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基因结构分析摘要：本文综述了基因的研究背景，并且用X射线衍射技术观察了DNA的双螺旋结构，原子力显微镜观察了pBR322DNA的拓扑结构，电子显微镜观察DNA，扫描隧道显微镜观察了DNA的变异结构，以及用透射电镜观察DNA的转录。关键词：DNA X射线衍射 原子力显微镜 电子显微镜1 研究背景1869 年瑞士化学家米歇尔（Friedrich Miescher）在细胞核中发现了一种含有磷酸的奇特的物质，他把这种物质称为“核质”（nuclein），后来改名为核酸（nucleic acid）。1880年德国生化学家科塞尔（Albrecht Kossel）开始了对核酸的生化分析，到19 世纪末叶已从DNA中分离出4 种碱基，它们是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。1927年李（P.A.T.Levene）从DNA中分离出脱氧核糖。到20世纪30年代已经确定了DNA的化学组成，它由4个称为核苷酸的基本单位组成，每种核苷酸又是由3 种基本的亚单位，1个碱基，1个脱氧戊糖和1个磷酸基团组成1。1950 年查伽夫（Erwin Chargaff ）发现DNA中嘌呤类两个碱基之比例和嘧啶类两个碱基之比例随生物种类不同而大有不同. 他又发现嘌呤类之总量和嘧啶类之总量相等，其中腺嘌呤之量等于胸腺嘧啶之量，鸟嘌呤之量等于胞嘧啶之量1。1952 年赫尔希（A.D. Hershey ）和蔡斯（Martha Chase）利用放射性示踪物质对噬菌体侵染过程中分子事件的确切研究，表明了只有DNA（而没有蛋白质）参与了噬菌体颗粒复制的生化过程，说明DNA是遗传物质2。DNA 分子是由许多核苷酸分子连接而成的长链分子，在DNA 中核苷酸是通过磷酸基团连接起来的（如图1所示）。每一个核苷酸的脱氧核糖与另一个核苷酸的磷酸基连接在一起，形成糖-磷酸基骨架，构成了DNA 的主链，这条主链决定了DNA分子的长度。虽然糖-磷酸基主链是很有规则的，其结构单元是彼此相同的，但它不是作为一个整体的分子，而只是DNA分子的一部分，因为每个糖有个附着在它上面的碱基，而这个碱基并不总是相同的，沿着这条链它们彼此遵循的顺序是有规律的。对各种DNA的化学结构而言，相互间的差别主要体现在所含碱基的组成、数量及排列顺序上。虽然我们从DNA 的化学结构式知道它是一条链，但它自身并未告诉我们这个分子的形状，它的分子排列图形仍然不明。要进一步了解DNA的三维空间结构，有待于用各种方法进行分析研究。2 基因提取方法基因有多种提取方法，真核生物、原核生物中的DNA和病毒质粒等的提取方法各不相同。现在介绍一种实验室常用的普遍的实验方法，步骤如下：1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。3、重复2。4、加入5ml DNA提取缓冲液,(10mmol/L Tris-Cl, 0.1 mol/L EDTA, 0.5% SDS),混匀。5、入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml, 混匀,50水浴3h。6、用等体积的酚抽提一次,2500r/min 离心收集水相,用等体积的（酚,氯仿,异戊醇）混合物抽提一次,2500r/min 离心收集水相。用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。7、加入等体积的5mol/L 的LiCl,混匀,冰浴,10min。8、2500r/min,离心10min，转上清于一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温10分钟。9、2500r/min,离心10min，弃上清。加入0.1倍 体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20预冷无水乙醇，-2020分钟。10、12000r/min, 室温离心5分钟，弃上清，将DNA溶于适量TE中。3 研究方法3.1 X射线衍射确定基因的双螺旋结构3威尔金斯使用的样品是纤维状的DNA结晶体，并使其保持在潮湿状态。实验中DNA纤维和照相底片都放置在垂直于X 射线束的方向上（图2）。当单色X射线束垂直通过DNA纤维时，就像通过一个光栅一样，在照相底片上就会呈现明暗相间的X射线衍射图样。在衍射图上的纵轴和横轴分别以子午线和赤道线相称。 图2 X射线照相设置示意图 图3 B型结构的X射线衍射图衍射图是B型结构的DNA的X射线衍射图（图3）。他指出：X射线衍射图照片是由两个区域组成的。一个是由沿着这条链的碱基的有规则的空间排列决定的；另一个是由这条长链的空间构型决定的。他说：“阿斯特伯里建议的这个强烈的0 .34 nm 反射对应于沿着这条纤维轴中间的核苷酸的重复。然而这个约为3 .4 nm的层线并不是多核苷酸组成的重复，而是由于链条构型的重复。当核苷酸具有比较高的密度的时候就引起了强烈的衍射。在子午线上及附近反射的减少立即可以得出具有平行于纤维轴的螺旋结构”。这一段话说明了螺旋结构与衍射图间的相互关系，可作如下具体解释。如图4所示，设核苷酸（或碱基对）之间的间距为h，则h=0 .34 nm，在衍射空间（即倒易空间）中对应线段的长度h= 1/h=1/0 .34 ，对应于衍射图上第10层线的衍射强度。设螺旋的螺距为p，则p= 3 .4 nm，在衍射空间（即倒易空间）中对应线段的长度p= 1/p= 1/3 .4 ，对应于衍射图上第1层线的衍射强度。 图4 螺旋结构与衍射图间的相互关系示意图 图5 A型DNA的X射线衍射图威尔金斯小组拍制了A型DNA的X射线衍射图。图5给出结晶的DNA在X射线衍射的倒易空间中衍射强度的二维图。图中黑色矩形的高度正比于结构因子，其面积正比于总强度。这条连续曲线与螺旋结构的结构因子相对应。威尔金斯用大量的实验数据证实了沃森和克里克提出的DNA的双螺旋结构模型，并用具体的实验数据表示之。他得出结论说：“整条磷酸基-糖链大约处在距离螺旋轴0 .9 nm处，形成两条间距为1 .4 nm、直径为1 .8 nm的螺旋。一系列碱基对与螺旋轴大约成65度的倾角，在两个直径为1 .8 nm的螺旋之间，形成直径为1 .0 nm 的单股螺旋（图6）。这个模型作为一个整体与从X射线衍射数据推断出的结构对应得很好”。图6 DNA的双螺旋结构模型3.2 原子力显微镜研究pBR322 DNA的拓扑结构4将质粒pBR322 DNA吸附在新鲜剥离的云母基底上，在大气下用AFM成像，其结果如图7所示。其扫描范围约为12m12m。右图7所知，pBR322 DNA分子呈现为环状的松弛型拓扑结构，但环的直径有所不同。因为单体pBR322 DNA的长度为1.49m，可以推出单体的环状松弛型DNA的直径应为475nm。我们对图7中观察的松弛型pBR322 DNA分子的直径进行测量，将结果进行统计并列于表1中，由表1可知，实验测得的单体、二聚体及三聚体的直径数值基本上与理论计算结果一致。在图7中，有56%的pBR322 DNA为单体、36%为二聚体、8%为三聚体。可见，pBR322 DNA分子大部分是以单体存在，并有一部分发生二聚或三聚。 图7 pBR322 DNA的原子力显微图像 图8 pBR322 DNA的原子力显微图像图像在大气下直接测定，仪器工作方式为接触模式， 实验条件同图7，扫描范围为59506510nm所有的微悬臂的力常数为0.12N/m，长度为200m，图像通过恒力扫描得到，扫描范围为1189013020nm 图9 pBR322 DNA的原子力显微图像 图10 超浓缩pBR322 DNA结构的AFM图实验条件同图7，扫描范围为39604340nm （a） （b） 图11 pBR322 DNA的双分子连环拓扑结构pBR322 DNA中存在两个分子连环的拓扑结构，其中一个分子为松弛型，而另一个分子处于凝聚状态（a）或是超螺旋状态，或是一个分子内打结（b）图7、图8、图9是用原子力显微镜对pBR322 DNA观察的结果。在pBR322 DNA的原子力显微图像中，我们可以观察到若干种特征的DNA拓扑结构：（1）特征的、分布均匀的环状松弛型DNA（如图7所示）。（2）在图7中，我们还可辨认出一些球形的颗粒状物质。图8、图9中，这些形态结构可以更清晰的看到。图10是对图9中右上角区域中含有两个颗粒状物质进一步放大的结果，我们把这种形态的DNA指认为超浓缩DNA。（3）对图7中的一些局部区域进行放大，所得图像如图11所示，这幅图像显示了pBR322 DNA的两种双分子连环拓扑结构。其中一个分子为松弛型，而另一个分子可能处于凝聚态；（4）在图7的一些局部区域中，我们还发现，pBR322 DNA可能存在多个分子的连环结构，并凝集成多链复合物，其结果如图12（a）及12（b）所示。（5）更为有趣的是，在图7的左下方区域，还找到一种由3个环状分子相连的结构，其放大后的图像如图13所示，可以看出，第一个环及第三个环是断开的，因此，它很可能是pBR322 DNA由单体向多聚体过渡的中间体。图12 pBR322 DNA的多分子连环结构 图13 pBR322 DNA单体向多具体过度的中（a）多个DNA分子并联结合；（b）多个DNA分子串联结合 间体3.3 电子显微镜观察DNA53.3图1显示DNA分子与平均直径880A的球形聚苯乙烯结合在一起，已经形成了混合的DNA水溶液。测量显微图像阴影部分的长度是205A，与双螺旋结构X射线衍射的螺旋高度相一致。测量与基质平面平行的纤维和平面之间的距离，以弥补金属在相同方向上沉淀造成的厚度（约25A），表明了在大多数显微图像中这些线是一分子宽，但是在其他地方，比如图1是几分子宽，预测纤维是折叠的或者是螺旋的。在3.3图2左边，是一个或者多个折叠分子，在这些集合体中没有任何突出的纤维。可以很频繁的看到独立的纤维或者聚苯乙烯分子。在图2中也可以看到一些小微粒，表面直径约为100A。这些小微粒不经常出现，并且可以表示为一些不纯的或者变性的DNA片段。3.3图3显示一个表面区域，在那儿有相对高浓度的DNA，已经形成了典型的凝胶状网络。在这种情况下，大多数相互连接的纤维是几分子宽。3.3图4显示了一个腺苷一磷酸聚合物纤维。在电镜下显示，这些纤维比较短，能够伸长，而且比自然界中的核酸要细。最细的纤维大约为10A，刚好看得见。 3.3 图3.4 DNA变异结构的扫描隧道显微镜研究6脱氧核糖核酸(DNA)是生命活动的主要遗传物质，它在不同的环境下可以产生结构变化，如经加热处理等会使DNA的双螺旋发生解旋等变化。最近有人用扫描隧道显微镜(STM)在人气下直接观察了裸露的B.A.Z-DNA的双螺旋结构和单链DNA的结构7-8，证明了STM是研究核酸结构的有力工具。实验用样品是华美生物工程公司生产的噬菌体Lambda DNA-Hind 。将这种DNA的水溶液加热到其Tm点之上的100约15min，然后快速降温到0, 将此经过处理的稀溶液滴到新鲜剥离的裂解石墨表面，待溶剂蒸发后在室温条件下用STM直接进行观察。图14（a）是用STM得到的一种辫状三链DNA变异结构图，其宽约为30A，与未经变性处理的右手双螺旋结构形成鲜明对比。在样品的不同部位，我们还观察到由双螺旋结构片断与三链辫状结构片段的衔接结构（图14（b）、右手双螺旋与左手双螺旋结构片段的衔接结构（图14（c）以及宽度为59A、螺距为27A的三级结构（图14（d）。图14 经变性处理的DNA变异结构3.5 透射电镜观察DNA的转录9（1） 依据R环法对recA基因的转录区域和转录方向的确定: R环法是利用基因构成分析方法确定mRNA的解读方向和转录区域的方法之一。一旦DNA与相应的mRNA杂交, 由于这一杂合物比DNA-DNA更为稳定, 所以mRNA可以与完成转录后的DNA 链之间形成碱基配对。其结果是产物的DNA链的长度只相当于mRNA 的长度。在DNA链上可观察到ssDNA（图15）。（2）依据异源双法对DNA缺失、插入和非同源区域的确定: 碱基序列相似的两种DNA分子( 比如噬菌体DNA和80噬菌体DNA) 混合后使之变性。当变性后的ss-DNA重新恢复成dsDNA 时。与亲本分子不同的两条单链DNA之间会形成dsDNA。这种dsDNA 就是所谓的异源双链。这种情况下，一旦存在两条DNA链间碱基对不相同的序列、出现插入序列或出现缺失序列时，那里的碱基将无法配对。此时可以观察到要么两条DNA链各自以ssDNA形式出现,要么一条DNA单链突兀出现于双链DNA中。由此可见。异源双链法可用于DNA物理图谱的制作。采用此法的简便之处还在于，即便是那些我们对其DNA碱基序列还尚未了解的供试材料，也可轻而易举地得到其碱基序列构造方面的信息（图16）。图15 采用R环法确定recA 基因的转录区域和方向图16 由nin5b2噬菌体和i434噬菌体形成的异源双连参考文献1 蒲杜嘉（Portugal F H），寇恩（Cohen J S）.DNA 世纪之回顾遗传物质构造及机能的研究发展史M. 孙克勤译. 台湾：徐氏基金会；北京：世界图书出版公司，1989 .5396，232235，277 280，282 .2美加兰E 艾伦.20 世纪的生命科学史M.田名译. 上海：复旦大学出版社，1999 .237238 .3 向义和.DNA纤维的X射线衍射分析与双螺旋结构的发现J.大学物理，2005（1）50544 张平成，白春礼，成英俊等. pBR322 DNA拓扑结构的原子力显微镜研究J.中国科学（B辑），1995(7)：717-7195 Cecil E.Hall.Method for Observation of Macromolecules with the Electron Microscope Illustrated with Micr