MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究-硕士论文

分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 183q5 7 二 M Y B 转录因子家族相关E S T 干涉载体构建及遗传转化的 研究 R e s e a r c h e so fR N A iv e c t o r sc o n s t r u c t i n ga n dg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o na b o u tE S T o fM Y B t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r sf a m i l y 研究生：魏礼玲 指导教师：包满珠教授 宁国贵副教授 专业：园林植物与观赏园艺研究方向：园林植物遗传育种与生物技术 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院 二。一。年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 雹 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了i ) l 确的说明，并表示了谢意 研究生签名：蚕屯礼镌 时闻：加f 一年6 月J7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存使用学位论文的规定，印学生娼须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密商业秘密或申请专利等潜在餐要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 灿黼始魂知硷导撇：厶科 蚴她”易月，7 日 吖9 年么月7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 M Y B 相关转录因子家族基因的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 目录 摘要1 A B S T R A C T 3 缩略词表5 第一部分文献综述6 1 花色基因工程研究进展6 1 1 影响植物花色的因素7 1 1 1 色素的种类及各种色素的浓度7 1 1 2 色素的不同修饰7 1 1 3 分子堆积作用7 1 1 4 液泡p H 值的变化8 1 1 5 细胞的形状8 1 2 利用花青素基因改造花卉颜色。8 1 2 1 利用花青素调节基因调控花色8 1 2 2 导入外源花青素结构基因控制花色9 1 3 利用基因工程改变植物花色的几种途径1 0 1 3 1 通过引入新的基因或通过基因修饰的方法改变花色1 0 1 3 2 通过抑制基因活性改变花色10 1 3 3 通过导入调节基因而改变花色1 0 1 3 4 嵌合花色。1 1 1 3 5 利用删原理改变植物花色1 1 2 植物M Y B 转录因子研究进展1 1 2 1 植物中的M Y B 转录因子的结构特征与分类1 2 2 2 植物M Y B 转录因子的生物学功能1 3 2 3 植物M Y B 转录因子研究前景13 3G a t e w a y 技术1 4 3 1G a t e w a yC l o n i n gS y s t e m 的发展1 4 3 2G a t e w a y 技术的应用1 5 3 3G a t e w a yC l o n i n gS y s t e m 在基因沉默中的应用1 5 3 4G a t e w a y 技术的优缺点1 6 4 根癌农杆菌介导的转化机理1 6 4 1 根癌农杆菌的生物学特性1 7 4 2 根癌农杆菌T i 质粒介导的基因转化的分子机理1 7 4 3 影响农杆菌介导植物遗传转化的因素1 9 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 5 本研究的目的和主要内容2 0 第二部分M Y B 转录因子E B l 7 5 0 6 7 干涉载体的构建2 2 引言2 2 1 材料与方法2 3 1 1 实验材料2 3 1 2 试剂2 3 1 3 含a t t B 位点引物的设计2 3 1 4T R I z o l 法提取矮牵牛总R N A 2 3 1 5R T - P C R 得到c D N A 2 4 1 6a t t B P C R 2 4 1 7 纯化回收a t t B P C R 产物2 5 1 8 B P 反应2 5 1 8 1 B P 反J 立2 6 1 8 2 热击转化大肠杆菌2 6 1 8 3P C R 检测B P 反应阳性克隆2 6 1 8 4 阳性克隆测序2 7 1 9 表达克隆转化农杆菌E H A l 0 5 感受态细胞2 7 1 9 1 电击转化农杆菌E H A l 0 5 感受态细胞的制备2 7 1 9 2 电击转化农杆菌E H A l 0 5 感受态细胞2 8 1 9 3P C R 检测阳性克隆2 8 M 1 B 相关转录冈予家族摹冈的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 1 4 1 植物培养基3 4 1 4 1 1 矮牵牛遗传转化培养基3 4 1 4 1 2 烟草遗传转化培养基3 4 1 4 2 农杆菌培养基3 5 2 试验方法3 5 2 1 农杆菌叶盘转化法介导的M Y B 基因转化矮牵牛和烟草3 5 2 1 1 叶盘转化法转化矮牵牛3 5 2 1 2 叶盘转化法转化烟草3 5 2 - 2 不定芽的产生3 6 2 3 转化植株的扩繁和生根培养3 6 2 4 矮牵牛V 2 6 遗传转化方法的优化3 6 2 4 1 农杆菌感染时间对转化的影响3 6 2 4 2 共培养时间对转化率的影响3 6 2 4 3 延迟筛选对转化的影响3 6 2 5 组培苗的移栽3 6 2 6 转基因植株的P C R 检测3 7 2 6 1 矮牵牛及烟草叶片的采集3 7 2 6 2 矮牵牛及烟草基因组总D N A 提取( C T A B 法) 3 7 2 6 3 抗性植株园艺性状的观察分析3 7 3 结果与分析3 8 3 1 农杆菌介导的叶盘转化法的结果3 8 3 2 转化方法的优化3 8 3 2 1 农杆菌侵染时间对转化的影响3 8 3 2 2 共培养时间对转化的影响3 9 3 2 3 延迟筛选对转化的影响4 0 3 3 转基因植株的P C R 检测4 1 3 3 1 矮牵牛转基因植株的P C R 检测4 2 3 3 2 烟草转基因植株的P C R 检测4 2 3 4 抗性植株表型观测4 3 3 4 1 矮牵牛转基因植株表型观测4 3 3 4 2 烟草转基因植株表型观测4 4 4 讨论4 4 4 1 农杆菌抑制的问题4 4 4 2 添加滤纸对遗传转化的影响4 5 4 3 遗传转化中的筛选问题4 6 I l l 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 4 4 定期进行菌落P C R 检测4 6 4 5 试管苗移栽成活4 6 4 6 转基因植株的检测4 7 第四部分后续研究与展望一4 8 1 后续研究4 8 2 本研究的前景展望4 8 参考文献4 9 致谢5 7 附录：重组载体图谱5 9 I V M Y l 3 相关转录因子家族基因的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 M Y B 转录因子家族相关E S T 干涉载体构建及遗传转化的 研究 摘要 M Y B 转录因子基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调 控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态 建成具有重要的调节作用，有着广泛的生理作用。转录因子的结构和功能已经成为 植物分子生物学领域的研究热点。 通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达，是植物对其生长发育及生理 代谢调控的一种重要方式。大多数M Y B 转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作 用。近年来，M Y B 转录因子被证实广泛参与类黄酮代谢途径的调控。研究发现M Y B 转录因子参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，其中R 2 R 3 M Y B 转录因子作为调 节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控，控制植物的花色。到目前为止，几乎所 有的报道与花青素合成相关的M Y B 转录因子均是R 2 R 3 M Y B 蛋白。而新的研究发 现，含有单个M Y B 结构域的M Y B 基因C P C 在转化烟草中也控制了花色。深化了 我们对M Y B 转录因子的认识，而且为我们实现人为地控制花青素的产量提供了策 略。 鉴于以上思路，本研究的主要内容包括： 1 、M Y B 转录因子E B l 7 5 0 6 7 干涉载体构建 本试验根据N C B I 上矮牵牛的一个E S T 序列( E B l 7 5 0 6 7 ) 与拟南芥比对认为其 为与花色发育相关的M Y B 类基因，在矮牵牛中克隆出这个基因，利用同源重组方 法( B P 反应) 构建能形成发卡结构的R N A i 载体。将G S T s 片段整合进入载体 P h e l l s g a t e 2 中，形成含有i n t r o n 的反向重复序列，即i h p R N A 载体。目的载体启动 子与终止子之间的设计为a t t P l c e d B a t t P 2 i n t r o n - a t t P 2 c c d B a t t P l ，所以B P 反应后 形成的表达载体即为含有i n i r o n 的目的片段的反向重复序列。 2 、C P C 超表载体和E B17 5 0 6 7 干涉载体转化矮牵牛和烟草的研究 根据已经构建好的p h e l l s g a t e 2 E B l 7 5 0 6 7 ，通过农杆菌介导的遗传转化方法将该 干涉载体转入早花烟草中。对转化植株进行P C R 检测，获得3 5 株阳性转基因苗。 C P C 超量表达载体，前人已经将其转化到烟草植株中并得到了花色变异的转化 植株。因此本试验也将C P C 超表载体转入矮牵牛V 2 6 中，也是为了进一步验证C P C 转录因子的功能和调控机制。对转化植株进行P C R 检测，获得了2 5 株阳性转化苗， 在下地的1 5 株阳性转化苗中，有一株花色发生变化。与对照相比，花色变淡，花型 变小。从前人研究和表型来看，超量表达的C P C 确实引起了矮牵牛花色素的变化。 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 3 、矮牵牛品种V 2 6 遗传转化体系的优化 通过对影响农杆菌介导的矮牵牛遗传转化的几个主要因素的探讨，研究矮牵牛遗传 转化过程农杆菌侵染时间、共培养时间以及延迟筛选的时间对抗性芽产生率的影响，对 其遗传转化体系进行优化。在本试验中，矮牵牛叶片侵染时间为5 m i n ，在共培养基上 共培三天( 不须延迟筛选) ，然后转入筛选培养基上培养可以明显提高矮牵牛的转化效 率。 关键词：M Y B 转录因子；花色；g a t e w a y 克隆技术：遗传转化 M Y B 相关转录因子家族基因的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 R e s e a r c h e so fR N A iv e c t o r sc o n s t r u c t i n ga n dg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o na b o u tE S To fM Y B t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r sf a m i l y A B S T R A C T M Y Bt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ri so n eo ft h el a r g e s tf a m i l i e si np l a n t s ，w h i c hp l a y s i m p o r t a n tr o l ei np l a n t si nr e g u l a t i o no fs e c o n d a r ym e t a b o l i s m ，r e s p o n d i n gt oh o r m o n e s a n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，a l s or e g u l a t i o no fc e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，c e l lc y c l e sa n dt h e f o r m a t i o no fl e a v e sa n do t h e r so r g a n s B e c a u s eo fi t sw i d e l yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，t h e r e s e a r c ho ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fp l a n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rh a v eb e e nr e s e a r c h e di n t h em o l e c u l a rb i o l o g yf i e l d A c c o r d i n gt oc o n t r o l l i n gt h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n ei nt r a n s c r i p t i o n a ll e v e lb y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，i ti sa ni m p o r t a n tw a yf o rp l a n t st oc o n t r o lt h e i rg r o w t hd e v e l o p m e n t a n dp h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s m M o s to fM Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r st a k ep a r ti n t h e m e t a b o l i s mo ff l a v o n o i d si np l a n t s I nr e c e n ty e a r s ，M Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r e c o n f i r m e di nf l a v o n o i d sm e t a b o l i cp a t h w a y s R e c e n tr e s e a r c hh a sf o u n dt h a tM Y B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s p l a y ar o l e i n r e g u l a t i o n o f s e c o n d a r y m e t a b o l i s mo f p h e n y p r o p a n o i d si np l a n t s A m o n go ft h e m ，t h eR 2 R ，M Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r e w i d e l yi n v o l v e di nt h em e t a b o l i cp a t h w a y si np h e n y p r o p a n o i d s ，t h e nc o n t r o lt h ec o l o ro f p l a n t s U n t i ln o w , a l m o s ta l lM Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sr e p o r t e dw h i c ha r e l a t e dt o s y n t h e s i so fa n t h o c y a n i d i n sa r eR 2 R 3 M Y Bp r o t e i n s B u tw eh a v en e w l yf o u n d e dt h a t C P Cw h i c hi ss i n g l eM Y B - t y p eg e n eC a na l s oc o n t r o lp l a n tc o l o r T h e s ee v i d e n c e sh e l pU S d e e p l yu n d e r s t a n dM Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，a l s op r o v i d en e ws t r a t e g yf o rU St oc o n t r o l t h ea n t h o c y a n i d i n sc o n d u c t i o n I nt h i sd i s s e r t a t i o n , s e v e r a ls t e p sw e r et a k e nt or e a l i z et h i si d e a ： 1 、C o n s t r u c tM Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r - E B17 5 0 6 7R N A iv e c t o r A c c o r d i n gt ot h eE S Ts e q u e n c e s ( E B 17 5 0 6 7 ) i nN C B I ，w h i c hi st h o u g h tt ob e r e l e v a n tt op l a n tc o l o rc o m p a r i n gt oA r a b i d o p s i s ，i sa l s oaM Y Bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r W e c l o n e dt h i sg e n ei np e t u n i a , a n dc o n s t r u c t e da ni h p R N Av e c t o rt h r o u g hh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nm e t h o d ( B Pr e a c t i o n ) T h et a r g e tg e n ei si n s e r t e dht h eP h e l l s g a t e 2v e c t o r t h r o u g ht r a d i t i o n a lc l o n i n gw a yc o m b i n gw i t hG a t e w a ym e t h o d 2 、T r a n s f o r mC P C o v e r - e x p r e s s i o nv e c t o ra n dE B 17 5 0 6 7R N A iv e c t o ri n t op e t u n i aa n d 3 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 t o b a c c o W eh a v et r a n s f o r m e dt h eE B17 5 0 6 7R N A iv e c t o ri n t oe a r l y - f l o w e rt o b a c c o t h r o u g ht h el e a f d i s cm e t h o dm e d i a t e db ya g r o b a e t e r i u mt u m e f a c i e n s P C Ra n a l y s i so ft h e t r a n s f o r m e dp l a n t ss h o w st h a tw eh a v eo b t a i n e d6 0p o s i t i v et r a n s f o r m e dp l a n t s ，w h i c h c o n f i r m e dt h a tt h eE B17 5 0 6 7g e n ew a sa l r e a d yt r a n s f o r m e di n t oe a r l y - f l o w e rt o b a c c o T h eC P Ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw h i c hc o n t a i ns i n g l eM Y Bs t r u c t u r eo r i g i n a l l y p a r t i c i p a t ei nt h ef o r m i n go f t r i c h o m ea n dr o o th a i ri np l a n t s ，b u tw ef o u n dt h a ti tc a r la l s o a d j u s tt h eg e n ef o r m i n go fl a t ef l a v o n o i d s I nt h eh i g he x c r e s s i n gC P Ct r a n s f e r - t o b a c c o ， w i t ht h ec h a n g i n go ft f i c h o m ea n dr o o th a i rd i s t r i b u t i o n ，i t sa n t h o c y a n i d i n si sa f f e c t e d ，i t s f l o w e r st u m i n gl i g h t e ra n dw h i t e r S oi nt h ee x p e r i m e n t ，w ea l s ot r a n s f e ro v e r - e x p r e s s C P Ct op e t u n i a sV 2 6 ，i no r d e rt op r o v et h em e c h a n i s ma n df u n c t i o no fC P Ct r a n s c r i p t i o n f a c t o r s A c c o r d i n gt ot h eP C Rd e t e c t i o no ft r a n s f e rp l a n t s ，w eg o t3 5p o s i t i v et r a n s f e r p l a n t s ，i ts h o w st h a tt h ee x o g e n o u sg e n e h a di n s e r t e di n t ot h eg e n o m eo fp l a n t s 3 、O p t i m i z et h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fp e t u n i as p e c i e sV 2 6 A c c o r d i n gt os e v e r a l m a i nf a c t o r si n f l u e n c e dt h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yb y a g r o b a e t e r i u mt u m e f a c i e n s ，w ee x p l o r e dt h et i m eo fa g r o b a e t e r i u mi n f e c t i o n ，c o - c u l t u e t i m ea n dd e l a y i n gc h o o s i n gt i m ei n f l u e n c i n gt ot h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o n I nt h i s e x p e r i m e n t w eh a v ef o u n dt h a tw h e nt h ep e t u n i al e a v e si n f e c t e di n5 m i n ，c o - c u l t u r e d3 d a y sO i lC O - c u l t u r em e d i u mw i t h o u te x p e r i e n c i n gd e l a ys e l e c t i o n ，a n dt h e nt r a n s f o r m e d i n t os e l e c t i o na n dd i f f e r e n t i o nm e d i u m ，t h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yi so b v i o u s l y i m p r o v e d K e yw o r d s ：M Y Bt r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s f a m i l y ；f l o w e rc o l o r ；G a t e w a yc l o n i n g t e c h n i q u e ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 4 M Y B 相关转录因子家族基因的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 缩略词表 5 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 第一部分文献综述 花色基因工程研究进展 对植物基因工程的研究，国外起步比较早，尤其是在观赏植物的花色基因工程 方面，许多发达国家已开展了大量的基础性和应用性研究，并且取得了有效的成绩。 自H o r s c h 等在1 9 8 5 年创立叶盘转化法转化植株以来，S a n f o r d 等在1 9 8 7 年利用基 因枪技术开创了新的育种方法，L e m i e u x 等第一次成功的利用了农杆菌介导法转化 菊花。世界上第一例利用基因工程技术改变花色的植株的是H o l t o n 等用类黄酮基因 转化菊花、矮牵牛、月季等植物所获得。此外，美国曾从矮牵牛中分离到蓝色基因， 转入月季创造出蓝色月季。澳大利亚和日本的研究人员将矮牵牛f 3 5 h ( f l a v o n o i d 3 5 - h y d r o x y l a s e ) 和d f r ( d i y d r of l a v o n o l 4 r e d u c t a s e ) 基因导入缺乏D F R 的 白色香石竹，培育出紫色品种M o o n d u s t ，并成功上市( 赵云鹏，等，2 0 0 3 ) 。 M e y e r 等在1 9 8 7 年首次将源自玉米的编码D Q R 的a l 基因导入矮牵牛白花突变体中， 产生了开砖红色花的矮牵牛。1 9 9 2 年，国外相关研究人员向蔷薇中导入一种基因， 并成功获得蓝色植株。 在花色基因工程操作中，可以通过导入能够增强或减弱原有代谢产物表达得基 因，如p h 基因、辅助色素基因等或者同时导入多个花色相关基因来改变植株的花色 ( 何小铃，1 9 9 8 ) 。1 9 9 3 年，Q u a t t r o c c h i o 等在矮牵牛中导入将一系列花色背合成 的调节基因，获得粉色花。2 0 0 1 年，K l m 将玉米c l 基因通过农杆菌介导转化烟草， 使植株颜色显著变浅，花瓣变狭长。由于蓝色月季须具备：花翠素、辅助色素黄酮醉 和较高的p H 值，多基因的同时导入就对培育蓝色月季具有重要利用价值。2 0 0 4 年， 日本S a n d o r y 公司将三色荃的蓝色色素基因导入转化玫瑰，是的世界上第一株蓝色 玫瑰得以问世。 在我国，对于观赏植物基因工程方面我们也开展了一系列的工作。在金鱼草、 丝石竹、菊花、矮牵牛、蝴蝶兰、二月兰等花卉上均进行了有益的探索，并在花色 基因工程上取得了一定的进展。邵莉等将从矮牵牛中克隆到的C h a - A 基因9 9 的同 源片段，导入矮牵牛获得1 0 0 的花色改变率；颜华等在1 9 9 7 年从矮牵牛中克隆得 到了d f r - A 基因9 8 的同源片段，并实现其在大肠杆菌中表达( 赵云鹏等，2 0 0 3 ) ； 19 9 8 年，沈亚楠等通过在金鱼草d e l 基因导入烟草，使得植株花色营沉积模式发生 了变化。另外在蝴蝶兰c h s ( c h a l c o n e s y n t h a s e ) 基因的克隆和分析，矮牵牛c m 基因启 动子的克隆和测序以及花色苷合成调节基因c 1 r 作为基因枪转化效果指示等相关研 究上也开展了一系列工作。此外在北京大学植物蛋白质程与基因工程重点实验室， 粉、白、紫三色相间的转基因花己成功地利用基因工程手段获得。湖北大学生物科 学院“特异花卉克隆与基因工程创新 课题组，在首获转基因美人蕉后，又成功培 6 M 1 B 相关转录因子家族基因的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 育出了一花多色的特异花卉，开出了2 种至3 种颜色，甚至各种形状组合的花朵， 观赏性是普通花甚高。现在，他们正在着手研究把中国花卉的基因与国外名花的基 因相结合，培养更多特异花卉。同发达国家相比，我国虽然做了一些相关方面的研 究，并取得了一定的成果，但是还存在差距。 花青素代谢调节基因作为植物遗传转化报告基因中最便捷的一种，应用广泛， 将其入植物细胞之后，细胞会改变颜色，无需进行组化学测试而杀死植物组织而进 行观察，通过常规解剖镜即可观测。目前，这些基因已被广泛应用到植物遗传转化 条件优化上( 包满珠，1 9 9 8 ) 。 1 1 影响植物花色的因素 1 1 1 色素的种类及各种色素的浓度 由于花色性状的复杂性，对花色能产生影响的因素就有多种，但主要分为内在 因素和环境因子两个大类( 赵昶灵等，2 0 0 3 ) 。具体而言，内在因素包括：花瓣表皮 细胞的形状，花瓣细胞中的色素种类、色素含量及花色素合成基因调控，花色素分 子之间的吸附、钻化、自聚和分子堆积等作用，细胞内p H 值的变化，糖的调节作 用等。环境因子包括传粉者、光强、光质、光周期、温度、水分、矿质营养、真菌 侵染或机械损伤等。 影响花色的主要因素为花瓣细胞中的色素种类、色素含量( 包括多种色素的相对 含量) 以及与花成色有关的色素有类胡萝1 - 素、类黄酮、水溶性生物碱等，其中类黄 酮能够产生从浅黄到蓝紫的全部颜色范围。 1 1 2 色素的不同修饰 多种色素的不同修饰作用，比如花青素的糖基化( g l y c o s y l a t d e ) 、甲基化 ( m e t h y l a t i o n ) 、乙酞基化( a c y l a t i o n ) 以及与金属离子的鳌合作用( m e t a lc h e l a t i o n ) ，都可 以使花的颜色产生改变。 1 1 3 分子堆积作用 分子堆积作( m 0 1 e e u l a rs t a c k i n g ) 包括分子间堆积和分子内堆积两种，分子 间堆积又包括花色苷的自连作( s e l f - a s s o c i a t i o n ) 和辅助着色作用( c o p i g m e n t a t i o n ) ， 即花色苷与辅助色素( c o p i g m e n t ) 结合而呈现增色效应( h ) ，p e r e c h r o m i ce f f e c t ) ，从而产 7 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 生从紫到蓝色色系的现象( T a n k ae t a l ，1 9 9 5 ) 。 1 1 4 液泡p H 值的变化 在不同的p H 环境下，花青素类物质的结构能发生互变异构现象，因而其对光 的吸收特征也随之变化，从而使颜色发生变化。比如：当花瓣表皮细胞液泡的p H 值产生变化，就会通常引起花色的改变，一般随着p H 的上升，颜色会逐渐由红变 蓝。 1 1 5 细胞的形状 如果花瓣表皮细胞的形状有利于细胞吸收入射光的话，花卉就会产生较深的色 泽；反之，则产生明亮的外观( 邱辉龙和范明任，1 9 9 8 ) 。 1 2 利用花青素基因改造花卉颜色 花色素( A n t h o c y a n i n ) 是一类天然存在的，在植物次生代谢过程中起着十分重要 的产物，它广泛存在于开花植物( 被子植物) 中，我们所看到的水果、蔬菜、花卉等 五彩缤纷的颜色大都与之相关( G i b b o nBC ，2 0 0 5 ) 。由于花色素在自然状态下会与各 种单糖通过糖苷键形成糖苷，故此时我们常称之为花青素( A n t h o e y a n i n ) ，也叫作花 色苷。 当前，在几种能够影响植物花色的类色素中，我们对类黄酮中的花青素，以及 它的合成途径和与之相关的基因研究较为深入。现在，这些系列的花青素合成的结 构基因和调节基因已经在不同的植物中被克隆出来，利用基因工程的方法将这些基 因来转化花卉，就能成功地改变许多花卉的颜色( 赵昶灵等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 利用花青素调节基因调控花色 对于花青素合成的调节基因的获得，现在主要应用转座子技术和基因探针的方 法进行克隆。虽然物种不同，但其所含花青素的生物合成途径通常由类似的调节基 因介导。根据调节基因其编码出蛋白的不同，调节基因可分成以下几类( 见表1 1 ) 。 8 M 1 B 相关转录因子家族基冈的载体构建及矮牵牛和烟草遗传转化的研究 裹卜1 几种檀物花色素苷合成中的转录因子及其编码基因 T a b l e l - 1t r a n s c r i p t i o nf a c t o rr e g u l a t o r yg e n e so ft h ea n t h o c y a n i nb i o s y n s t h e t i c p a t h w a yi ns e v e r a lp l a n t s 近些年来，众多研究主要集中与玉米、金鱼草和矮牵牛等材料的有关花色素苷 生物合成调控。由结构基因酶、m I 斟A 表达分析可以证实：众多调控基因能够作用 于两个或者多个花色素苷的生物合成。目前，对于C H S 、D F R 、U F 3 G T 这3 个花青 素结构基因的调节过程研究最为详细( 赵云鹏，2 0 0 3 ) 。 研究表明，在玉米中，调节基因能作用于花青素合成途径中的大部分酶基因( 如 C H S 、D F R 、U F 3 G T 等) 。而在金鱼草中，对的花青素生物合成的后阶段起调节作用 的3 个调控基因为D E L I L A 、E L U T A 、R O S E A 。在矮牵牛中，则有四个位点A N l 、 A N 2 、A N l 0 和A N l1 的基因对U F 3 G T 酶活性和D F R m R N A 表达量表现出类似调控 效应。由于4 个位点的突变均积累二氢黄酮醇( d i h y f r o f l a v o n 0 1 ) ，所以G r t a t s ( 1 9 9 0 ) 认 为C H S 、C H I 和F 3 H 不被上述的4 个位点基因的调控。这表明矮牵牛花色素苷的调 控始于D F R 以后的各阶段，受调控阶段比金鱼草晚一些。这些物种的差异反映了黄 酮( f l v a o n e ) 和黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 的合成以及类黄酮途径产物的选择，会影响金鱼草、 矮牵牛的色素沉积模式，而对玉米色素沉积模式则没有影响。 最近的研究发现表明，M Y B 家族编码的蛋白中，除有促进花色素苷的合成以外， 还有抑制花色素苷合成的蛋白出现。例如：草莓中分离出的F a M Y B 会编码一个相 对较短的M Y B 蛋白，它的表达出现在成熟和过熟的果实中。将其转入烟草后则发 现，它可以明显抑制烟草中花色素苷的积累( W e iZ h a n g ，e ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 1 2 2 导入外源花青素结构基因控制花色 如果植物的花色由单个基因控制并且缺乏这种基因，可以通过导入外源结构基 因来改变花卉的颜色。例如后面讲到的世界上第一例改变矮牵牛花色就是通过导入 外源结构基因的方法来获得的。 9 华中农业大学2010 届硕士研究生学位论文 1 3 利用基因工程改变植物花色的几种途径 1 3 1 通过引入新的基因或通过基因修饰的方法改变花色 一种植物，倘若控制其花色的是单基因，并且该植株本身又缺乏该种基因，要 改变它的花色就能够通过导入外源基因的方法来获得。例如：世界首例改变矮牵牛 花色实验就是利用这种方法，具体过程为：研究人员向矮牵牛突变体中导入从玉米 中得到的二氢黄酮醇还原酶( D F R ) 后，还原其体内的二氢堪非醇，从而产生了色素生 物合成中间产物，如此，新花色系列的矮牵牛就得以问世( 花色变成谈砖红色) 。 另外，我们还可以通过利用基因修饰作用来改变花色，使花色变得五彩斑斓。 1 3 2 通过g P S U 基因活性改变花色 改变花色的途径，还可以通过调控植物体内色素合成的方法，来到达限制酶的 基因表达的目的，从而使得色素合成速率降低，