从人尿液样品中获得诱导性多能干细胞(iPSCs)---中午翻译.pdf

|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols从人尿液样品中获得诱导性多能干细胞（iPSCs）TingZhou17ChristinaBenda17SarahDunzinger2YinghuaHuang1JennyCyHo3JiayinYang1YuWang1YaZhang1QiangZhuang1YanhuaLi1XichenBao1Hung-FatTse35JohannesGrillari26ReginaGrillari-Voglauer26DuanqingPei1MiguelAEsteban1451中国广州中科院再生医学重点实验室，广东省干细胞和再生医学重点实验室，华南干细胞和再生医学研究所，广州生物和医药健康研究所。2奥地利维也纳自然资源和生命科学大学生物技术系衰老和永生化研究小组。3中国香港大学李嘉诚医学院玛丽医院医学系心脏病学研究组。4香港大学广东干细胞和再生医学研究中心。5中国广州生物医药和健康研究所。6奥地利维也纳Evercyte公司。7这些作者对本工作具有同等贡献度。通讯联系为M.A.E.().年月日出版发行doi:10.1038nprot.2012.115摘要：人诱导性多能干细胞（iPSCs）已经以不同的效率从从多种组织中获得。大多数情况下，供体细胞还是在实验室中以有损伤性的手段获得。这里，我们详细描述了一种从尿液中出现的脱落的肾上皮细胞获得人iPSCs的流程。这种方式有多方面的优势，比如分离尿液来源的细胞简单（30ml尿液即足够）；成本较低且具有普遍性（适用于各个年龄、性别和种族）。并且，整个流程比较高效尿液分离培养约周，重编程周；iPSCs克隆形成能力一般较高使用逆转录病毒携带外源基因的方式效率可上升到。尿液来源iPSCs（iPSCs）亦显示出良好的分化潜能，因此是从健康个体或者具有遗传性疾病个体包括肾脏疾病患者获得多能性细胞的较好的选择。介绍：自从年，Takahashi和Yamanaka取得的里程碑成就之后（参考文献），将体细胞转换成胚胎（）样细胞亦称为重编程就吸引了大量的注意。这项技术在很多方面都具有显著的应用价值，从体外疾病建模到临床移植上的潜力以及其他，但是一系列的鉴定事宜却对这个技术提出了质疑（尤其是突变，拷贝数变异，表观遗传突变和免疫原性）。为了评估这个问题的普遍性，研究不同供体细胞来源的iPSCs是否具有不同特征就显得尤为重要了。重编程不同胚层（内胚层，中胚层，外胚层）来源的细胞有益于更好的理解改变细胞命运的分子机制，这些知识将随之提高相关技术。为了这个结果，包括我们实验室在内的多个实验室已经系统性的重编程了多种细胞类型，包括皮肤成纤维细胞，角质细胞，黑色素细胞，脂肪干细胞，外周血细胞，骨膜和牙周韧带，神经干细胞，肝细胞，羊水细胞和来自胚胎外组织的细胞（脐带血和基质，胎盘羊膜和绒毛膜间充质干细胞（），以及其他。任何一种重编程的方法都需要大量的细胞，因此出现了一系列的问题。这其中我们提到最多的一个就是捐献样品的人不愿意经受有损伤性的实验过程。血液是相对比较容易的样品|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols来源，但流程依旧是有损伤的27。使用发囊虽然比较容易得到，但严格意义上来说也不能认为是无创的。也有多种组织可以利用完成无创的方式得到。胚胎外的组织有多种细胞类型可以高效的作为iPSCs细胞来源，例如脐带血，但是只有在新生儿出生的时候才会得到，除非被保存完好。此外，即使在多个国家脐带血细胞已经被保存，但这个流程依然较昂贵且不具有普遍性。总所周知，尿液的产生是在任何年龄、任何性别和种族中一个重要的生理代谢过程，因此除了肾衰竭之外的其他任何情况都可以去收集尿液样品。那么，我们就设想，如果这个流程能够实现，分离得到的尿液中脱落的细胞可以作为无创重编程的绝好细胞来源。尿液作为获得多能性细胞尿液作为获得多能性细胞的来源的来源哺乳动物的泌尿道器官由两个肾脏、两个输尿管、膀胱和尿道构成，它通过控制液体和电解质的排泄来维持稳态功能。除此之外，对于维持酸碱平衡和适当的生理血压是必不可少的30。肾脏基本的结构和功能单位是肾单元，从肾皮质延伸至肾髓质的一个管状结构31。肾单元的基本结构是肾小体，过滤肾血循环的血液供应。因此，据估计人类肾脏有超过一百万个肾单元，每天会产生大约100毫升的过滤液30。但是，这些液体的大多数在肾单元的远端部位被重吸收，通常每天只有大约2升的液体作为尿液通过尿道排出。那么，不出意外，由于大量的管状结构的作用，每天有2000-7000个细胞从这个系统脱落并在尿液中被收集32。Suther-land和Bain首次报道成功培养了尿液来源细胞33，随后多个小组重复了此过程3234-40。这些细胞是上皮样的，但是形态却更标准且偏细长323740。通过基因表达谱说明大多数细胞起源于肾脏上皮组织，但也能发现泌尿道来源的细胞32。令人瞩目的是，Zhang和他的同事从尿液中分离鉴定出了一个表达干细胞标志物且具有多向分化潜能的细胞亚群4142。实验设计实验设计我们开始改编了一种简单、高效、经济（唯一的耗费是培养基）的尿液样品收集和细胞扩增的方法。从57个样品中，我们首次尝试就成功分离了42个样品的原代细胞。其中30例男性样品出现了1例污染，27例女性样品中出现4例污染现象。我们又对这5个样品进行了第二、三、四次的分离尝试从而建立了原代培养。这意味着整体成功率达到了82%。随后，我们用逆转录病毒载体优化了目前的重编程过程，设计了一个流程使得我们大多数分离的尿液细胞都能成功重编程获得UiPSCs（尿液来源诱导性多能干细胞）43。尿液细胞分离的初始培养基含有10%（体积比）的胎牛血清（FBS）从而增强原始细胞的贴壁和存活能力。至于尿液细胞的扩增，我们使用在之前研究中提到的RE（肾脏上皮细胞）扩增培养基43。目前，我们使用REMC（肾脏上皮细胞间充质细胞）扩增培养基（见材料，试剂准备和补充材料表格1）也成功培养了尿液细胞。这两种培养基中尿液细胞均生长较好，但后者显示出更强的扩增速率。通常，在培养数天后我们可以观察到每孔3-10个小的克隆（12孔板），和供体的性别无关。在细胞第二代前的2-3周的培养可以使得细胞总量达到约100000-200000。与之前的报道一致323740，尿液细胞克隆通常显示两种细胞类型为型和型（图1）。型细胞外形更加规则，边缘轮廓光滑，鹅卵石样的细胞形态，型细胞边缘则无规则。型细胞与型细胞相比增殖更快。根据我们的经验，在一次样品收集中两种细胞类型都会出现，但通常只有一种细胞会比较丰富。培养过程中型细胞的富集频率稍多于型细胞。同一个体的不同分离培养过程也会出现型或型细胞的富集现象。根据信使RNA和免疫荧光染色分析两种细胞类型都表达相似的上皮细胞的标志物，即使后者的强度在型细胞中更加明显一些（补充资料表格2）。与之前的报道一致3240型和型细胞亦均表达肾脏上皮细胞的标志物（补充资料表格2），但是我们没有检测到泌尿道上皮细胞的标志物尿路蛋白的表达。|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols根据我们的经验，第1和2代细胞（后者更是）是有足够数量用来逆转录病毒感染的，此代次的感染保证了iPSCs的产生效率。根据我们的流程，在被感染细胞分开24小时之前，应该开始进行用逆转录病毒载体转染人胚肾（HEK293T）细胞来制造外源转录因子（框1）。包含高浓度滴度逆转录病毒的上清液的制备对于重编程的成功是至关重要的。我们推荐使用绿色荧光蛋白载体指示转染和感染的效率。图图11收集后不同时期尿液细胞的形态。（aa）新鲜女性尿液样品主要包括鳞状细胞和少量的血液细胞（箭头方向）。（bb）新鲜男性尿液样品主要含有少量的血液细胞（箭头方向）。（cc-hh）第4天（cc，dd），第9天（ee，ff）和第12天（gg，hh）时型（cc，ee，gg）和型（dd，ff，hh）细胞克隆（箭头方向）。典型的图片如aa-hh所示；比例尺，400微米。框框11逆转录病毒制造逆转录病毒制造时间：约一周时间：约一周1.感染尿液细胞5天前复苏一管人胚肾293T细胞。将293T细胞小球计数，用293T细胞培养基接种到100毫米培养皿中约2X106个细胞，37培养细胞。2.2天后，细胞应有90%汇合度。然后，吸去培养基，用10毫升的缓冲液轻轻洗涤培养皿一次，吸去缓冲液加1.5毫升（质量体积比）的胰酶。37孵育2分钟，轻轻晃动培养皿确|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols保细胞全部分离。关键步骤：为了逆转录病毒高效产出，健康的人胚肾293T细胞是必须的。3.用9毫升人胚肾293T细胞培养基冲洗培养皿，收集液体至50毫升离心管中。4.室温200g离心混合物3分钟，弃上层液体。5.用10毫升人胚肾293T细胞培养基重悬，使用血球细胞计数仪或自动化细胞计数仪计数。6.用10毫升人胚肾293T细胞培养基接种4X106个细胞到100毫米培养皿中，37培养24小时。关键步骤：根据增殖效率（主要取决于血清批次）和预期的转染时间调整细胞接种数目。这比较重要，否则人胚肾293T细胞会出现较低的汇合度或者由于较高汇合度在转染后出现分离。培养过程中不要加入抗生素，其会降低转染的效率。7.接种人胚肾293T细胞24小时后（应当达到80%汇合度），根据制造说明为转染准备脂质体2000DNA复合物。100毫米培养皿，使用相同的20ug的pMXs载体，20ug的pCL-Eco包装载体和45ul的脂质体2000。除了OCT4SOX2KLF4和c-MYC之外，我们亦加入了pMXs-GFP作为观察转染效率的单独对照。因此，需要5个不同的培养皿。！警告：使用级（或更高）生物安全柜，处理病毒要认真小心。8.逐滴轻轻地加脂质体2000DNA复合物，并使其分布均匀，37过夜孵育。9.转染后12小时，轻轻地移去培养皿中转染培养基，加10毫升新鲜293T细胞培养基，37过夜孵育。关键步骤：在293T细胞转染24小时后分离尿液细胞，再过24小时后它们将完成一个逆转录病毒转染周期。关键步骤：在显微镜下检查pMXs-GFP信号强度，确保将近100%的293T细胞转染成功。10.转染后36小时，使用自动移液管小心收集每个转录因子的病毒上清液（约10毫升）并转移到15毫升离心管中。轻轻地加10毫升新鲜293T细胞培养基到每一个培养皿中。！警告：小心地滴加培养基到皿的边缘，防止细胞分散。11.使用0.45微米的注射器式滤器过滤病毒上清液。12.感染前加聚凝胺到病毒液中（终浓度为8微克每毫升）。这些病毒液已经可以用来感染尿液细胞（第一感染周期；主过程的步骤19）。13.24小时后，同上述步骤10-12（本框）再次收集病毒上清液，处理掉293T细胞。这些病毒液用来对细胞进行二次感染（主过程的步骤21）。暂停点：病毒液4可以保存24小时。这对于没有协调好用来感染的细胞和病毒液来说是非常有用的，但是病毒感染效率会有部分损失。材料材料试剂尿液（见试剂准备）警告：适当的提示志愿者签署知情同意书。洗涤缓冲液（见试剂准备）。磷酸盐缓冲液（DPBS）。两性霉素B溶液青霉素链霉素溶液原代细胞抗生素0.1%（质量体积比）明胶溶液初始培养基（见试剂准备）RE扩增培养（见试剂准备）MC扩增培养（见试剂准备）|VOL.7NO.12|2012|natureprotocolsREMC扩增培养（见试剂准备）高糖DMEMHamsF-12营养添加剂肾上皮细胞生长培养基（REGM）套装添加剂和生长因子胎牛血清（REGM）快速套装谷氨酸盐非必须氨基酸重组人成纤维细胞生长因子重组人血小板生长因子-AB牛血清白蛋白0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂胰酶替代物尿液细胞鉴定抗体尿液细胞定量RT-PCR鉴定引物尿液细胞冻存培养基HEK293T细胞HEK293T细胞培养基0.05%胰蛋白酶人OCT4(法定命名：POU5F1)SOX2KLF4和c-Myc(法定命名:MYC)pMXs逆转录病毒载体制备本实验室准备生产GFP的pMXs质粒脂质体2000聚凝胺丝裂霉素C丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）CF-1小鼠MEF培养基人ESC培养基人dFBS培养基人ESCdFBS培养基DMEM营养物质混F12基因敲除血清替代物巯基乙醇警告：吸入和皮肤接触有毒，小心操作。mTeSR1基础培养基mTeSR15X添加剂mTeSR1培养基丙戊酸中性蛋白酶人ESC标准Matrigel胶细胞低温储藏培养基CS10液氮设备|VOL.7NO.12|2012|natureprotocolsa级，A2生物安全柜a系，水套CO2恒温箱，设置37，5%CO2。相差倒置组织培养显微镜，荧光显微镜，X5，X10，X20镜头。配有15和50毫升离心管转子组织培养离心机。移液管套装电动移液器100毫米细胞培养皿24、12、6孔细胞培养皿细胞计数器或血球计数板0.22和0.45直径滤膜滤头10、50毫升注射器10、50毫升移液管冻存管试剂准备尿液与其他细胞来源相比，尿液细胞的收集是比较快速的过程。如有可能，在收集前让捐献者尽可能的多饮水，约1升。同样需要建议他她再收集之前，迅速用湿巾擦拭尿道区域。前段尿液应当弃去，收集中段尿道容器中。关键：为了提高细胞存活率，不应该收集初次排尿40。对于大部分人来说，30毫升的尿液即可有效收集尿液细胞，但提高尿液体积则会高产。洗涤缓冲液洗涤缓冲液是添加有100U每毫升青霉素、100微克每毫升链霉素和500纳克每毫升两性霉素B的DPBS。制备500毫升的缓冲液，加2.5毫升青霉素链霉素和1毫升两性霉素B，用DPBS补充至500毫升。原代细胞抗生素可替换青霉素链霉素和1毫升两性霉素B的添加。4保存，几周内用完。初始培养基初始培养基包括1:1的高糖DMEM和HF12，添加10%FBS、100U每毫升青霉素、100微克每毫升链霉素、REGM套装添加剂和2.5微克每毫升两性霉素B。配制500毫升培养基，加50毫升FBS2.5毫升青霉素链霉素，1毫升两性霉素B和1支REGM套装添加剂，用一半高糖DMEM和一半HF12补充至500毫升。关键用初始培养基仔细冲洗各添加剂管子避免损失。警告：避光4保存，2周内使用。RE扩增培养基配制500毫升培养基，将套装中整支REGM添加剂加入RE细胞基础培养基中。警告：用RE扩增培养基仔细冲洗各添加剂管子避免损失。关键避光4保存，2周内使用。MC扩增培养基MC扩增培养基含有高糖DMEM，添加10%FBS、1%谷氨酰胺、1%NEAA、100U每毫升青霉素、100微克每毫升链霉素、5纳克每毫升bFGF、5纳克每毫升PDGF-AB和5纳克每毫升EGF。配制500毫升培养基，加50毫升FBS5毫升谷氨酰胺，5毫升NEAA2.5毫升青霉素链霉素，100微升bFGF，250微升PDGF-AB，50微升EGF。0.22微米滤头过滤，用高糖DMEM补充至500毫升。关键避光4保存，2周内使用。REMC扩增培养基RE和MC培养基1:1比例混合。配制500毫升培养基，将250毫升MC扩增培养基和250毫升RE扩增培养基混合。关键避光4保存，2周内使用。HEK293T培养基高糖DMEM，添加10%FBS、1%谷氨酰胺。配制500毫升培养基，加50毫升FBS5毫升谷氨酰胺，用高糖DMEM补充至500毫升。避光4保存，几周内使用。MEF培养基MEF培养基含有高糖DMEM，添加10%FBS、1%谷氨酰胺、1%NEAA、100U每毫升青霉素、100微克每毫升链霉素。配制500毫升培养基，加50毫升FBS5毫升谷氨酰胺，5毫升NEAA，2.5毫升青霉素链霉素，用高糖DMEM补充至500毫升。避光4保存，几周内使用。人ESC培养基人ESC培养基是含有F12的DMEM，添加有20%KSR，1%NEAA、100U每毫升青霉素、100微克每毫升链霉素、100uM-巯基乙醇和10纳克每毫升bFGF。配制500毫升培养基，加100毫升KSR5毫升谷氨酰胺，5毫升NEAA2.5毫升青霉素链霉素，500微升的-巯基乙醇，200微升bFGF。0.22微米滤头过滤，用DMEMF12补充至500毫升。关键避光4保存，2周内使用。人dFBS培养基人dFBS培养基含有高糖DMEM，添加20%dFBS、1%谷氨酰胺、1%NEAA、100U每毫升青霉素、|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols100微克每毫升链霉素、100uM-巯基乙醇和10纳克每毫升bFGF。配制500毫升培养基，加100毫升dFBS5毫升谷氨酰胺，5毫升NEAA2.5毫升青霉素链霉素，500微升的-巯基乙醇，200微升bFGF。0.22微米滤头过滤，用高糖DMEM补充至500毫升。关键避光4保存，2周内使用。人ESCdFBS培养基ESC和dFBS培养基1:1比例混合。配制500毫升培养基，将250毫升ESC扩增培养基和250毫升dFBS扩增培养基混合。关键避光4保存，2周内使用。mTeSR1培养基mTeSR1基础培养基和mTeSR15X添加剂。配制500毫升培养基，将整支添加剂加入mTeSR1基础培养基中。关键避光4保存，2周内使用。中性蛋白酶将中性蛋白酶溶于DF12中，终浓度为1mgml，0.22微米滤头过滤。10ml分装，-20可保存6个月。丙戊酸将丙戊酸溶于DF12中，终浓度为200mM，0.22微米滤头过滤。500-1000ul分装，-20可保存6个月。明胶包被培养皿加入适当体积的1%明胶到培养皿中。确保整个皿底面有液体覆盖，37孵育30分钟。使用前吸走明胶，用洗涤缓冲液冲洗一次。Matrigel胶的制备和包被4缓慢过夜溶解Matrigel胶。使用预冷的管子以0.25ml分装，-80可保存6个月。制备Matrigel胶包被培养皿，0.25mlMatrigel胶置于冰上1-2小时融化，用预冷的移液管溶于25ml预冷的DF12；将Matrigel胶加于培养皿中（6孔板1个孔加1ml即可）37孵育1小时。使用前吸走Matrigel胶，用DF12冲洗一次。关键Matrigel胶整个过程中保持低温，否则将凝固。MMC处理MEFs细胞准备MMC，将2mgMMC溶于2OO毫升MEF培养基中，0.22微米滤头过滤。MMC在4可保存2周或-20可保存2个月。灭火MEF细胞，细胞（从怀孕13.5天CF-1雌鼠分离）在MEF培养基中生长到第3代时，每个100mm培养皿中加10mlMMC孵育2-3小时。灭活后用洗涤液冲洗细胞3次，0.25%胰酶消化后计数。室温（20-22）200g离心10分钟，用MEF培养基将细胞铺在明胶包被的培养皿中，37培养。细胞亦可在-80或液氮中冻存数月。生长因子补充按照下述浓度溶解所有生长因子于含0.1%BSA的DPBS中：EGF50ugml，bFGF25ugml，PDGF-AB10ugml。警告：4保存，1周内使用。长期保存（至多6个月），分装-80保存。步骤步骤尿液样品收集尿液样品收集时间：约时间：约1010分钟分钟1.用试剂准备所述的合适容积的容器收集尿液（补充资料图1）。关键步骤：容器必须无菌；我们推荐使用一次性塑料密封产品（补充资料图1）。暂停点：尿液中异常的渗透压、低PH值和有毒的代谢物对于细胞来说是不利的环境（例如长期吸烟者），如处理不当会产生污染的风险。最佳情况下，尿液收集后应立即分离细胞。如不可避免的需要推迟，将样品放置4（如冰上）条件可以保持一定时间的细胞活力。就这一点而言，我们已经成功从低温放置4小时的样品中分离细胞。分离尿液分离尿液时间：约时间：约3030分钟加培养时间分钟加培养时间2.将尿液样品转移到50ml离心管中（补充资料图1）。警告：这个以及接下里所有涉及到细胞操作的步骤都应该在组织细胞培养的环境中进行，从而避免污染。3.室温400g离心10分钟。4.小心弃上清，管中剩1ml。5.小心单独重悬剩余1ml尿液样品，收集它们（如有多管尿液）到另外50ml离心管中。6.加10ml缓冲液（补充资料图1）。7.室温200g离心10分钟。8.小心弃上清，管中剩约0.2ml细胞团。|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols9.加1ml初始培养基重悬细胞团，转移液体到12孔板的1个孔（预先包被0.1%明胶；补充资料图1）。细胞形态应和图1a、b所以相似。关键步骤：明胶包被培养皿提高了初始细胞贴壁的数目，对于随后传代依然重要。关键步骤：与男性样品相比，女生尿液样品通常含有较多尿沉渣。这主要是含有的鳞状细胞（可能来源于尿道）不能贴壁（图1a）。男性和女性样品中偶尔可见少量血液细胞（通常为红细胞），尤其供者年龄较大者（图1a、b）。这些细胞通常在步骤12弃培养基时会消失。10.加1ml初始培养基，37培养24小时。尿液细胞扩增尿液细胞扩增时间：约时间：约22周周11.接下来3天每天加1ml初始培养基（即铺板后24、48、72小时），这个或者其他体积根据12孔板调整。勿移走任何培养基。12.约铺板后96小时，移走大部分培养基（此时约4ml），剩余1ml，加1ml扩增培养基。13.每天半量换液扩增培养基。警告：如果样品来源比较适用于重编程实验（例如，关于供体组织表观记忆的对比研究44），我们建议当细胞总数达到100000-200000时进行细胞分选，从而获得同源的肾上皮细胞群，如其他所述4546。关键步骤：小的克隆团（约2-4个细胞）在铺板后72-120小时（3-5天）会出现且生长平稳（图1c，d）。通常，我们观测到每孔3-10个克隆团，与供体性别无关。通常观察到克隆细胞形态为标准型（型）或细长型（型）（图1c-h）。基于免疫荧光和基因表达分析（见介绍部分的讨论和补充资料表2）说明两种细胞类型都含有肾上皮细胞。14.每天显微镜下观察细胞继续培养知道细胞80-90%汇合度。？疑难解答15.当尿液细胞稠密可传代时（80-90%汇合度；铺板9-12天），消化细胞到12孔板1个新的孔继续扩增，这是P1代。细胞能较好耐受0.25%胰酶，但我们不使用含有血清的培养基终止消化而是使用胰酶抑制剂。基于同样目的亦可选胰酶替代物。继续培养细胞，隔天换液。如果此时细胞量足够（计数评估约100000个细胞）也可以消化铺到6孔板的1个孔，直接用来感染（步骤17）。关键步骤：不要使培养皿细胞过于致密，否则传代后将降低细胞活性。16.当细胞达到80-90%汇合度时，按照1:4的比例消化传代细胞到合适的培养皿中继续扩增或者铺到6孔板感染（步骤17）。这是P2代，如果需要，按照此方式继续传代。关键步骤：能达到最高的iPSCs产生效率的尿液细胞为P1-P3代，尤其是老年或者疾病个体。与型细胞相比型细胞在靠后代次亦可较高效重编程。关键步骤：尿液细胞寿命在两种克隆类型之间不同。型细胞在P5代左右即停止扩增，然而型细胞却可培养到P10代。暂停点：或者，为后续使用尿液细胞可-80或者液氮冻存。此时，用不含血清的1ml细胞冻存液重悬细胞。逆转录病毒感染和逆转录病毒感染和UiPSCsUiPSCs获得获得时间：时间：33-44周周17.6孔板每孔铺60000个尿液细胞（P1-P4），或再复苏1支（这种情况是为了增加一些细胞，因为会有细胞死亡）37培养24小时。18.接种后24小时（图2a）观察尿液细胞汇合度约30%。移去培养基每孔加2ml新鲜RE扩增培养基。19.每孔每个转录因子加2ml病毒过滤液。因此，使用Yamanaka四因子时总体积将为8ml。37|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols培养细胞。此为感染后第0天（图2a）。20.12-16小时后，移去培养基，每孔加2ml新鲜RE扩增培养基让细胞恢复8-12小时。21.重复步骤19进行二次感染37培养12小时。22.二次感染后12小时，移去培养基加新鲜RE扩增培养基。继续培养，每天换新鲜RE扩增培养基。使用荧光显微镜检查pMXs-GFP病毒表达确定感染效率。感染后72小时确保将近100%细胞GFP阳性。两种细胞类型型和型都能有效感染（图2b）。？疑难解答图图22逆转录病毒感染和UiPSCs获得。（a）使用尿液细胞（UCs）重编程的机制原理示意图和4个外源因子。相差显微镜展示典型阶段，SKOM代表SOX2KLF4OCT4和c-MYC。（b）GFP病毒感染后第3天（D3）尿液细胞典型的相差图片和免疫荧光图片。型和型尿液细胞都能高效感染。比例尺，200um。23.每天显微镜检查被感染尿液细胞。四因子感染的尿液细胞会显示较大的形态变化（形态变小，细胞更加紧密），二次感染后2-3天扩增能力提高（图2a）。关键步骤：感染后尿液细胞可能会变衰老，这种情况形态改变将不明显，此时实验应当终止。早期代次的尿液细胞提高了克服衰老障碍的机会。另外，型细胞增殖较快，通常能较好耐受感染过程。？疑难解答24.如果感染的尿液细胞形态改变和增殖比较明显，使用MEF培养基铺4X106个处理过的MEF细胞明胶包被的100mm培养皿中作为UiPSCs诱导的滋养层细胞。关键步骤：滋养层细胞只能在感染的尿液细胞分盘前1-2天铺板（步骤25-28）。25.当尿液细胞达到80-90%汇合度时（通常感染后3-5天），如果形态改变明显，0.25%胰酶消化，10ml的人ESCdFBS培养基重悬。26.室温200g离心5分钟。27.4ml的人ESCdFBS培养基重悬，计数。28.移去步骤24中准备的滋养层细胞的培养基加8ml的人ESCdFBS培养基。然后，每100mm培养皿铺5X104-1X105感染后尿液细胞，37培养。|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols图图33UiPSCs显示较强的分化潜能。（a-c）生长在feeder和Matrigel胶上典型的UiPSCs形态对比照片，feeder上UiPSCs碱性磷酸酶（AP）染色。（d，e）UiPSCs使用抗SSEA-4和Nanog抗体典型的免疫荧光模式图，细胞核使用DAPI复染。（f）UiPSCs产生的拟配体（EB）典型的相差图片。（g-i）注射UiPSCs到免疫缺陷的小鼠体内产生的畸胎瘤的典型图片。切面用苏木精伊红染色。（j-l）UiPSCs分化得到的肝脏细胞样细胞、心肌细胞样细胞、多巴胺神经元样细胞的典型免疫荧光图片。使用抗体为肝细胞样细胞的抗AAT（1-抗胰蛋白酶）抗体、心肌细胞样细胞的抗c-TNT（2型肌钙蛋白T）抗体、多巴胺神经元样细胞的抗TH（酪氨酸羟化酶）抗体和抗-TUJ1（微管蛋白）抗体。细胞核使用DAPI复染。关于这些特征是怎么操作的进一步信息能够在参考文献43、54（展示a-c）和43、55（d-l）中找到。比例尺，100um。29.2天后，吸去培养基，加新鲜的人ESCdFBS培养基和丙戊酸钠（终浓度1mM）。继续培养细胞7天，每天换液为新鲜的人ESCdFBS培养基和丙戊酸钠（终浓度1mM）。关键步骤：丙戊酸钠加到诱导培养基中只7天，否则会对重编程的细胞和feeder细胞产生毒|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols性反应。30.感染后第16天，将培养基换为新鲜mTesR1培养基。31.人ESC样细胞首次出现第7天（通常为感染后16-25天），机械法挑取ESC样克隆到feeder或者Matrigel包被的培养皿中（图3a，b）。有些情况，克隆出现较慢，因此应当较晚挑取。关键步骤：当ESC样克隆刚出现时不要挑取，因为可能会分化。让它们从出现至少生长一周（图2a）。？疑难解答32.根据实验室习惯或者之前NatureProtocols的报道47-49培养和鉴定UiPSCs克隆。？疑难解答疑难解答的建议可以在表1中找到。表1疑难解答建议步骤问题可能原因解决方案14未观察到尿液细胞克隆尿液量不足收集更多体积收集多次，同一个孔培养2223细胞感染后2-3天观察GFP荧光强度较弱或几乎无形态改变病毒滴度较低细胞老化重复提高病毒滴度使用较早代次尿液细胞和或在REMC扩增培养基中培养31未出现人ESC样克隆培养基或feeder准备出现问题重编程效率较低准备新的培养基和feeder使用较早代次尿液细胞和或在REMC扩增培养基中培养第3-5天加更多细胞到feeder上继续重编程超过25天时间时间步骤1，尿液收集：10分钟步骤2-10，分离尿液细胞：30分钟，加孵育24小时步骤11-16，尿液细胞扩增：2周（或者直到为UiPSCs获得足够量的尿液细胞）步骤17-32，逆转录病毒感染和UiPSCs获得：3-4周（直到可以机械挑取iPSCs）框框11，逆转录病毒制备：约1周预期结果预期结果从个体中分离一次的尿液细胞在培养2周后通常能够出现诱导重编程足够量的尿液细胞。这个过程可以通过从同一个体中多次收集尿液而缩短时间。重编程的过程是高度可重复的并且大多数情况下会出现UiPSCs克隆。并且，产生的UiPSCs是ESC样的，在体内外都显示良好的三胚层分化的能力（图3）。目前已被证实，由于供体细胞固有的持续性的表观记忆的存在，由不同组织来源获得的iPSCs具有不同的组织偏好性的趋于原组织的分化能力44。研究还应继续，关于是否UiPSCs具有重新分化为肾上皮细胞的特殊倾向，但这个是优异的，因为目前关于肾脏分化的方法效率是比较低下的50。Song等人51和Montserrat52等人已经分别报道了|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols从肾系膜细胞和肾近端小管上皮细胞（两种情况都是通过活组织检查获得）中获得iPSCs，将他们的特征与UiPSCs进行比较是由意义的。研究是否由于基因组稳定性造成的分化潜能的差异，与其他组织来源的iPSCs相比，UiPSCs或多或少具有累积基因组改变的倾向。更为重要的是，这里列出的流程是基于逆转录病毒载体的，但是在我们实验室中基于非整合的方法正在研究过程中。参考文献参考文献1.TakahashiK.etal.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131861872(2007).2.TakahashiK.YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126663676(2006).3.YuJ.etal.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science31819171920(2007).4.MorettiA.etal.Patient-specificinducedpluripotentstem-cellmodelsforlong-QTsyndrome.N.Engl.J.Med.36313971409(2010).5.ZhangS.etal.RescueofATP7Bfunctioninhepatocyte-likecellsfromWilsonsdiseaseinducedpluripotentstemcellsusinggenetherapyorthechaperonedrugcurcumin.Hum.Mol.Genet.2031763187(2011).6.ParkI.H.etal.Disease-specificinducedpluripotentstemcells.Cell134877886(2008).7.ZhaoT.ZhangZ.N.RongZ.XuY.Immunogenicityofinducedpluripotentstemcells.Nature474212215(2011).8.ListerR.etal.Hotspotsofaberrantepigenomicreprogramminginhumaninducedpluripotentstemcells.Nature4716873(2011).9.HusseinS.M.etal.Copynumbervariationandselectionduringreprogrammingtopluripotency.Nature4715862(2011).10.GoreA.etal.Somaticcodingmutationsinhumaninducedpluripotentstemcells.Nature4716367(2011).11.AasenT.etal.Efficientandrapidgenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumankeratinocytes.Nat.Biotechnol.2612761284(2008).12.UtikalJ.MaheraliN.KulalertW.HochedlingerK.Sox2isdispensableforthereprogrammingofmelanocytesandmelanomacellsintoinducedpluripotentstemcells.J.CellSci.12235023510(2009).13.EstebanM.A.etal.VitaminCenhancesthegenerationofmouseandhumaninducedpluripotentstemcells.CellStemCell67179(2010).14.SugiiS.etal.Humanandmouseadipose-derivedcellssupportfeeder-independentinductionofpluripotentstemcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA10735583563(2010).15.SunN.etal.Feeder-freederivationofinducedpluripotentstemcellsfromadulthumanadiposestemcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1061572015725(2009).16.LohY.H.etal.ReprogrammingofTcellsfromhumanperipheralblood.CellStemCell71519(2010).17.SekiT.etal.GenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumanterminallydifferentiatedcirculatingTcells.CellStemCell71114(2010).18.StaerkJ.etal.Reprogrammingofhumanperipheralbloodcellstoinducedpluripotentstemcells.CellStemCell72024(2010).19.WadaN.etal.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumangingivalfibroblastsandperiodontalligamentfibroblasts.J.Periodontal.Res.46438447(2011).20.KimJ.B.etal.DirectreprogrammingofhumanneuralstemcellsbyOCT4.Nature461649643(2009).|VOL.7NO.12|2012|natureprotocols21.LiuH.YeZ.KimY.SharkisS.JangY.Y.Generationofendoderm-derivedhumaninducedpluripotentstemcellsfromprimaryhepatocytes.Hepatology5118101819(2010).22.LiC.etal.Pluripotencycanberapidlyandefficientlyinducedinhumanamnioticfluid-derivedcells.Hum.Mol.Genet.1843404349(2009).23.LiW.etal.Modelingabnormalearlydevelopmentwithinducedpluripotentstemcellsfromaneuploidsyndromes.Hum.Mol.Genet.213245(2012).24.CaiJ.etal.Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsfromumbilicalcordmatrixandamnioticmembranemesenchymalcells.J.Biol.Chem.2851122711234(2010).25.GiorgettiA.etal.GenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumancordbloodusingOCT4andSOX2.CellStemCell5353357(2009).26.HaaseA.etal.Generationofinducedpluripotentstemcellsfromhumancordblood.CellStemCell5434441(2009).27.SekiT.YuasaS.FukudaK.GenerationofinducedpluripotentstemcellsfromasmallamountofhumanperipheralbloodusingacombinationofactivatedTcellsandSendaivirus.Nat.Protoc.7718728(2012).28.AasenT.IzpisuaBelmonteJ.C.Isolationandcultivationofhumankeratinocytesfromskinorpluckedhairforthegenerationofinducedpluripotentstemcells.Nat.Protoc.5371382(2010).29.GiorgettiA.etal.Generationofinducedpluripotentstemcellsfromhumancordbloodcellswithonlytwofactors:Oct4andSox2.Nat.Protoc.5811820(2010).30.WitzgallR.ArerenalproximaltubularepithelialcellsconstantlypreparedforanemergencyFocusontheproliferationcapacityoftherenalproximaltubuleinvolvesthebulkofdifferentiatedepithelialcells.Am.J.Physiol.CellPhysiol.294C1C3(2008).31.FrankH.N.Anatomyoftheurinarytract.inTheNetterCollectionofMedicalIllustrations:UrinarySystem2ndedn.Vol.5(eds.ChristopherR.KellyJ.L.)228(Saunders2012).32.RahmouneH.etal.Glucosetransportersinhumanrenalproximaltubularcellsisolatedfromtheurineofpatientswithnon-insulin-dependentdiabetes.Diabetes5434273434(2005).33.SutherlandG.R.BainA.D.Cultureofcellsfromtheurineofnewbornchildren.Nature239231(1972).34.LinderD.Cultureofcellsfromtheurineandbladderwashingsofadults.SomaticCellGenet.2281283(1976).35.HerzF.Cultureofurinarycells.BirthDefectsOrig.Artic.Ser.168593(1980).36.HerzF.SchermerA.KossL.G.Short-termcultureofepithelialcellsfromurineofadults.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.161153157(1979).37.FelixJ.S.LittlefieldJ.W.Urinarytractepithelialcellsculturedfromhumanurine.Int.Rev.Cytol.Suppl.1123(1979).38.FelixJ.S.LittlefieldJ.W.Humannewbornurineasasourceofepithelialcells.BirthDefectsOrig.Artic.Ser.16231237(1980).39.FelixJ.S.SunT.T.LittlefieldJ.W.Humanepithelialcellsculturedfromurine:growthpropertiesandkeratinstaining.InVitro16866874(1980).40.DorrenhausA.etal.Culturesofexfoliatedepithelialcellsfromdifferentlocationsofthehumanurinarytractandtherenaltubularsystem.Arch.Toxicol.74618626(2000).41.ZhangY.etal.Urine-derivedcellsareapotentialsourceforurologicaltissuereconstruction.J.Urol2008).42.BharadwajS.etal.Characterizatio