毕业论文-饮用水不同消毒技术的遗传毒性比较研究.doc

饮用水不同消毒技术的遗传毒性比较研究清华大学 环境科学与工程系 给排水科学与工程专业摘要:随着水源水水质的日趋恶化，水体中有机物种类日趋复杂，消毒后产生的更多的副产物，毒理学风险也越来越大。为比较常用饮用水消毒方法的毒理学风险和副产物生成潜力，本研究从遗传毒性和卤乙酸（HAAs）生成量两个角度对氯消毒、氯胺消毒、紫外线消毒、紫外线+氯消毒、紫外线+氯胺消毒和氯转氯胺消毒6种不同消毒方法进行了评价。本研究采用umu试验法评价饮用水遗传毒性。umu测试法和经典的Ames测试法相比较，发现两种毒性测试系统检测的经氯和氯胺消毒后水源水的遗传毒性变化规律相一致。以深度工艺处理出水（臭氧活性炭出水）为研究水样，用umu测试法研究发现，单独紫外线消毒遗传毒性与紫外线剂量成正相关，氯消毒遗传毒性较大，氯胺消毒遗传毒性较小且随剂量变化不大。氯转氯胺消毒的遗传毒性介于氯消毒和氯胺消毒之间。紫外线的引入（剂量40mJ/cm2）使高剂量的氯消毒（有效氯大于约2mg/L）的遗传毒性有明显增加；对于氯胺消毒，紫外线的引入对遗传毒性影响不大。饮用水经消毒后，HAAs生成量与遗传毒性没有明显相关性。6种消毒工艺的卤乙酸生成量主要由加氯量决定，加氯量越多，生成的卤乙酸越多，说明卤乙酸主要是氯消毒的产物。关键词：饮用水；消毒；遗传毒性；umu试验；卤乙酸ABSTRACTWith the deterioration of the quality of source water, species of organic matters in water are becoming complex, more DBPs (disinfection by-products) are generated and there is increasing toxicological risk. For the purpose of comparing practical drinking water disinfection processes from the aspects of toxicological risk and the capability of producing DBPs, this study evaluated six disinfection methods (chlorination, chlorimination, disinfection by UV, UV+chlorination, UV+chlorimination, sequential chlorination) from the perspective of genotoxicity and output of HAAs (haloacetic acids).This study evaluated genotoxicity of drinking water using umu test. Comparing umu test and classic Ames test, this study verified the consistency of umu test and classic Ames test using source water after chlorination or chlorimination as water samples. Using affluent after advanced treatment (ozone/activated carbon) as water samples, this study found that, the genotoxicity of drinking water after disinfection by UV light was in positive correlation with UV dose; the genotoxicity of chlorination was the highest; genotoxicity of water after chloramination was less and changed very little with the raise of the dose of disinfectant. The genotoxicity of water after sequential chlorination was between chlorination and chlorimination. UV disinfection (40mJ/cm2) increased the genotoxicity of chlorination with high chlorine dose (available chlorine more than 2mg/L) markedly; in regard to chlorination process, UV disinfection has weak effect on genotoxicity.There was no obvious relativity between HAAs and genotoxity of water after disinfection. The production of HAAs of six kinds of disinfection processes was mainly decided by chlorine dosage. The more the chlorine dosage was, the more HAAs would be generated. It means that HAAs is mainly generated by chlorination.Key words：drinking water; disinfection; genotoxicity; umu test; HAAs目录第1章 引言11.1 研究背景与意义11.1.1 饮用水的安全性11.1.2 饮用水消毒工艺21.1.3 消毒副产物与遗传毒性21.1.4 研究目的与意义31.2 国内外研究现状31.2.1 常见消毒方法产生的副产物及其生物毒性31.2.2 饮用水有机污染物的遗传毒性研究51.2.3 遗传毒理短期测试方法介绍121.2.4 课题组关于饮用水消毒遗传毒性的前续研究201.3 实验方案与技术路线221.3.1 不同消毒工艺遗传毒性的比较221.3.2 umu试验与Ames试验的比较231.3.3 技术路线24第2章 试验材料和方法252.1 水样的采集和前处理252.1.1 试验试剂252.1.2 水样的采集和前处理252.2 umu遗传毒性测试方法262.2.1 试验材料和仪器262.2.2 umu试验方法272.2.3 umu试验结果的计算和表达292.2.4 基于umu遗传毒性效应的致癌风险评价方法302.3 卤乙酸分析方法312.3.1 试验材料和仪器312.3.2 试验方法31第3章 实验结果和讨论333.1 umu试验与Ames试验的比较333.2 三种单独消毒工艺对饮用水遗传毒性的影响373.2.1 单独紫外线消毒对饮用水遗传毒性的影响373.2.2 单独氯消毒对饮用水遗传毒性的影响373.2.3 单独氯胺消毒对饮用水遗传毒性的影响383.2.4 三种单独消毒工艺遗传毒性的比较393.3 三种组合消毒工艺对饮用水遗传毒性的影响403.3.1 紫外线+氯组合消毒工艺对饮用水遗传毒性的影响403.3.2 紫外线+氯胺组合消毒工艺对饮用水的遗传毒性的影响413.3.3 氯转氯胺组合消毒工艺对饮用水的遗传毒性的影响433.4 不同消毒工艺对饮用水的HAAs生成量的影响45第4章 结论与建议494.1 总结494.2 建议50插图索引51表格索引53参考文献54致 谢59声 明61附录A 书面翻译6360第1章 引言1.1 研究背景与意义1.1.1 饮用水的安全性饮用水的水质安全性主要分为生物安全性和毒理学安全性。饮用水生物安全性是人体健康所考虑的最首要因素。饮用水净化技术最早始于饮用水生物安全性问题，因为这一问题长期威胁着人类的生命和健康。人类在与水源污染及由此引起的疾病所做的长期斗争中发展和完善了最早的饮用水处理工艺，如过滤工艺和消毒技术。20世纪初，比利时开始对饮用水进行连续氯化处理，在使用氯消毒的地方，伤寒病死亡率大幅度下降。近年来多次爆发的大规模水介传染疾病的危害使人们进一步关注饮用水的生物安全性问题。另一个饮用水安全性指标是饮用水毒理学安全性。水中污染物多数是有机物，随着工业污染的加剧，有机污染物种类也在不断增加。随着流行病学研究和微量有机物富集、检测技术的发展和改善，有毒有害物质也不断被发现和检出，其中很多有机物对人体健康具有较大危害。同时，饮用水净化工艺本身也可能对饮用水的毒理学安全性造成负面影响。例如，加氯消毒过程中产生氯化消毒副产物（DBPs），包括三卤甲烷（THMs）和卤乙酸（HAAs），会增加饮用水的致癌、致突变性，对人体健康有长期的影响。目前关注较多的微量有机污染物，如内分泌干扰物、藻类代谢产物（如藻毒素）等都影响了饮用水的毒理学安全性。在美国国家环保局制定的129种环境优先检测污染物中，有毒有机化学物品就占114种；在我国制定的68种环境优先检测污染物中，有毒有机化学品占58种。2006年颁布并于2007年7月1日正式实施的生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）中有毒化学品的检测指标为74项，比之前增加了59项。由此看来，饮用水消毒在降低了饮用水微生物风险、提高了饮用水微生物安全性的同时，由于消毒剂本身及其生成的消毒副产物而提高了用水的化学物风险、降低了饮用水毒理学安全性。饮用水的安全消毒应在首先保证饮用水微生物安全性的前提下，尽可能地减少有害消毒副产物的生成量以保证饮用水的毒理学安全性，这种相互制约的需求推动着人们对理想消毒剂的不断开发1。1.1.2 饮用水消毒工艺饮用水消毒方法大体可分为物理消毒方法和化学消毒方法两类。化学消毒方法中有关氯、氯胺、臭氧以及二氧化氯的研究及应用最多，物理消毒方法中较为常用的是紫外线消毒。加氯消毒由于使用简单、价格便宜等优点，是目前最成熟且应用最广泛的消毒技术，美国自来水厂中约有94.5%采用氯消毒，中国据估计99.5%以上自来水厂采用氯消毒。但氯消毒也有明显的弊端，如会产生较多的消毒副产物，对隐孢子虫和贾第虫灭活作用不明显等。氯胺消毒是对氯消毒的改进，消毒原理与氯消毒相同，但采用能缓慢释放HClO的氯胺，可以延长消毒时间。氯胺消毒虽然可以缓解消毒副产物的产生，但不能避免，而且同样对隐孢子虫和贾第虫的灭活较差，因此新型化学消毒技术臭氯、二氧化氯等，先后被应用到实际饮用水的消毒处理中。产生消毒副产物是化学消毒法最主要的问题，氯消毒，氯胺消毒和二氧化氯消毒都会产生特定的消毒副产物，臭氧消毒则产生较少。随着近年来有关化学消毒副产物的报道的增多和人们对水质标准要求的不断提高，物理消毒方法特别是紫外线消毒引起了专业人士的高度重视。紫外线消毒几乎不会产生消毒副产物，但它没有持续消毒效果，通常仍需与化学消毒法配合使用。1.1.3 消毒副产物与遗传毒性大量的研究和应用实践证明，几乎每种消毒剂在消毒的同时都会与水中的某些特定污染物相互反应，从而产生一定的消毒副产物，虽然它们的含量一般极低（仅为g/L量级）；但它们当中有不少是属于致癌、致畸、致突变的“三致”物质，进而直接地危害人体健康，这就提出了饮用水消毒的毒理学安全性问题。由于饮用水消毒副产物种类繁多，而能够测定的消毒副产物种类非常有限，仅考察消毒副产物的生成量具有一定的局限性，又由于人们更为关注消毒副产物所表现出的综合生物毒性效应，因此考察饮用水消毒后的生物毒性显得尤为重要。对于饮用水消毒后的生物毒性检测，目前国际上主要以遗传毒理学检测为主，其中又以遗传毒性作为主要检测指标2。所谓遗传毒性，是一种破坏细胞遗传物质完整性的毒性行为，遗传毒性物质包括潜在的致癌物和致突变物，可导致基因突变或肿瘤的形成。广义的遗传毒性物质既包括特定的毒性物质，还可指特定类型的辐射，但饮用水领域通常是指前者，主要是消毒副产物。目前遗传毒理学短期生物测试方法主要有Ames实验、微核实验、彗星试验和umu试验等3。遗传毒理短测方法虽不能直接用于评价饮用水中诱变物对人遗传毒性的危险性，但它在饮用水质的检测及其它方面有着重要的实用价值。1.1.4 研究目的与意义综上所述，由于不同消毒方式其各自的特点，实际应用中要根据原水水质、经济条件等因素具体分析，而且饮用水水质标准越来越严格，人们对饮用水水质的要求也越来越高，因此，深入比较几种不同消毒方式的差异十分必要。而随着工业污染的不断加剧，水源水中有机物种类及浓度不断增加，消毒副产物等具有诱变性物质的化学安全性问题亟待解决。所以，比较评价各种消毒工艺的遗传毒性风险，则十分具有现实意义。1.2 国内外研究现状1.2.1 常见消毒方法产生的副产物及其生物毒性消毒方法的选择通常需要考虑以下4个方面的因素4：（1）杀灭病原微生物的效率和持久力；（2）经济和技术上的可行性；（3）工程实践中控制和监测的难易程度；（4）对人和生态环境的潜在危害性。目前我国常见的消毒方法包括氯消毒、臭氧消毒、二氧化氯消毒、氯胺消毒和紫外消毒等。其中前4种方法在用于饮用水消毒时产生的副产物类型及其生物毒性如表1-1和表1-2所示。一般认为紫外线消毒生成的副产物很少，但由于其消毒效果受水中悬浮物含量影响较大，无消毒余量，且存在微生物的复活等问题，因此使其应用受到一定的限制5。表1. 1 不同消毒方法产生的副产物类型6副产物类型代表物质氯臭氧二氧化氯氯胺三卤甲烷三氯甲烷+a+b+其它卤代烃+卤代烯烃+卤乙酸氯乙酸+卤代芳香酸+其它卤代一元羧酸+不饱和卤代羧酸+卤代二元羧酸+卤代三元羧酸+续表1.1 不同消毒方法产生的副产物类型6副产物类型代表物质氯臭氧二氧化氯氯胺MXc及其相似物+其它卤代呋喃酮+卤代酮+卤乙腈氯乙腈+其它卤代腈氯化腈+卤代醛水合三氯乙醛+卤代醇+卤代酚2-氯酚+卤代硝基甲烷三氯硝基甲烷+无机物溴酸盐、次溴酸盐、亚氯酸盐、氯酸盐等+脂肪醛甲醛+其它醛类+脂肪酮及芳香酮丙酮+羧酸乙酸+芳香酸苯甲酸+醛酸、酮酸+羟酸+其它+a一般指氯代和溴代的4种THMs，如果碘代的也包括在内，则共有9种THMs；b当溴离子存在时形成； c3-氯-4二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮。表1. 2 典型消毒副产物的生物毒性6副产物类型代表物质毒性等级a危害三卤甲烷三氯甲烷B2致癌，损伤肝肾，影响生殖二溴一氯甲烷C损伤神经系统/、肝肾，影响生殖一溴二氯甲烷B2致癌，损伤肝肾，影响生殖三溴甲烷B2致癌，损伤肝肾，影响生殖卤乙腈（HAN）三氯乙腈C致癌，致突变卤代醛和卤代酮甲醛B1致突变b卤代酚2-氯酚D致癌，促进肿瘤卤乙酸（HAAs）二氯乙酸B2致癌，影响生殖和发育三氯乙酸C损伤肝肾脾，影响发育无机物溴酸盐B2致癌亚氯酸盐D影响生殖和发育a A：对人类致癌，B1：对人类很可能致癌（有一定的流行病学数据），B2：对人类很可能致癌（充足的实验数据证明），C：对人类可能致癌，D：未分类；b吸入暴露从表1.1和表1.2中可以发现，在氯、臭氧、二氧化氯、氯胺等4种消毒方式中，氯消毒是副产物生成最多的一种消毒方法，但由于氯消毒有持续的消毒效果，费用较低，操作简便，不需要庞大的设备等优点，因此是饮用水处理中最常用的消毒方法。此外，臭氧、二氧化氯和氯胺消毒虽然在控制副产物方面各有优势，但也有可能引入氯消毒副产物之外的其它副产物7。1.2.2 饮用水有机污染物的遗传毒性研究自70年代初国外学者首次检出饮水致突变性，并发现氯化消毒能使饮用水的致突变性增强后，饮用水的安全性问题引起世界各国的高度重视。近些年，对于水遗传毒性的关注主要集中以下几个方面：对水经氯或其他物质消毒后遗传毒性活性的评价；对水中致突变物质的调查；在水处理过程中，水中致突变前体物向致突变物转变的研究。本部分将从以上几个方面对饮用水的遗传毒性研究做一简单综述。1.2.2.1 消毒对饮用水遗传毒性的影响上述有关消毒副产物的研究尽管在保障饮用水的水质安全方面起到了积极作用，但仍无法摆脱其固有的局限性。首先，目前能够测定的消毒副产物种类不多。由于分析手段还不够完善，即使是研究较多的饮用水氯消毒，也只有约50%的副产物得以识别8（见图1.1），其它消毒方式则更少，如饮用水氯胺消毒，17%的副产物得以识别，饮用水二氧化氯消毒，28%的副产物得以识别，臭氧消毒8%的副产物得以识别。图1. 1 氯化消毒副产物组成其次，大部分关于消毒副产物风险的研究，是基于实验室进行的毒理学研究来判断的。在这类研究中，产生毒性效应的剂量水平一般在mg/L量级，但饮用水中检测到的消毒副产物浓度往往在g/L量级甚至更低。而且大部分研究都是针对单一物质，而饮用水中存在多种消毒副产物，他们之间往往具有一定的加成、协同、拮抗效应等。所以依据单一消毒副产物的毒理学研究结果，难以准确判定多种消毒副产物在饮用水中产生的毒性效应。总之，饮用水消毒带来的水质安全风险是由种类多、浓度低的消毒副产物共同产生的，不能单单以某些副产物的生成量来判定。在这种情况下，研究者转向了用遗传毒性测试来评价消毒后饮用水的水质安全风险。与消毒副产物相比，遗传毒性测试能够更直接、全面的表征饮用水消毒的安全性9。饮水的遗传毒性，是水中各种遗传毒物综合作用和反应的结果，除一部分来源于水源水污染外，消毒工艺产生的副产物也是主要来源。（1）氯消毒的影响至今，已有许多试验证明经氯化消毒后的水具有遗传毒性或致突变性。1974年，Rook和 Bellar10发现饮用水中含有卤代甲烷类物质，进而推动了人们对饮用水处理工程中氯化副产物的检测。由于氯仿已被证明能诱导小鼠肝细胞癌变和大鼠肾部出现肿瘤，因此，卤代甲烷类物质引起了高度重视。另外一些物质也被认为是氯化消毒过程的副产物，如氯丁二烯、卤乙腈、酮类卤代物等，Bull 等11已对这些物质的致突变性和致癌性作了详细阐述。鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)是最为常用的致突变检测方法。多项研究结果显示，氯化消毒副产物的Ames试验呈阳性。Sujbert等12对氯化消毒前后的饮水有机浓集物的致突变性进行Ames试验检测，结果显示消毒后的饮水有机浓集物的诱变活性(0.832.51)比消毒前(0.280.83)明显增高。Umbuzeiro等13运用Ames试验检测了两个饮用水厂氯化消毒后水样的致突变活性，结果发现两份水样的有机浓集物显示出相同的结果，均可引起CG到AT的颠换。Kundu等14的研究表明氯化副产物HNMs对沙门菌有致突变作用，对哺乳动物细胞有潜在诱变性。张淑琪等 15 用Ames试验分析氯化消毒对饮用水遗传毒性的影响，结果表明，未氯化自来水有机提取物致突变反应呈阴性，加氯后自来水致突变性增加；在19mg/L的浓度范围内，随氯浓度增加，水样致突变性增加不显著，而且加氯中和剂可以降低水样的致突变性。但是也有研究者用不同的毒性测试试验得出不同结论。Nathaniel W等人16用人体细胞突变性试验研究腐殖酸溶液、沼泽水体和饮用水氯消毒前后的致突变性，结果表明氯化使腐殖酸溶液的致突变性增加了5.5倍；氯化前沼泽水体在高剂量时具有致突变性，氯化后低剂量时无致突变性而高剂量时表现很强的细胞极性毒性；但是饮用水氯消毒前后水均无致突变性。以上研究提示，在饮用水氯化消毒过程中产生的卤代消毒副产物具有致突变作用，长期饮用氯化消毒饮用水，存在致癌致突变的潜在危害。对于在氯化消毒中产生的致突变性化学物及其前体物的鉴定工作也正在进行，目前一般认为能产生遗传毒性副产物的前体物主要有胡敏酸、藻类及藻类细胞外物质、蛋白质和氨基酸等。Meier等人17研究了腐殖酸水溶液氯化后的致突变性，认为水的致突变性大多是水中的腐殖酸与氯反应的产物引起。Fielding等人18的研究结果表明，除水中腐殖酸外，氨基酸也是水中致突变物质的可能前体。王家玲等人19也发现，腐殖酸是水中致突变物质的重要前体。此外，水中藻类及其代谢产物氯化后也会产生的很强的致突变活性。（2）其他消毒剂的影响对于饮用水经过氯胺、二氧化氯等其他消毒剂单独处理后遗传毒性或突变性的变化，国内外学者也进行了一些研究。Licia Guzzella等人20用体外短测成组测试（Ames试验、大肠杆菌SOS显色试验、发光细菌毒性试验和酵母菌DNA突变试验），研究地表水分别经过NaClO、ClO2和过氧乙酸(PAA)消毒前后水中非挥发性有机浓缩物的遗传毒性。结果表明，SOS显色试验和酵母试验是最灵敏的遗传毒性测试试验。控制三种消毒剂消毒后余氯均为0.2mg/L，NaClO和ClO2消毒会增加遗传毒性，而PAA消毒能微弱降低水源水的遗传毒性。但是由于水源水中有机物含量和种类随季节变化，导致水源水经同一种消毒剂消毒后遗传毒性变化规律不一致。Claudia Bolognesi 等人21用斑马贝血细胞彗星试验研究不同季节的地表水经NaClO、ClO2和过氧乙酸(PAA)消毒3小时和20天前后水中遗传毒性的变化，同时用斑马贝鳃细胞微核试验研究地表水经三种消毒剂消毒10天和20天前后的遗传毒性。10月份水样消毒剂投加量为：NaClO 1.24mg/L，ClO2 1.66mg/L，PAA 1.00mg/L；2月份水样消毒剂投加量为：NaClO 0.71mg/L，ClO2 1.76mg/L，PAA 0.61mg/L；7月份水样消毒剂投加量为：NaClO 0.55mg/L，ClO2 0.95mg/L，PAA 0.90mg/L；消毒处理前后的水样不经富集直接感染细胞。结果表明遗传毒性活性与取水季节尤其是季节温度有很大关系，冬季水样的彗星试验的毒性效应远小于夏季的结果，微核试验也有类似现象，尽管不太明显；TOC、COD和BOD高的水样的彗星试验效应和微核试验效应都明显高于TOC、COD和BOD低的水样。各个季节水样用PAA消毒后都不会产生彗星试验和微核试验阳性。水样用NaClO和ClO2消毒后会导致彗星试验检测的DNA损伤效应降低，但使微核试验的微核发生率明显增加。Silvano Monarca等人22用Ames试验和紫露草微核试验检测冬季和夏季的水源水和5个不同处理工艺的水厂的饮用水（经不同消毒剂消毒后）浓缩物的突变性。Ames试验结果表明，所有的水源水水样都不具有突变性（TA98菌株）。臭氧氧化后再用ClO2消毒能降低饮用水的TA98突变性，但是增加了夏季水样的TA100突变性；所有用ClO2消毒的水样的TA98和TA100突变性都降低了；但是所有用NaClO消毒的冬季水样TA98突变性都增加。微核试验结果表明，水源水具有很高的微核发生率，即具有很强的染色体诱变性；NaClO消毒后微核率会增加，但是其他消毒方法处理后微核率均下降。衡正昌等23用Ames试验研究成都市某水厂氯胺消毒和液氯消毒饮用水的有机浓缩物的致突变性，结果表明，对于TA98菌株，液氯消毒的出厂水1.5L检出阳性反应，而氯胺消毒检出阳性反应的水样量大于6.0L，证明氯胺消毒可以降低饮用水的致突变性。黄君礼等24用Ames试验对二氧化率和液氯消毒饮用水水样和黄腐酸(FA)溶液进行了致突变性的比较，结果表明，二氧化氯消毒的水样未显示致突变性，而液氯消毒的水样具有致突变性。国外已有研究者开展过紫外线消毒对饮用水或者污水致突变性或遗传毒性的影响的研究，大部分研究结果表明单独紫外线照射不会增加水样的致突变性或者遗传毒性。Veer de等人25用低压和高压紫外灯照射阿特拉津、西玛津等5种有机农药和苯丙氨酸等几种水体中天然存在的有机化合物，用Ames试验和姐妹染色单体交换试验研究其致突变性，结果表明无论是低压还是高压，对所有样品来讲，紫外照射前后均无致突变性。Thomas Haider等26用80mJ/cm2的低压紫外灯照射澳大利亚不同地区的地下水，用Ames、紫露草微核试验和鼠肝脏细胞微核试验比较水样在紫外线照射前后的致突变性和遗传毒性，结果表明，只有一份水样紫外线照射后Ames致突变性增加（回复突变率为1.9），其余水样紫外线照射后均无遗传毒性和致突变性的增加。Silvano Monarca等人27用Ames试验、紫露草微核试验和洋葱微核试验考察夏、冬季城市生活污水经紫外线照射后（照射强度是5.69.7W/m2，照射时间是411s）致突变性和遗传毒性的变化，用发光菌试验考察其急性毒性的变化，发现四种试验结果均为阴性（除了在高剂量时会对Ames菌种产生抑菌作用），说明紫外线照射不会增加污水的致突变性、遗传毒性和极性毒性。Helma等人28用紫露草微核试验检测受污染的地下水经不同剂量紫外线照射后遗传毒性的变化，结果表明其微核发生率存在明显的剂量效应关系，而且最高紫外线照射剂量（1500J/m2）下的微核率是无紫外线照射时的6倍多，说明受化学物质污染的水体经紫外线照射后会有遗传毒性增加的风险。从上述已有的研究结果可以看出，饮用水消毒过程中遗传毒性的变化非常复杂，不同的消毒方法、不同的消毒条件、不同的饮用水、不同的季节、不同的毒性测试终点都可能得到不同甚至相反的结论，因此有必要系统的研究消毒方法、消毒条件、水质特性等对饮用水消毒过程中毒性变化的影响，以评估饮用水消毒的水质安全风险。1.2.2.2 遗传毒性化合物的鉴定（1）存在的问题为了评估饮用水中化学物引发的健康安全性问题，鉴定哪些物质具有遗传毒性就显得尤为必要。而弄清具体那种物质产生的毒效应是很困难的。主要有以下原因：(a)饮用水中化学物质种类繁多。1985年，Lucas29等人对美国 5个城市的饮用水做了调查。在检测出的化学物中，有1100多种曾做过毒性分析，大约还有2倍以上的化学物没有做过毒性分析。(b)对于已经做过毒性分析的化学物，有很多能用一个系统检测出来，但却不能被其他系统检测出来。(c)溶解在饮用水中的有机成分，90%是不挥发性有机物，这些物质很可能是极性物质或具有较高的分子量，一般难以用气相色谱或质谱进行分析。(d)饮用水样浓缩所得到的有机残余物，通常有致突变性。(e)缺乏对某些化学物毒性定量评价的资料和根据其水中实际浓度所得到的毒性评价数据。各种有机物在总体的致突变效应中各自所起的作用还不清楚。是由于大量化学物累积产生的致突变性还是某几种强致突变物质所引起的效应使这一问题更加复杂。同时，化学物之间的协同效应和拮抗效应也使这一问题变得更复杂。（2）致变物鉴定的方法致变物鉴定方法可分为以下几种类型：一是先检测出水中的有机化学物，然后一个一个的分析它们潜在的毒性。例如，Simmon等30用从水中测出的 71种有机物来诱导细菌和鼠伤寒沙门氏菌发生点突变。二是诱变性导向分离，分离水中具有致突变活性的物质。主要用和致突变分析相一致的分离技术，这种方法一般需要较多的步骤，直到分离出所要的致突变物。三是根据饮用水的致突变性与氯化消毒直接相关的前体物设计的，这种方法利用代表性底物（如腐殖质、氨基酸等）的氯化反应来检测致突变物的形成过程。四是衍生技术。五是选择有代表性的诱变物进行专门分析。（3）饮用水浓缩物的分级抽提与分析大多数以鉴定致突变物为目标的研究多使用饮用水的浓缩有机抽提物为研究材料。在制备这些抽提物时，样品中的挥发性组分大部分丢失了。即使采取一些措施减少挥发性物质的丢失，但那些高度挥发性物质也难以保留。因此，用常规方法来分离和分析水中致突变物时，所得结果常限制于对饮用水中相应的非挥发性有机致变物的评估。从更广泛的意义上讲，由于样品浓缩的方法存在着选择性，所鉴定的水中致突变物的类型在一定程度上已预先决定。这个事实在许多出版物中没有提到，但研究致变物特性时应该意识到这一点。若以饮用水中挥发性有机物的Ames试验结果加以比较，发现挥发性有机氯化物对活性的贡献是不大的，总三卤甲烷的活性仅占引水中总活性的1/50至1/100，这说明我们在研究饮用水时，以非挥发性有机物为对象的方向时正确的。 Loper 及同事31最初尝试鉴定饮用水中非挥发性有机组分中的致变物。他们的程序是在中性、碱性或酸性 pH值条件下，用正己烷抽提，然后在用薄层层析和高效液相色谱进一步分离，最后，可用核磁共振和质谱分析其结构。Loper 等人31随后又改进了方法：非挥发性物质先经过 XAD-2 和 XAD-7 树脂柱吸附，再用 HPLC分离以得到一系列各别的致突变组分，但是所抽提的致变物的不稳定性是这种方法所遇到的主要问题。Kool 等32用中性和酸性的 XAD树脂柱对荷兰境内的饮用水进行抽提，抽提物再用色谱进行分析，结果显示，两种方法得到的抽提物中致变剂的分子量范围在 100 到 300之间。（4）水处理后消毒副产物的毒性分析在推断水源中有机物与消毒使用的化学物反应产生的遗传毒性产物时，要考虑到许多反应条件，如反应物浓度、pH、温度、反应时间等。有些条件对反应产物的数量及种类有很大影响，必须加以考虑。在理想状况下，反应条件尽可能接近真实情况。在天然水中，有机氮的含量可相当于水中总有机碳的三分之一，大部分有机氮是以氨基酸或蛋白质形式存在。在八十年代，水处理使用的消毒物与氨基酸反应是否产生遗传毒性物质成为一个研究热点。Sussmath等33把氯气吹入高浓度的氨基酸溶液中，几分钟后，发现氯化的甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨基酸溶液能使细菌基因产生损伤。Rapson等34报道酪氨酸的氯化溶液能使 TA98菌株发生突变。Tan等对二肽的氯化产物进行研究，发现羟脯氨酸、羟赖氨酸的氯化反应产物对 Ames 试验中的 TA98、TA100有直接的致突变作用。在鉴定单个反产物毒性方面也有不少研究。Bull11鉴定卤乙腈类产物无论是用 Ames 试验还是用姐妹染色单体交换试验都有直接的致突变性。湖泊、溪流和一些地下水中大部分溶解的有机碳类物质是腐殖质。自从发现水中存在三卤甲烷类物质时，这类天然有机物质作为氯化消毒副产物的前体物而受到广泛的关注。Rook等人10认为三卤甲烷类物质是消毒过程中氯与腐殖质反应的产物，因此，人们从氯化副产物形成的机制及这些产物的鉴定入手, 对腐殖质类物质参与的氯化反应做了广泛的研究。腐殖质氯化产物的致突变性最早被 Bull 等人35证实。在这个研究中，他们用从两个湖中得到腐殖质和胡敏酸和从市场上购买腐殖质为材料，通过比较加氯前和加氯后的致突变性，发现加氯处理后的样品有显著的致突变性，而未经氯化处理的样品却没有。Miettinen等人36也发现氯化处理富含腐殖质的饮用水后有机卤化物明显增高，这类物质具有致突变性。关于致突变物的组分也有不少研究，大多数结果显示这些物质主要是一些极性化合物。也有人用其它消毒剂取代氯气对腐殖质进行处理，然后检测致变物的形成，其结果大部分为阴性或毒性减弱。1.2.2.3 对人体健康危害的评价由于担心致突变物可能产生致癌作用及能诱导生殖细胞产生可遗传的突变，饮水对人体健康的是否有显著性危害的标志，即是否存在致变性，成为一个公众健康问题被提出来。用体外系统，主要是细菌细胞、哺乳动物细胞及低等真核生物，都可以监测饮用水浓缩物的遗传毒性。但是，用哺乳动物个体监测到饮水浓缩物的遗传毒性还没有另人信服的证据。啮齿类的肝 S9 微粒体在有些情况下能明显降低饮用水的致突变性，暗示肝的代谢减毒作用可能阻止直接诱变剂到达组织内37，如骨髓。人们对饮用水的关注更多是担心长期摄入水中的遗传毒物可能增加诱发癌症的风险。在氯化处理的地表水或污染的地下水中，有几种化学物浓度较高，如氯仿、四氯甲烷、三氯乙烯等，这些物质在遗传毒性实验中有时表现出活性，有时没有活性。这些化学物的致癌性表现受到一些错综复杂的因素的影响，而这些复杂因素又使癌症诱发的风险产生许多不确定性。饮水中有机浓缩物的致癌性在大鼠和小鼠身上都做过试验。其中，氯仿抽提的有机浓缩物的长期致癌性研究既有阳性结果也有阴性结果。Kool 等人32发现 XAD-2 树脂对莱茵河水抽提得到的有机浓缩物在致突变试验中有稳定的阳性结果，但在将此河水喂养小鼠连续两年并把剂量提高到大约为人正常摄入剂量的 68倍条件下，未能诱导小鼠发生肿瘤。大量的流行病学研究证实饮用含有致突变物的水诱发癌症的风险是存在的。从早期的描述性研究中发现接触氯化的自来水和氯化副产品与癌症风险的增加有很好的相关性。Vartiainen等38利用接触有致突变性的饮用水的回顾性资料来研究饮用水与癌症关系，取得较好的相关关系 。Koivusalo 等39发现饮水中酸性致突变化学物在肾癌和膀胱癌的发生中起重要作用。他们40又通过对芬兰 1991-1992 年膀胱癌和肾癌病历的流行病学分析，并考虑到各种因素，认为在饮用具有致突变性水的人群中，男性诱发癌症风险度大于女性。Miettinen等人41对 1998-1999 年芬兰境内发生的由水引发的流行病进行研究，发现在这些病例中，由公共供水系统引起的病例占大部分，其病因除氯化消毒引起外，水中的病毒污染也是引起癌症的主要原因。1.2.3 遗传毒理短期测试方法介绍目前遗传毒理学短期生物测试方法主要有Ames实验、微核实验、彗星试验和umu试验等42。遗传毒理短测方法虽不能直接用于评价饮用水中诱变物对人遗传毒性的危险性，但它在饮用水质的检测及其它方面有着重要的实用价值，具体有以下几个方面的应用：（1）运用短测方法检测饮用水的诱变性自Simmon30等首次报道了饮用水致突变阳性的结果，人们运用了大量的短测实验测试了饮用水的遗传毒性，其中用的最广泛的是Ames实验，以TA100、TA98最敏感，而Maron和Ames在1983年提出的TA102和TA104则应用很少。不管是哪一种，只要能在任何一个菌株中出现阳性，则可判定为有遗传毒性。（2）运用短测方法寻找影响XAD树脂浓缩法的因素目前对水进行分离浓缩常用吸附浓缩法，就需要知道如何才能达到XAD树脂的最佳条件。Kool H J等人43通过Ames实验表明，应根据不同的具体条件，选择不同的树脂类型、淋洗剂种类及调整水样的pH值，才能达到最佳效果。（3）运用短测方法寻找可疑的致突变物质及形成的阶段自来水经氯化消毒后会产生氯仿和其它卤代烃，研究结果表明，饮用水中挥发性有机物对致突变活性的贡献并不大，仅占总诱变活性的2%，所以重点应放在非挥发性卤代烃上。Heming等44研究表明，MX占水样致突变活性的15%34%，而二氯丙醛和氯代丙醛类物质占饮用水致突变活性的百分比很小。（4）运用短测方法评价各种消毒方法的效果由于氯化消毒能产生致突变物，迫使人们寻找更好的方法来代替氯化消毒。Miller45对Mississippi河的水样分别经氯化，氯胺，二氧化氯处理，Ames实验表明，3种消毒方法均可产生直接致突变物，其诱变性的顺序为：氯化氯胺二氧化氯。1.2.3.1 Ames试验方法据估计，绝大多数人类癌症是由于环境因素，主要是环境化学因素引起的，包括人造的和天然的化学物，以往曾用慢性诱癌试验检查过其中一小部分化学物。但慢性试验费时费力、耗资，不适用筛选数目众多的环境化学物。近几十年来，随着工农业的发展，每年有大量新的化学物，包括工业品、农药、药物、食品添加剂、化装品等进入人类环境，造成大量的化学污染，它们除了能对人类产生明显的急性毒性外，还可能有远期危害，例如诱发突变、致癌、致畸、促进衰老和心脏病的发生等。要对有潜在危害的化学物作出预报，就需要有快速、经济、灵敏、特异的初筛方法。Ames 等经过十余年的努力，建立了一个以检测致突变性为基础的、行之有效的沙门氏菌回复突变试验。该试验已广泛应用于化学物的初筛，并被推为首选试验。（1）Ames试验原理Ames 试验是利用一组鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株，即一系列组氨酸营养缺陷型菌株（his-），在加入或不加入哺乳动物肝微粒体酶活化的条件下，测定化学物质诱导回复突变成野生型（his+）菌株的能力。当营养缺陷型细菌回复突变为野生型时，细菌从不能合成组氨酸到能合成组氨酸，从而能在不加组氨酸的选择性培养基上生长。根据在选择性培养基上生长的细菌菌落数目，与对照组自发回复突变菌落数目相比较，来测定化学物质诱导微生物基因突变的能力。（2）Ames试验菌种及生物学特征Ames及其同事推荐三个标准菌株（TA1535，TA1537，TA1538）和两个衍生菌株（TA100，TA98）作为常规试验用的测试菌株。TA1535是碱基置换型突变株，TA1537和 TA1538是移码突变株。Maron 和 Ames49建议改用由TA100，TA98，TA97，TA102 等 4 个菌株组成的新测试菌株组。TA97 的回变特性与 TA1537相似，但比后者敏感的多。TA102除了在组氨酸G基因内有赭石型突变外，还带有两个质粒 pKM101和 pAQ1，用它可有效地检出醛类、过氧化氢及DNA 交联剂。这些菌株除组氨酸操作子发生突变外，也附加其它几种基因突变。一种是深粗糙突变，简写为rfa。该基因突变改变了细胞壁上脂多糖性质，使细胞壁丧失了屏障作用一些大分子化学物易进入菌体内。该突变克服了检测敏感性随受试物质分子直径增大而降低的缺点，同时也使细菌丧失致病力。其次是紫外线抗性基因突变（简写为 uvrB基因）。uvrB基因的功能是修复紫外线对对 DNA的损伤。该基因的突变使细菌的 DNA切除修复机制丧失，提高试验的敏感性。另外，有的菌株还含 R因子质粒，命名为 pKM101。该质粒能促进细菌的易错修复，使各类 DNA损伤较早被最终固定于 DNA分子，转化为基因突变。（3）Ames试验的操作与结果判断(a)斑点试验与阳性判断依据。将0.5mL的DM盐溶液或等体积的S9 混合液、0.1mL 的测试菌液与 2mL 顶层琼脂混匀后倒如底层平板中。再把受试物加在滤纸片上，然后将纸片移至已凝固的顶层琼脂上，也可把受试物直接加在已凝固的顶层琼脂上。1小时内将平板翻转放入培养箱中，48小时后观察结果。在纸片周围出现较密集菌落者为试验阳性。靠纸片处可见宽窄不等的杀（抑）菌带，根据杀（抑）菌带的宽度，可粗略估计受试物的毒性程度。本法特别适用短期初筛大量受试物，但也有局限性，即在琼脂中不能扩散的多环芳烃化合物，不能被检出。(b)平板掺入试验与阳性判断标准。平板掺入试验是在灭菌的试管中，依次加受试化学物、DM 盐溶液或 S9 混合液、菌液，然后加 2ml 顶层琼脂混匀倒入底层平板中。待顶层琼脂凝固后，将平板翻转，放入培养箱中，3 天后观察结果。判断致突变试验的阳性标准是：平均每皿回变菌落数为溶剂对照（可视为自发突变数）的 2倍；有重复性；回变菌落数随剂量的增高而增加，但并非经常能获得线形剂量反应曲线；经统计处理有显著性差异。(c)预培养平板掺入试验。该方法是平板掺入法的发展，它是把受试物、缓冲液和细菌悬掖在 37水浴中预培养 20分钟，然后再加入顶层琼脂。预培养法能提高检测致突变物的灵敏度，对于某些用平板掺入法很难检测出的诱变剂有良好的效果。该法已经检测出多种致癌性亚硝基胺和几种致癌性生物碱以及某些不稳定的化学物和挥发性化学物的诱变性。（4）Ames试验方法的评价Ames 试验对化学致癌物来说，不是决定性的试验。但是，目前各地资料表明，Ames 试验阳性与致癌之间有十分明显的相关性。McYann47用该试验检测 300种化学物的结果指出，大多数致癌剂是诱变剂，相关性在 80%以上。因而，阳性诱变剂可被视为有致癌危险的物质，对人类有潜在危害。Ames试验的优点是，方法灵敏，检出率高；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。其缺点是，微生物的 DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。尽管如此，由于存在上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，成为首选的试验方法。加拿大、美国、日本等许多国家都在诱变试验系统中将Ames试验列在首选位置，与细胞遗传学体外试验或体内试验组合，可作为第一阶段初筛的手段。1.2.3.2 umu试验方法（1）umu试验原理umu是UV mutable的缩写形式，其原始含义是经紫外线照射引起的突变。umu基因来源于大肠杆菌，其主要存在的2种形式是umuC和umuD。umuC基因的大小为45kDa，属于DNA聚合酶V，其跨越无碱基位点的合成能力比聚合酶高100150倍；umuD基因的大小位15kDa，也属于聚合酶V，它能促进DNA损伤的修复。umuC和umuD是SOS调节子的重要成员，诱导后才能表达RecA。当生物体内的 DNA分子受到外源化学物质或一些物理因素攻击而造成损伤时，生物体内存在的一系列修复系统即对损伤的 DNA分子进行修复。修复方式有直接修复、切除修复、易错修复和重组修复。当DNA大范围受损，复制受抑制情况下，细胞产生一种易错修复(error pronere pair)功能，称为SOS修复，此时细胞表现为DNA修复功能增强、细胞生长正常但分裂受抑制、基因突变增加、呼吸受阻等，而细胞受理化因素损