动物基因工程课程论文.doc

青岛农业大学动物基因工程课程论文题 目：转基因动物生物反应器的构建及应用姓 名： 学 院： 动物科技学院 专 业： 班 级： 学 号： 任课教师：闵令江二一一年十月二十三日转基因动物反应器的构建与应用兽医专业 刘朝霞任课教师 指导老师：闵令江摘要: 21世纪是生命科学突飞猛进的时代,生命科学在人类生活中占有极为重要的位置。一是生命科学的发展促进了其他学科的发展;二是生命科学发展带动的产业将推动世纪经济的发展近年来生物学和分子生物学取得的显著进展终于使这种幻想成为现实。基因工程应用技术之一的基因重组，可用于对不同生物遗传物质的体外人工剪切、组合、拼接，使遗传物质重新组合，然后，通过载体，如微生物、病毒等转入微生物或细胞内，进行无性繁殖，并使所需基因在细胞内表达出来，产生人类所需的物质或创造新的物种。根据目的蛋白表达部位的不同可分为乳腺生物反应器、血液生物反应器、卵生物反应器、尿生物反应器、精囊腺生物反应器、唾液腺生物反应器等。关键词： 转基因 分子生物学 生物反应器Transfers animals biological reactor construction and applicationStudent maioring in:Veterinary professional name:liuzhaoxiaTutor name:minlingjiang Abstract：21 century is the life science by leaps and bounds times, life science in human life has very important position. One is the development of life science promoted the development of other disciplines; 2 it is life science development of industry will push to drive the development of the economy of the century in recent years in biology and molecular biology significant progress finally make this fantasy become a reality. Genetic engineering application of the technology of genetic restructuring, which can be used on different biological genetic material of in vitro artificial shear, combined, joining together, make new combination of genetic material, and then, through the carrier, such as microorganisms, virus into the microbial or within cells, for asexual reproduction, and make required in a cell gene expression, produce human needs corporeal or create new species.According to the purpose of protein expression can be divided into different parts of the mammary gland bioreactor, blood bioreactor, eggs bioreactor, urine biological reactor, the seminal vesicle gland bioreactor, salivary gland bioreactor, etc.Keywords: Genetically modified Molecular biology Biological reactor引言：转基因动物技术，它的核心内容是把遗传的功能单位基因转移到动物体内，使它成为动物体内的一部分。被转移的基因可以来自同种或异种动物，也可以来自植物或微生物。这样一来，就打破了物种之间的界线，也可以说动物能与植物、微生物杂交了。不过目前的杂交是低水平的，只限于主管一两个性状的一两个基因。随着科学技术的发展，一次可以转移的遗传信息将越来越多，那时就可以实现真正意义上的动植物之间的杂交。从科学上讲，这将是一个大突破。用微生物、植物、动物或人细胞,或者用专一性酶通过生物方法将原料转化为特定产品的容器称为生物反应器。通常微生物和细胞又涉及如何维持它们的环境以提供最佳的生长条件的问题。1 转基因动物的发展及影响1.1转基因动物的定义 在分子水平或者基因水平的基础上，用人工的手段去改造生物遗传性状的基因工程，出现在20世纪70年代。基因工程应用技术之一的基因重组，可用于对不同生物遗传物质的体外人工剪切、组合、拼接，使遗传物质重新组合，然后，通过载体，如微生物、病毒等转入微生物或细胞内，进行“无性繁殖”，并使所需基因在细胞内表达出来，产生人类所需的物质或创造新的物种。 所谓转基因动物，是用实验方法，把外源基因导入到动物体内，这种外源基因与动物本身的染色体整合，这时外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能传给后代。世界上第一只转基因动物巨鼠，是将大白鼠生长激素导入小白鼠的受精卵中，再将这个受精卵移入借腹怀胎的母鼠子宫中，产下的小白鼠比一般的大一倍。这只在遗传学上具有重大意义的转基因动物的研究培育成功，展现出诱人的光明前景。1.2转基因的主要方法 在分子水平或者基因水平的基础上，用人工的手段去改造生物遗传性状的基因工程，出现在20世纪70年代。基因工程应用技术之一的基因重组，可用于对不同生物遗传物质的体外人工剪切、组合、拼接，使遗传物质重新组合，然后，通过载体，如微生物、病毒等转入微生物或细胞内，进行无性繁殖，并使所需基因在细胞内表达出来，产生人类所需的物质或创造新的物种。近年来，国外已出现了一些基因作物，如抗腐烂西红柿、抗除草剂棉花、抗病毒黄瓜和马铃薯，以及抗虫玉米等。目前，利用基因重组技术能分离出来的目标基因已近百种，在农作物上实现目标基因表达的也已有10多种。1、3 转基因动物的的主要效果及意义1、3、1 对家禽家畜生产的作用 将外源基因导入家畜，能使家畜朝人类希望的目标靠拢，如肉质改善、饲料增效、个体增大、体重增加、奶量提高、脂肪减少等。例如将长瘦肉的基因导入猪细胞中，猪就成为瘦肉型；将促乳汁分泌的基因导入牛、羊细胞中，这些转基因牛、羊乳汁猛增；还有科学家将貂的长皮毛基因导入羊细胞中，培育出长出类似貂毛毛皮的羊。这些羊易养，繁殖快，且羊貂皮面积数倍于貂皮，将使貂皮时装进入寻常百姓家。1.3.2 转基因对动物免疫方面的作用用基因转移技术，增强动物抗病力的研究，也很鼓舞人心。导入抗病或抗寄生虫的外源基因，牛便不怕疯牛病，猪便不怕瘟从而使畜牧业旱涝保收，成为黄金产业。利用转基因动物生产蛋白质、造药，是全新的生产模式。与细菌、细胞等生物工程制药相比，它有明显优势：转基因动物的乳汁，可以方便收集，且不损伤动物；目的蛋白质，已经过动物体内加工和修饰，不必再进行后加工。而以往微生物、细胞等生物工程基因产物，要有后加工。用转基因动物生产，也不需投入大量资金建厂、添设施、雇用人员等。1、3、3 人类最好的器官库。 转基因动物提供从皮肤、角膜，到心、肝、肾等几乎所有的零件。让器官移植专家有充分施展才华的用武之地，让体内部分零部件出了故障的病人重获生的希望。2. 转基因动物反应器的构建及应用2、1目的基因2、1、1高价值基因十多年来，已有数种高价值的产品在大动物乳汁中生产出来，于小鼠乳腺中获得表达的产品更是多达数百种。从国际大公司开发的情况可以看出，高经济价值的医用蛋白和营养蛋白是重要的研发对象，如AT一、AAT、蛋白C、乳铁蛋白、乳糖酶等都已进入了三期或二期临床试验阶段。选择目的基因应当首先考虑那些正常情况下来源困难或浓度低，其他表达系统难以生产且I临床应用前景广阔的蛋白基因。可以预见，由于细胞工程和基因治疗技术的发展，细胞因子类产品将不会通过动物乳腺反应器生产，而用途更广、需求量更大的治疗性抗体、营养蛋白和工程酶将成为制备乳腺生物反应器的首选靶蛋白。2、1、2工程疫苗另外，若能建立起稳定的转基因家畜群，以乳腺反应器生产基因工程疫苗，不仅生产效率可观，而且可直接以乳汁进行临床免疫，达到方便快捷的目的。2、2转基因的技术路线 转基因动物还将是人类最好的器官库，提供从皮肤、角膜，到心、肝、肾等几乎所有的零件。让器官移植专家有充分施展才华的用武之地，让体内部分零部件出了故障的病人重获生的希望。2.2.1同源组织中表达蛋白质 目前，在同源组织中表达蛋白质最典型的例子是在动物的红细胞中表达人的血红蛋白。在人的血红蛋白基因编码序列里启动子有2个CACCC盒，而对应的猪的启动子里只有一个，另一个靠近它的是CGCCC盒。Sharma等1将猪的-启动子与人的编码基因融合，并将人的-基因座调控区（-LCR）和、基因与融合基因的基因连接在一起构成载体，转入猪胚胎细胞，从转基因猪分泌乳汁中得到的重组人血红蛋白含量高达32g/L。 2、2、2在转基因动物的分泌器官中生产蛋白 转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。在这些表达器官中，通过构建合适的载体，选择适当的启动子和调控序列可产生比正常水平高得多的重组蛋白。不过，生产系统应尽可能与循环系统隔离，以减少表达产物对宿主动物的影响。2、2、3 乳腺生物反应器 乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌生物活性高，无污染。（2）易分离提纯，成本低廉。现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。 -乳球蛋白 在实验过程中人们发现牛的-乳球蛋白（BLG）基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达。Hyttinen等3将含有5端2.8kb和3端1.9kb的牛BLG基因片段构建成载体，转入小鼠胚胎细胞，可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的BLG，此外，还发现CpG位点的甲基化程度与BLG的表达量有关，甲基化少的转基因小鼠乳液中BLG分泌量较大，可达12mg/ml，而其他转基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。 抗凝血酶 第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶，将半乳糖-酪蛋白的启动子和含抗凝血酶基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达7g/L2。目前该蛋白正用于冠状动脉旁路手术患者的二期临床验证。 红细胞生成素（EPO） 目前国内外均采用CHO细胞表达生产人EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的EPO，可能是一条理想的途径。将EPO dNA分别以Hind和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收5.4kb的Hin/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通过显微注射方法得到转基因小鼠乳汗中的EPO含量可达0.5g/ml4。 1-抗胰蛋白酶 这也是一个利用B LG基因构建的重组蛋白。将BLG5末端4.0kb序列与人的1-抗胰蛋白酶（1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊的BLG启动子，以pPOLY-为载体，转入羊的胚胎细胞，可在转基因羊分泌的乳液中得到含量高达60.0mg/ml的重组蛋白1AT5。转基因在两年前进入了临床验证。 因子 Schnieke等6将羊的BLG基因5末端和人的因子 cDNA 与含有BLG复制单元和3末端的片段融合，将构建的杂合基因转入羊的胚胎细胞，从分泌的乳汁中得到125g/ml的重组蛋白。因子 人FcDNA长约7.2kb，是目前为止表达的最长cDNA。将它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中启动子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌F重组蛋白。在WAP/FcDNA构建的转基因小鼠中rF表达最低，而在转基因猪中可达1.02.7g/ml9。 单克降抗体 Castilla等10将编码了重组单克降抗体（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因组的第一个外显子，使rMab 6A.C3的表达可以由WAP基因调控序列来控制，将构建的杂合基因注入小鼠胚胎细胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的单克降抗体，这种转基因表达产物将广泛应用于预防新生儿肠道感染。 C蛋白 同样在WAP基因的第一个外显子位点，Drews等11将人C蛋白cDNA插入，转入小鼠胚胎细胞，可得到产量达1.6mg/ml的重组蛋白。而将上述杂合基因转入猪的胚胎细胞，可使猪分泌出380g/mlg/mlhr的外源蛋白，活性与人血浆中C蛋白的活性相同。 2.2.4膀胱生物反应器 膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。此外，该系统可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。 膀胱生物反应器多用Uroplakin启动子启动人生长激素（hGH）的表达，产生 hGH特异性的高丰度RNA，这些RNA与蛋白分泌量高度相关。Uroplakin基因在多种哺乳动物体内有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。 生长激素 Kerr等12将pUPII-LacI用质粒的Kpn i进行消化，用T4DNA多聚酶切去3端，然后用BamHI消化，分离出3.6kb的5端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反应器特异性表达所需的大部分序列。将此片段与位于无启动子的pOGH质粒纯化SaI和BamHI位点间的hGH结构基因的5端连接，得到pUPII-hGH质粒，能表达该质粒的组织分布有限。2、2、5应用以动物的乳腺或其它组织作为生物反应器生产贵重的医用蛋白，是动物转基因技术的另一特殊形式。由于转基因动物的遗传结构发生了变化，并能稳定地遗传给后代，外源基因不仅能在转基因动物得到整合和表达，而且能获得组织特异性（乳腺组织）和发育特性（妊娠后期和泌乳期）表达，利用这一点能产生转基因泌乳家畜，还能生产出目前短缺而又十分珍贵的医用蛋白。近十年，这方面的研究在英、美、法、瑞士和荷兰等国家已相继展开，并取得了一定进展。截至目前，世界一些国家的生物技术企业在利用转基因动物作生物反应器研究开发的转基因动物药品有以下几种。组织纤溶酶原激活剂(TPA)：由美国遗传技术公司(Genentech) 用基因重组技术开发的血栓溶解剂，1987 年11 月经联邦食品及药物管理局(FDA)批准上市。1988 年的销售额为1.5 1.6 亿美元，1989年为1.8 1.9 亿美元。今后每年的市场销售额约为2 2.5 亿美元。 乳铁蛋白(lactoferrin): 用转基因奶牛生产。由于以转基因奶牛生产乳铁蛋具备产量高、成本低，以及有无限量增殖生化反应器等特征，因而备受各国瞩目。乳铁蛋白是一种口服的活性蛋白，自然产生于人乳中，它具有抗菌、传递铁素等特性。 人类-1 抗胰蛋白酶(AAT)：-1 抗胰蛋白酶(AAT)缺乏是最常见的遗传代谢病，能引起肺和肝的损伤。-1 抗胰蛋白酶(AAT)为呼吸系统的非特异性可溶因子，它可抑制多种酶的活性，包括细菌的酶，以及中性白细胞溶酶体分泌的蛋白质、弹性蛋白酶、胶原酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶。促红细胞生成素(EPO)：以转基因猪生产。这种药物存于转基因猪的血液中。目前转基因猪血球素合成的遗传控制机制已十分清楚，用基因重组技术合成的EPO 已在多个国家上市。 重组人抗凝血酶ii（i atryn）:世界上第一个动物乳腺生物反映器重组蛋白药物。Atryn的主要成分-重组人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。3讨论 自20世纪80年代以来,转基因技术产业蓬勃发展,为人类解决人口膨胀、食物缺乏、能源匮乏、品种改良、疾病防治和环境污染等问题带来了新的希望。特别是在农牧业、医药、食品等方面体现出了巨大的经济和社会效益。随着转基因生物的商品化、生产规模化，转基因技术研究手段、装备水平不断提高，基因克隆技术突飞猛进，新基因、新性状、新方法和新产品不断涌现在转基因动物生物反应器的应用中，同时，还有很多问题尚待解决，由于对调控表达水平的程序，指导进行精确的组织特异性和发育调控表达的程序，以及调控和编码内含子序列间可能的相互作用的认识尚不充分，容易引起异位点表达；由于现在的技术还不能控制整合的位点，因此存在对内源基因进行插入诱变的可能性，转基因型的表达会受整合的不同位点的影响。这些因素使得在家畜长成前，要用小鼠对新基因构型进行常规试验。 4 致谢 转基因技术已经在人类的日常生活中不断地应用，在未