毕业论文-银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡诱导重要器官热休克蛋白表达研究.doc

金陵科技学院本科生毕业论文 材料与方法 银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡诱导重要器官热休克蛋白表达研究摘要：目的：本次试验主要目的是探讨一种饲喂方案对鸡抗应激能力的影响，并提出对生产实际有一定指导意义的饲料配方。方法：将一批受试鸡随机设置成6组，a.40只雏鸡+普通饲料，b.40只雏鸡+普通饲料+1%蝇蛆，c. 40只雏鸡+普通饲料+0.1%银杏叶提取物，d.40只雏鸡+普通饲料+0.3%银杏叶提取物，e.40只雏鸡+普通饲料+0.6%银杏叶提取物，f.40只雏鸡+普通饲料+0.1%银杏叶提取物+1%蝇蛆六个不同生境对照组。饲养45天后，取样，测定热应激后鸡热休克蛋白含量，测定热应激后谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶等血清生化指标，测定不同组热应激前后鸡热休克蛋白含量的变化。结果：a饲料中添加银杏叶提取物加蝇蛆热休克蛋白表达的最多，f组差异极显著。b血清生化指标明显降低，谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、差异显著。C热应激前后热休克蛋白含量差异显著。结论：银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡可以很有效的诱导重要器官热休克蛋白的研究，对生产实际有非常重要的指导意义。关键词：银杏叶提取物；蝇蛆；诱导；热休克蛋白；表达研究Ginkgo biloba extract increases the vital organs fly larvae feed the chickens induced expression of heat shock proteins2007 Veterinary Medicine chen lulu（Academic Advisor: zhang miao）Abstract: Between February and March in 2011，chicks were fed with different percentages of Ginkgo biloba extract in Wensheng ecological breeding base, Haianxian, Nantong, Jiangsu province. All chicks were randomly divided into 6 groups, based on different habitat controls: a. 40 chicks with normal feed, b. 40 chicks with normal feed + 1% fly maggots, c. 40 chicks with normal feed and 0.1% Ginkgo biloba extract, d. 40 chicks with normal feed and 0.3% Ginkgo biloba extract, e. 40 chicks with normal feed and 0.6% Ginkgo biloba extract, f. 40 chicks with normal feed and 0.1% Ginkgo biloba extact and 1% fly maggots. Observations on the growth and death in each group were recorded. After 30 days feed, samples in each group were taken and the growth, quality and some serum biochemical indicators, including alanine aminotransferase (ALT), aspertate aminotransferase (AST) and urea nitrogen (BUN) were measured and recorded, together with some immunity indicators, such as Total protein, Albumin, Immunoglobulin etc. Analyses were made on the effects of six different kinds of feed to the growth, quality and some immune serum indicators. Key words: Ginkgo biloba extract；Myiasis；Induced；Heat shock protein；Expression 0 引言银杏叶是一种具有很高药用价值的植物。银杏（学名：Ginkgo biloba），别名白果、公孙树，属裸子植物，和它同门的所有其他植物都已灭绝，被称为“孑遗植物”。银杏和银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba,EGB）因含有黄酮类、内酯类、酚类等多种活性成分而具有非常重要的药用价值。银杏叶提取物具有体外抑菌作用，抗病毒作用，对机体免疫功能的影响，调节血脂功能，保护胃黏膜、肝脏的作用以及对神经系统的作用14。应激（Stress）是指动物机体受到外界不良因素刺激后，在没有发生特异的病理性损伤前所产生的一系列非特异性应答反应，又称为应激反应。这些刺激因素称为应激原（Stressor）19。当应激超过了个体的承受能力便会导致疾病的发生。许多研究证实了，在癌症、脑血管疾病及心血管疾病等心身疾病中，应激起了相当重要的作用。这是机体面对应激在整体水平上所发生的改变3。热休克蛋白（heat shock protein）又称热应激蛋白（HSP），是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质。HSP的发现首先是在果蝇体内。1962年有人发现，将果蝇的培养湿度从25提高到30，30分钟后就可在多丝染色体上看到蓬松现象，提示这些区带基因的转录加强并可能有某些蛋白质的合成增加。1974年后，人们才从热休克果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到了6种新的蛋白质，即HSP。除环境高温以外，其他应激原如缺氧、寒冷、感染、饥饿、创伤、中毒等也能诱导细胞生成HSP。近来研究表明，HSP的生成，不仅见于果蝇中，而且是普遍存在于从细菌直至人类的整个生物界（包括植物和动物）的一种现象。HSP在进化过程中的高度保守性，说明它们具有普遍存在的重要的生理功能。然而在这方面的研究，迄今还是很不充分。 那么在应激状态下机体在细胞水平又会发生怎样的变化呢？近年来的研究发现表明，热休克蛋白作为一种分子伴侣蛋白，参与了很多不可逆的生物学过程，并在疾病的发生和发展中起到了一定的作用。应激反应是指机体在受到各种内外环境因子刺激时所出现的非特异性全身反应，是生物在长期进化过程中获得的适应性和防御性反应。能够引起应激反应的刺激因素中高温是最主要的应激原之一。热休克蛋白受到高温刺激后产生的具有高度保守性的几族蛋白质，对维持细胞生存和内环境因素的稳定起着重要作用。主要分为HSP90，HSP70，HSP60及小HSP等四个家族，其中HSP70家族是最保守和最重要的一类。HSP70在正常细胞中水平较低，在应激状态下可显著升高，因此成为热休克蛋白中最受关注、研究最深入的一种。HSP作为一类重要的非特异性细胞的保护蛋白，在应激耐受和应激保护中发挥着重要作用。热应激状态下应激蛋白含量的改变与心肌损伤之间的相关性还缺乏试验性研究，但已有报道在应激状态下心肌纤维发生病理损伤的证据。已有研究表明，在受到应激刺激时，细胞HSP70反应的速度和强度是细胞功能状态和抗应激能力良好的重要生物学标志。当细胞暴露于较高的温度时，热休克蛋白会迅速地暂时地诱导出来，以应付高温对蛋白质的破坏，这种诱导作用通常发生在转录水平上。它们的转录因一些特异性转录因子量的增加而增强。大量的研究证实，细胞在正常致死温度下存活的能力与热休克蛋白的累积有关，如体温升高会引起HSP70的表达的增加。 本课题旨在研究检测鸡的重要器官如心脏，肝脏中热休克蛋白如HSP70的表达变化。受试鸡在热应激后不同饲喂方式下HSP70的变化。本试验测定谷丙转氨酶（Cereal third transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspertate aminotransferase，AST）、肌酸激酶（Creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isozyme，CK-MB)、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等血清生化指标,旨在研究银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡对其肝脏的保护作用。本试验还对比了热应激前后HSP70的含量的表达变化，旨在研究其在热应激状态下HSP70的变化对其自身的保护作用。161 材料和方法1.1 实验区概况本项研究在江苏南通文圣特种养殖有限公司进行，基地坐落于江苏省海安县墩头镇，是集里下河水乡风情、绿色生态链式养殖、餐饮、垂钓、农业休闲观光于一体，功能齐全的综合性企业，水陆面积70多亩。生态链式养殖利用畜禽粪便养殖蝇蛆，用蝇蛆投喂家园生态草鸡，本养殖场改变了传统的养殖模式，形成了有自己特色的生态养殖模式。用饲料养猪，畜禽粪便养蛆，再用鲜活蝇蛆喂养畜禽、水产等。以降低饲料成本，提高畜禽、水产的生长速度，同时提高畜禽、水产抗病能力及产品的品质，也更好的解决了家畜、家禽粪便的排放问题，改善了环境。本次实验正是借助于养殖场内的设施，以及专门的养殖人员，科学的饲养管理条件下进行的试验，符合本试验的要求。 1.2 实验材料240只1日龄草鸡雏鸡、高速离心机(sigma 3-18k)、水浴锅(HH-4数显恒温水浴锅)、移液枪（Pipetlite SL-100）、液氮罐（成都液氮容器厂 金凤牌YDS-10）、电子天平（北京赛多利斯天平有限公司产）、分光光度计（UV765 上海精科产）、37恒温箱（常州国华电器有限公司）、标准规格酶标仪（北京普朗新技术有限公司）、鸡热休克蛋白70(HSP70)ELISA试剂盒等。1.3 实验方法 将雏鸡随机分成6组，分别为：A.饲喂普通饲料（对照组），B.饲喂普通饲料+1%蝇蛆粉，C.饲喂普通饲料+0.1%银杏叶提取物，D.饲喂普通饲料+0.3%银杏叶提取物，E.饲喂普通饲料+0.6%银杏叶提取物，F.饲喂普通饲料+1%蝇蛆粉+0.1%银杏叶提取物。在正式试验开始前，先将小鸡进行三天适应性饲养，严格按照鸡场日常饲养标准进行。小鸡前22天饲喂全价颗粒饲料，配以不同浓度的蝇蛆和银杏叶提取物，22天之后饲喂的是自配饲料（即：28%豆粕+62%玉米+5%预混料+5%麸皮）。试验期间自由饮水和采食，试验全程24h/d的光照。试验开始后每天早晚各投料一次，并记录投料量以及次日剩余的饲料量，每一周称量一次体重并记录。及时注意观察各族小鸡的死亡数量并记录。整个试验过程采取正常的饲养管理及免疫程序。1.4 样品采集与检测方法1.4.1 样品采集方法 在严格按照试验要求和饲养管理程序饲养了45天以后，每组随机取25只鸡，采取心脏采血的方式，再随机取10只鸡，把鸡放在40的环境下进行热应激两个小时，然后心脏采血，每只鸡采血4ml放入离心管，随即放入离心机以3000rmp离心10min，用移液枪取上层血清，放入血清管标号并冷冻保存，用于分析谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH），热休克蛋白70等血清生化指标。1.4.2 鸡热休克蛋白70(HSP70)的检测方法 解冻保存冰箱里的样品，用生理盐水洗净后，称取0.15g的组织，加入10倍预冷的匀浆缓冲液，进行匀浆，匀浆液置于4高速离心机中12， 000rpm离心 20min;收集上清液，分装后20保存。为了消除称量和匀浆过程中造成的误差，用相应组织的-actin做内参照，对HSP70做相对定量。HSP70在组织中的定量检测采用ELISA方法，其主要步骤为：(1) 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。(2) 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。(3) 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50L；待测样本孔中先加入待测样本10L，再加样本稀释液40L(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。(4) 温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。(5) 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。(6) 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50L，空白对照孔不加。(7) 温育：37水浴锅或恒温箱温育30min。(8) 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。(9) 显色：每孔先加入显色剂A液50L，再加入显色剂B液50L，平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37避光显色15min。(10) 终止：取出酶标板，每孔加终止液50L，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。(11) 测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。(12) 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。以OD值为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图，根据样品的OD值计算出样品的浓度。每个样品中HSP7O的含量用以下公式进行半定量检测： HSP7O的相对定量=HSP70的含量/-actin的含量。金陵科技学院本科生毕业论文 1.5 数据分析与处理1.5.1实验数据以平均值标准误(Mean S.E)表示；1.5.2采用单因子方差（One-Way ANOVA）分析；1.5.3所有统计分析均使用SPSS16.0统计软件(以P0.05）。b A与C热应激诱导HSP70含量差异不显著（P0.05）。c A与D热应激诱导HSP70含量存在极显著差异（P0.05）。e A与F热应激诱导HSP70含量存在极显著差异（P0.05）。图3 HSP70浓度柱状图注：不同柱状图上标有一个*代表与对照组相比差异显著，*代表差异极显著。2.2 热应激后血清生化指标结果 表1 热应激后血清生化指标项目 A F谷丙转氨酶 3.0000.816 2.6670.577谷草转氨酶 252.00031.591 208.33311.372*肌酸激酶 2458.500188.790 2089.000367.207*肌酸激酶同工酶 990.2597.592 870.33386.558*乳酸脱氢酶 548.00039.149 510.33330.989注：同一行间标有*表示达到差异显著水平（P0.05） 测定的血清生化指标见表1，由以上数据可以看出ALT、AST、CK、CK-MB、LDH的含量相比对照组都有降低，其中AST、CK和CK-MB都达到了差异显著的水平（P0.05）。2.3热应激前后肝脏HSP70含量的变化 表2 热应激前后肝脏HSP70含量的变化 指标 应激前 应激后A 0.0470.005 0.0630.007*F 0.0660.003 0.0960.006* 注：同一行间标有*表示达到差异显著水平（P0.05） 心脏、肝脏和肾脏中HSP70的相对量如表2所示。由表2我们可以看出应激后较应激前肝脏HSP70含量明显增加，A组和F组相比较肝脏的HSP70含量都明显增加。热应激后，肝脏中HSP70的含量逐渐上升。与对照组相比，肝脏中HSP70的含量有显著升高。 3 讨论与分析3.1应激后六种饲喂方式对HSP70的影响HSP70主要分布在心肌细胞、肝细胞和肾小管上皮细胞的胞核与胞浆中，提示HSP70的表达可能与其分布细胞的功能相关。HSP70在心肌细胞的表达增强有利于有机体抵抗外界的有害应激11 。本试验中HSP70在热应激后对心脏和肝脏起到了一定的作用。应激后标本测定的OD值和根据直线回归方程回算的浓度算得的HSP70的含量。根据所算出的浓度平均值我们可以看出六组热休克蛋白含量的变化见图3，X为组别，Y为浓度平均值（ng/ml）。A与B对比，含量有所增加，说明饲料中添加1%蝇蛆粉对热应激诱导HSP70的表达有一点影响但没有达到差异显著的水平；A与C对比，含量增加，说明饲料中添加0.1%银杏叶提取物对热应激诱导HSP70的表达有影响，但是没有达到差异显著的水平；B,C和F对比，F含量最高，说明饲料中同时添加1%蝇蛆粉和0.1%银杏叶提取物对热应激诱导HSP70的表达影响最佳；C,D和E对比，D含量最高，说明饲料中在添加银杏叶提取物对热应激诱导HSP70的表达时，0.3%的浓度是最佳的；D和F对比，F含量高，说明在添加银杏叶提取物对热应激诱导HSP70表达是，加入1%蝇蛆粉效果更好，因为蝇蛆中富含优质蛋白质和氨基酸等，这些营养物质是机体生长和疾病防治的物质基础，可不同程度地对机体的代谢产生影响；A，B，C，D，E和F对比，F含量最高，说明银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡诱导重要器官HSP70有重要影响。根据六组不同分组来进一步探讨哪种饲喂方案对鸡抗应激能力有最佳的影响，对生产实际有一定的指导意义。通过以上实验的分组讨论和分析，我们可以证明，通过对鸡的热应激诱导HSP70的表达研究，在饲料中加入蝇蛆和银杏叶提取物的HSP70明显增高，受试鸡在持续热应激的作用下，心脏大量释放出HSP70以达到自我保护，在六组数据对比中，第六组的HSP70含量最高，可以证明在六种饲喂方案中在饲料中添加1%蝇蛆粉+0.1%银杏叶提取物的组合效果是最佳的。3.2热应激后血清生化指标的影响由表一我们可以看出热应激后血清生化指标含量的变化，对血清生化指标ALT、AST、CK、CK-MB、LDH的测定，其含量都是明显下降，其中AST、CK和CK-MB都达到了差异显著的水平（P0.05）。进一步证明了银杏叶提取物加蝇蛆对鸡有一定的药用价值，增强了对心脏的保护能力，使得心脏相关的血清生化指标明显下降。银杏内酯可改善肝损伤的恢复，显著降低肝脏损伤。杜文华等20试验结果表明PAF是内毒素诱导的肝组织损伤、肝功能障碍的重要物质，银杏内酯B可能是PAF受体拮抗剂，可以对肝损伤起保护作用。李薇等21表明复方银杏叶冲剂具有明显的抗脂质过氧化，减少自由基，保护肝细胞的作用，可阻止间质胶原纤维增生，抑制肝纤维化进一步发展。银杏叶提取物可以有效的保护肝脏，蝇蛆具有很好的营养价值，也可以显著提高对肝脏的保护力，所以银杏叶提取物加蝇蛆对肝脏有很好的保护作用。3.3热应激前后肝脏HSP70变化的讨论HSP70表达的增加可能是机体为了适应外界应激环境而进行的本能反应。HSP70可以帮助细胞内重要的蛋白进行正确折叠，避免降解，从而才能改善细胞生存的能力。在非应激的肉鸡组织中同样也可以检测出HSP70。当机体受到热应激刺激时，组织细胞内原有的和新产生的HSP发挥了重要的保护作用，从而来抵抗热应激引起的损伤，增强机体的热耐受的能力，提高动物的存活率。机体在应激条件下，新陈代谢会加强，消耗许多能量和蛋白质，于是机体需要合成新的物质进行补充，而合成新的物质不仅需要补充大量的能量和原料，而且还需要大量的分子伴侣。所以由表2我们可以看出，应激后HSP发生了显著变化，F组相对A组，HSP的含量都发生显著变化，进一步证明了银杏叶提取物加蝇蛆喂鸡诱导肝脏HSP的表达，可以显著诱导HSP70的表达，进而保护肝脏。 4 小结本次课题的研究具有一定的创新意义，对于热休克蛋白的研究，很多学者大多用老鼠建模型，此次实验用鸡作为实验对象，探讨了银杏叶提取物的药用价值。根据六组不同分组来进一步探讨哪种饲喂方案对鸡抗应激能力有最佳的影响，对生产实际有一定的指导意义，扩大规模化生产，提高经济效益。南京农业大学孙培明，刘雨田，赵永刚等曾研究过肉鸡心脏热应激的损伤和热休克蛋白mRNA转录水平的相关性，南京农业大学于纪棉早前也研究了持续热应激肉鸡组织中热休克蛋白表达规律与应激性损伤机理研究，但对于以不同饲喂方案来研究热休克蛋白的表达较少，此次的实验对我国未来的养鸡业发展际有重要的指导意义，也为今后的规模化生产提供了理论依据，从而推进养鸡行业品牌化树立和运营，向标准化，专业化转变，降低生产成本，提高生产效率，扩增经济效益。参考文献：1李萍, 富青，熊凡. 热休克蛋白70及其在心肌保护中的作用J. 医学综述，2004, 10( 2) : 94- 96.2高锦明, 王蓝, 张鞍灵, 等. 银杏叶中有效成分的研究J. 西北林学院学报, 1995, 10( 4) : 94- 100.3李卫晖, 李凌江, 刘哲宁. 热休克蛋白细胞应激反应的生物标志J. 国外医学精神病学分册, 2002, 29( 4) : 248- 250.4博丰永, 刘永隆, 尚天民, 等. 黄酮类化合物在植物界的分布J. 植物学报, 1980, 22( 1) : 87- 92.5Chen J , Chen W, Huang H. 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