞。由于卵黄物质不断积累，卵母细胞细胞体积继续增大、卵黄迅速积累、液泡被积压到卵母细胞周边的细胞质中，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质，卵母细胞直径在约为379.47447.58m，胞核约38.9268.11m，核质比为0.00070.004，细胞质及细胞核开始由中央直接移向动物极移动，卵母细胞开始表现出极性。放射带明显增厚。,V时相卵母细胞(成熟卵期),卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵径约为467.04564.34m。卵黄颗粒相互融合，细胞质中充满粗大的卵黄颗粒，卵黄颗粒散布于整个卵母细胞的胞质内，至此，卵母细胞已经成熟，以后便脱离滤泡膜而排入卵巢腔。,2.2.2.5VI时相卵母细胞,卵细胞排出，剩余的空滤泡膜，形状不规则，蜷曲于卵巢内。,斑马鱼的繁殖,斑马鱼为研究脊椎动物胚胎发育的理想模式生物,子代数多可以光周期诱发产卵体外受精，胚体透明，胚胎发育快可以诱发产生突变种可以分子生物技术控制特定基因表现或产生基因转殖鱼在胚胎发育时期的讯号传递路径和哺乳动物有很高的同源性,分辨斑马鱼雌雄,公鱼：与性成熟前体态相似，保持原本的流线型，臀鳍较母鱼长。在身上各个鱼鳍末端，时常可看到有明显的黄色出现。母鱼：性成熟后肚子开始膨大，里面卵囊形成卵，臀鳍较公鱼来得小、短且较圆，鱼鳍末端有时也有黄色出现，但相对于公鱼出现的时间比较少。,步骤一、布置环境,光周期调控：斑马鱼需要在约14:10光照周期下，才会产生交配产卵的行为。水温：需在2428.5。在适当的水温下，将公鱼和母鱼分缸进行饲养约5-7天后，即可在光周期天亮后1小时内，看到斑马鱼进行交配行为。,步骤二、交配前准备,产卵前一天的准备：挑选出适当的公鱼跟母鱼，体长要尽量一样，母鱼可以略大一些。将公鱼与母鱼分别放置产卵缸的两侧，中间设置隔板将其隔开。产卵房的准备,放入隔板及斑馬魚,上盒與普通下盒組裝,上盒底以網狀材料代替,产卵房的准备,避免刚产出的鱼卵被成鱼吃掉，而有的特殊设计！,1,2,3,4,步骤三、交配当天,光周期控制的隔天清晨，当天亮后约十分钟，公鱼和母鱼会恢复清醒。当母鱼发现公鱼时，由于前一天的费洛蒙影响，母鱼在天亮后也释放另一种费洛蒙，使公鱼往母鱼方向前去的行为更加明显及强烈。此时就可以准备打开隔板，让公鱼跟母鱼进行交配。,交配中,公鱼在交配的过程中，采绝对主动方式，会先以眼睛观察并决定要向哪一只母鱼进行攻势。其次会进行求偶舞蹈，在想要交配的母鱼周围绕圈圈或是字型，游向母鱼后，利用腹部侧面摩擦母鱼，刺激母鱼排卵，公鱼便会同时射精。,产卵,母鱼会一次把全部腹中的卵包括卵囊全部排出，一胎约会生出200-500颗卵。排出后母鱼会重新产生新的卵，约3-5天就可以再生下一次卵。伴随着卵的释放，会有其他激素一起排出，这种激素可以让母鱼顺利把卵排放出来，另外一个功能则是让其他还产生卵的母鱼，停止排卵的行为，这在演化上算是一种竞争的结果。,注意事项（1）,母鱼体内的卵，如果太长时间没有交配，或是没有完全排完，卵会留在体内，并不会重新被吸收回去，如果超过太久没有排卵，母鱼腹部中的卵会死亡，并且造成母鱼腹部类似囊肿的残留物，这种囊肿会让母鱼下次排卵不顺，甚至无法排卵而被公鱼激烈的追求之后而难产死亡，目前也没有较好的方式改善这种情况。一般认为，固定一段时间就让公鱼跟母鱼进行交配，让母鱼把卵排出，是较好的方式。,注意事项（2）,斑马鱼的卵在受精后，约72小时即可孵化，在这段期间内，不需要给予打气，只要放在干净的水中即可孵化。放在解剖显微镜下，即可清楚的看到斑马鱼胚胎发育的整个经过。,人工受精,将鱼放入冰水中，直至不太活动为止。记录鱼的体长、体重雌鱼：轻压腹部，卵子流出。收集到小培养皿中。雄鱼：同雌鱼。加1mlD-hanks液稀释。将稀释精子加入卵子中。,斑马鱼卵巢的获得,发育成熟且腹部膨大的雌性斑马鱼体表用75酒精消毒，用眼科剪小心剪开腹部后，迅速用眼科镊取白色半透明的两侧卵巢置于已除菌的清洗液D-Hank溶液中,卵细胞的分离,用D-Hanks溶液洗去卵巢周围附带的脂肪、结缔组织及血块等杂质。将部分卵巢置于一装有新鲜D-Hanks溶液的培养皿中，用眼科镊小心撕开卵巢外膜并轻轻抖动，同时用另一眼科镊将卵细胞从结缔组织中剥离。此种卵母细胞外被滤泡膜。当卵细胞基本从卵巢中分散出来后，选出滤泡膜完整的卵母细胞，用移液管轻轻吹打卵细胞5-10次至卵细胞单个分离。用D-HankS溶液洗涤分离好的卵细胞2-3次。,卵细胞培养,取20-30个卵细胞于直径35mm无菌培养皿中，加人3ml培养液，封口，于培养箱内27、饱和湿度条件下成熟培养18h。卵细胞直径0.65mm或以上培养液为90%LeibovitzL-15，pH9培养液中添加定量FSH（0、0.1、0.5、1、2、5g/ml）,成熟判定,卵母细胞的成熟是一个包括细胞核、细胞质、细胞膜、透明带等多方面在内的复杂生物学过程。在形态上表现为生发泡破裂，核仁消失，纺锤体形成，染色质浓缩为染色体，第一极体的排出，卵丘、颗粒细胞的扩散、膨胀和透明带的软化等。本试验以生发泡破裂即细胞核的消失判定卵细胞成熟。在添加TB（终浓度0.2%）的培养液中25度10分钟染色后观察。将培养后的卵细胞置于透明液(clearingsolution)中固定，在倒置显微镜下观察。无细胞核的卵细胞既是已发生生发泡破裂(GVBD)的成熟卵细胞。,卵母细胞的完整性观察,解剖镜下对用两种方法获得的斑马鱼卵母细胞进行形态学观察,细胞存活率的测定,取同一条鱼的两侧卵巢，解剖镜下，对培养前和18小时培养后的成活卵细胞进行计数，以其与培养的的细胞总数之比作为存活率。,细胞成熟率的测定,取同一条鱼的两侧卵巢，随机选出5个细胞用固定液固定，解剖镜下检测，若成熟细胞1个，即所获卵母细胞处于第期，则将分离得到的此批卵细胞分装培养。18小时后，将卵母细胞固定后在解剖镜下观察，根据细胞核有无计数成熟卵母细胞个数，以其与卵母细胞总数之比作为成熟率(GVBD)。,细胞生长曲线绘制,将分离得到的卵母细胞培养于无菌培养L中，从0d时起，每隔两小时从培养皿中取一定数目的卵母细胞，用固定液固定后，解剖镜下检测，根据细胞核的有无判断卵母细胞成熟，分别计数细胞总数和成熟卵母细胞数。以培养时间为横坐标，卵母细胞成熟率(GVBD)为纵坐标，绘制生长曲线。,成熟卵的受精,卵母细胞在发生GVBD后每隔0.5h取数粒卵子，置Hanks液内，用两把尖镊小心剥去滤泡膜，并移入冷开水中，取精子加到卵子旁使二者混合，此时作为受精开始时间。3mim后将卵取出放在Holtfreter液中，于25继续培养。定期观察受精卵的发育并作照相记录。以发育到囊胚为受精标志，统计受精率。,Holt缓冲液,NaCl3.5g/LKCl0.05g/LCaCl20.1g/LNaHCO30.025g/L,清洗液D-Hank溶液(加入100unit/mL青霉素和链霉素)培养液:90%LeibovitzL-15(加入100unit/mL青霉素和链霉素)透明液(clearingsolution):酒精(6):乙酸(1):多聚甲醛（3）,LeibovitzsMedium,specificallydesignedtogrowcellsinaCO2freeatmosphere.Thestandardsodiumbicarbonate/CO2bufferingsystemisreplacedbycombinationoffreebasicaminoacids,phosphatebuffersandhigherlevelsofgalactoseandsodiumpyruvate.Asaresult,themediumdoesnotrequiresupplementationwithsodiumbicarbonateandcanbeusedunderconditionsoffreegaseousexchangewiththeatmosphere.ThemediumcanbeusedtogrowhumantumorcellsandembryoniccellsandalsoestablishedcelllineslikeHeLaandHep-2.Themediumisfrequentlyusedindiagnosticvirologywheretissuecelllinesorstrainsneedtobegrowninclosedsystems.Leibovitzsmediumobviatestheneedoffrequentmediumchange.,Composition:,Ingredientsmg/LINORGANICSALTSCalciumchloridedihydrate185.000Magnesiumchloridehexahydrate200.000Magnesiumsulphateanhydrous97.720Potassiumchloride400.000Potassiumphosphate,monobasic60.000Sodiumchloride8000.000Sodiumphosphate,dibasicanhydrous190.120AMINOACIDSDL-Alphaalanine450.000Glycine200.000L-Arginine(freebase)500.000L-Asparagine250.000L-Cysteine(freebase)120.000L-Glutamine300.000L-Histidine(freebase)250.000L-Isoleucine250.000L-Leucine125.000L-Lysinehydrochloride94.000L-Methionine75.000L-Phenylalanine125.000L-Serine200.000L-Threonine300.000L-Tryptophan20.000L-TyrosineDisodiumSalt276.160L-Valine100.000,VITAMINSCholinechlo