NY T 449-2001 玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法.pdf

B 2 0NY中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y / T 4 4 9 -2 0 0 1玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法I d e n t i f i c a t i o n p u r i t y o f m a i z e v a r i e t yu s i n g s a l t i n g i n p r o t e i n e l e t r o h p o r e s i s2 0 0 1 一 0 8 一 2 0 发布2 0 0 1 一 1 1 一 0 1 实施中华人民共和国农业部发 布NY / T 4 4 9 -2 0 0 1前言 本标准由农业部市场与经济信息司提出。 本标准起草单位: 农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心、 吉林省农作物种子质量监督检验站、 北京市种子质量监督检验站。 本标准主要起草人: 辛景树、 赵建宗、 丁万志、 贾希海、 黄庭军、 王汝宝、 刘玉欣、 苏菊萍、 徐献军、 吕小瑞、王秀荣、 孙波、 冯晓东、 陈雅君、 余有海 、 班秀丽 。中华人民共和国农业行业标准玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY/ T 4 4 9 -2 0 0 1I d e n t i f ic a t i o n p u r i t y o f ma i z e v a r i e t yu s i n g s a l t i n g i n p r o t e i n e l e t r o h p o r e s i s范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。2引用标准 下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B / T 3 5 4 3 . 2 -1 9 9 5 农作物种子检验规程扦样 G B / T 3 5 4 3 . 5 -1 9 9 5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 G B 4 4 0 4 . 1 -1 9 9 6 粮食作物种子禾谷类3 定义 本标准采用下列定义I1 种子真实性 供检品种与文件记录( 如标签等) 是否相符。3 . 2品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度， 用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示 G B / T 3 5 4 3 . 5 113育种家种子 育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子、 用于进一步繁殖原种的种子。4原理 从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酸胺凝胶的浓缩效应、 分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离， 通过染色显示蛋白质谱带类型。 不同玉米品种由于遗传组成的不同， 种子内所含的蛋白 质种类有差异 ， 这种差异可利用电泳图谱加以鉴别 ， 从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定 。5仪器设备及试剂5 . 1 仪器设备 电泳仪( 5 0 0 V士5 V连续可调, 0 4 0 0 mA连续可调、 额定输出功率2 0 0 w) 、 垂直板夹心式电泳槽、 单籽粒粉碎器、 天平( 感量0 . 0 1 g , 0 . 0 0 1 g , 0 . 0 0 0 1 g各一台) 、 酸度计、 磁力搅拌器、 高速离心机( 5 0 0 0 r / mi n以上) 、 电冰箱、 电炉、 离心管( 1 . 5 ml ) 、 离心管架、 移液管( 1 0 m L, S ml- , 2 mL各两支) 、 微量进样器( 5 -中华人民共和国农业部2 0 0 1 一 0 8 一 2 0批准2 0 0 1 - 1 1 一 0 1实施NY / T 4 4 9 -2 0 0 11 0 0 V L ) , 恒温 箱、 观片 灯等。5 . 2试剂 丙烯酞胺, N, N 一 亚甲基双丙烯酞胺、 乳酸、 乳酸钠、 甘氮酸、 抗坏血酸、 硫酸亚铁、 氯化钠、 蔗糖、 甲基绿、基绿、 三氯乙酸、 过氧化氢、 考马斯亮蓝R2 5 0 、 无水乙醇、 正丁醇等( 所用试剂均为分析纯， 所用水均为去离子水 ) 。6 溶液配制6 门电极缓冲液 称取甘氨酸 6 . 0 0 g ， 倒人 2 0 0 0 m L烧杯中， 加人 1 8 0 0 mL去离子水溶解， 用 2 . 0 mL乳酸调至p H3 . 3 ， 再加去离子水定容至2 0 0 0 mL, 混匀。6 . 2 样品提取液 称取 氯化 钠5 . 8 0 g ， 蔗 糖2 0 0 . 0 0 g ， 甲 基绿。 . 1 5 g ， 倒人1 0 0 0 M I烧杯中， 加 去离子 水8 0 0 m 工 一 溶 解，加热至微沸， 放至室温， 再用去离子水定容至1 0 0 0 mL。在4 C条件下保存。6 . 3 分离胶缓冲液 取1 . 4 3 m L乳酸钠于1 0 0 0 m L烧杯中， 加去离子水 9 8 0 mL， 用乳酸调至p H 3 . 0 ， 再加去离子水定容至1 0 0 0 m l - , 贮于棕色瓶中， 在 4 C 条件下保存。6 . 4分离胶溶液 称取丙烯酞胺 1 1 2 . 5 0 g , N, N 一 亚甲基双丙烯酞胺 3 . 7 5 g ， 抗坏血酸。 . 2 5 g ， 硫酸亚铁 8 . O mg ， 用分离胶缓冲液溶解， 再用分离胶缓冲液定容至 1 O O O mI ， 过滤于棕色瓶中， 在 4 C条件下保存( 不超过 1 4天 ) 。6 . 5 浓缩胶缓冲液 取。 . 3 0 mL乳酸钠于 2 0 0 m l烧杯中， 加去离子水9 0 mL， 用乳酸调至 p H5 . 2 . 再加去离子水定容至1 0 0 ml - ， 贮于棕色瓶中， 在 4 C 条件下保存。6 . 6 浓缩胶溶液 称取 丙烯酸 胺6 . 0 0 g , N, N ， 一 亚甲 基双丙 烯酞胺1 . 0 0 g ， 抗 坏血酸0 . 0 3 g ， 硫酸亚 铁。 . 8 m g ， 用浓缩 胶缓冲液溶解， 再用浓缩胶缓冲液定容至1 0 0 m l， 过滤于棕色瓶中， 在4 C条件下保存( 不超过 6 天) 。6 . 7 3 %的过氧化氢溶液 取3 0 %的过氧化氢1 ml， 加9 m l去离子水， 贮于棕色瓶中， 在4 C条件下保存。6 . 8 染色液 称取考马斯亮蓝R 2 5 0 2 . 0 0 g ， 在研钵中用1 0 0 ml无水乙醇研磨溶解， 过滤于棕色瓶中。取 1 0 mL该溶液 ， 加人到 2 0 0 mL的 1 0%( W/ V) 三氯乙酸溶液中， 混匀7电泳操作7 . 1 样品制备 按G B / T 3 5 4 3 . 2的要求， 从送验样品中随机分取玉米种子至少1 0 0粒， 用单籽粒粉碎器粉碎， 放人 1 . 5mL离心管中， 用滴管加人与样品体积相同的样品提取液， 摇匀， 放置 5 mi n后， 再摇一次， 3 0 m i n后， 用离心机离心( 5 0 0 0 r / m i n ) 1 5 mi n ， 取上清液用于电泳。7 . 2凝胶制备7 . 2 . 1 胶室制备 将预先洗净晾干的玻璃板装人胶条中， 然后把胶条固定在垂直板 电泳槽内. 保持水平， 短板向正极 ， 拧紧螺栓， 备用7 . 2 . 2封底缝 根据 电泳槽大小， 取适量分离胶溶液于烧杯 中， 用微量进样器加人适量 3 %的过氧化氢溶液( 一般每 5N Y / T 4 4 9 -2 0 0 1mL分离胶溶液加2 0 I L 3 %过氧化氢溶液) ， 迅速摇匀， 并从长玻璃板外侧沿玻璃板倒人， 振动电泳槽3次，放平。了 . 2 . 3 灌分离胶 底缝封住后， 用滤纸条插人两玻璃板之间. 吸去因聚合而析出的水; 量取分离胶溶液适量， 加人3 %过氧化氢溶液( 一般每 1 5 m L分离胶溶液加 3 %过氧化氢 2 0 p L ) 迅速摇匀; 倾斜电泳槽， 将分离胶溶液倒人两玻璃板之间， 高度距短玻璃板上沿 1 . 2 c m; 放平电泳槽并在试验台上振动3次后， 迅速加人适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后， 吸出分离胶表面上的正丁醇， 并用去离子水冲洗胶面 3 次， 用滤纸吸干。7 . 2 . 4 灌浓缩胶 量取浓 缩胶溶液 适量， 加人3 %过氧 化氢溶 液( 一般每5 m L浓缩 胶溶液加3 %过 氧化氢 溶液4 0 p L ) ， 迅速搅匀， 倒人两玻璃板之间， 马上插好样品梳， 样品梳底部距分离胶顶部0 . 5 c m.7 . 2 . 5点样 浓缩胶聚合后， 拔出样品梳并将样品槽清理干净， 用微量进样器在每个样品槽中加人不同籽粒的样品上清液1 5 p L ， 每 点一粒 后， 都 要用去 离子水 清洗进 样器3 次。了2 . 6电泳 加样完毕后， 倒人电极缓冲液， 上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板， 下槽电极缓冲液面要高于铂金丝; 将电源线正极接上槽， 负极接下槽; 接通电源， 采用5 0 0 v稳压进行电泳， 待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时 ， 关闭电源。7 . 2 . 7卸板 倒出电极液， 从电泳槽内取出胶室， 卸下胶条， 启开玻璃板， 取出胶片， 浸人染色液中。7 . 2 . 8 染色 在 3 0 C恒温条件下染色 2 -4 h o7 . 2 . 9 洗板 取出胶片 ， 用 0 . 5 %的不加酶洗衣粉水洗净。8结果计算8 . 1 电泳测定值计算 待整个供检样品电泳结束后， 在观片灯上鉴定胶片上