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,卡氏住白细胞虫、隐孢子虫文章汇总,1,目录,2,卡氏住白细胞虫 文章,A,B,c,D,E,F,3,A 复方泰灭净对蛋鸡卡氏住白细胞虫病预防效果,A组 （169只鸡）,B组 （159只鸡）,对照组 （172只鸡）,血涂片、琼脂扩散法化验,产蛋及存活观察,实验结果,实验材料和方法,高产海兰白鸡、卡氏住白细胞虫标准抗原、标准阳性抗体,血涂片、琼脂扩散法化验,血涂片、琼脂扩散法化验,30 g/L复方泰灭净,50 g/L复方泰灭净,统计分析,复方泰灭净 50 g/ L 组对卡氏住白细胞虫的感染完全保护, 整个试验期间血涂片和琼脂扩散检查均为阴性。 30 g/ L 组基本能够控制其感染, 整个试验期间仅检出 1例抗体阳性, 感染率为 0. 63% ( 1/ 160), 同时未见临床症状。 对照组蛋鸡从 5 月份开始至实验结束连续发病并出现血清学阳性反应, 抗体检出率为 27.80% 80. 00%, 抗原检出率为 0. 68%( 1/ 158), 裂殖子检出率为 0. 63% ( 1/ 158), 并且出现大量死亡。,4,B 卡氏住白细胞虫子孢子冻存方法及感染力试验,实验材料和方法,32 35 日龄的健康 AA 鸡、患卡氏住白细胞虫病鸡,诱捕 库蠓,库蠓匀浆,子孢子纯化,A途径子孢子,B途径子孢子,病鸡,玻璃匀浆器,营养液,A组（6只）,B组（6只）,C组（6只）,D组（6只）,注射新鲜子孢子,A类子孢子,观察临床症状,B类子孢子,抹片、染色、镜检,第13天,注：每组鸡中每两只鸡分别注射0.1ml、0.2、0.3ml,实验结果,静脉接种未经冻存的新鲜子孢子的鸡全部发病，且随着接种剂量增加，病情亦加重。经 A 途径缓慢冻存的子孢子在较大剂量时可引起鸡发病；经 B 途径冻存的子孢子无论剂量大小均不能引起鸡发病。,结论：子孢子的保存应选择A 途径, 而人工发病试验最好使用新鲜的子孢子进行接种。,A冻存法,B冻存法,5,C 卡氏住白细胞虫配子体的浓集和纯化,实验材料和方法,4只患卡氏住白细胞虫病鸡,分离液的制备,样本收集处理,单密度分离法,多密度分离法,配子体纯化,计数统计方法,实验结果,图 1 采用多密度法纯化 的配子体（1000X）,图 2 采用单密度法浓集 的配子体（1000X）,图 3 浓集后进一步纯化的配子体（1000X）,图 5 鸡外周血液中的 卡氏住白虫配子体 （1000X）,实验结论：该二种方法均取得了较好的分离和纯化效果,达到了直接从鸡血液中分离纯化配子体的目的, 纯化的虫体纯度已基本符合虫体代谢、抗原分析及核酸分析研究等工作的要求。,6,D PCR Amplication and Sequencing of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryi,。,MATERIALS AND METHODS,Diseased chickens (the huge schizonts were isloated from muscle ,heart, liver, and other tissues.,DNA extracte,PCR amplification,cloning,sequencing analysis,ITS-2,DNA UNIQ-5 spin column purification kitur,RESULTS,PCR Amplication of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryi,Restriction pattern of recombinant plasmid,7,E 卡氏住白细胞虫 rDNA ITS-2 的 PCR扩增与测序,实验材料和方法,广州某鸡场病死鸡（从肌肉组织及心脏等部位采集卡氏住白细胞虫巨型裂殖体）,卵囊 纯化,DNA 提取,ITS2PCR 扩增,鉴定 回收,产物克隆 筛选,DNA 测序分析,实验结果,1. 虫体扩增片段; 2. 鸡肌肉扩增片段; 3. 空白对照,1. SalI 酶切重组质粒; 2. 重组阳性质粒; 3. EcoRI 酶切重组质粒,结论：根据上述比较分析，本试验所测为卡氏住白细胞虫的 ITS-2 及部分 5. 8S 和28S( ITS2+ ) 序列，其中 ITS-2 序列为卡氏住白细胞虫种特异性序列。,8,F 卡氏住白虫病 PCR 诊断方法的建立,实验材料和方法,卡氏住白虫虫体材料（采自广州花都某鸡场病鸡）、 微孢子虫DNA、 弓形虫 DNA、 疟原虫DNA、荒川库蠓 DNA。,卵囊 纯化,虫体DNA 提取,引物设计稀释,ITS2 PCR 扩增,产物回收测序,特异性试验,敏感性实验,实验结果,PCR条件优化,图 1 氏住白虫ITS-2 扩增结果,图 2 特异性试验,图 3 敏感性试验,1.卡氏住白虫 PCR 扩增产物 2.肌肉对照组 3.空白对照组,1. 卡氏住白细胞虫 2.健康肌肉 3.鸡球虫 4.荒川库蠓 5.健康鸡血液 6.微孢子虫 7.弓形虫 8.原虫,1.10ng/l 2.1ng/ l 3.100pg/l 4.10pg/l 5.1pg/ l 6.100fg/ l 7.10fg/ l 8.1fg/ l DNA,9,隐孢子虫 文章,A,C,I,B,D,E,F,G,H,J,K,O,10,A 广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查,实验材料和方法,1087头奶牛新鲜粪便（广东）。,实验结果,饱和蔗糖漂浮法,改良抗酸染色法,形态学鉴定,评判标准,图1 乳牛隐孢子虫卵囊改良抗酸染色的形态学观察 1 000,图2 乳牛隐孢子虫卵囊直接涂片的形态学观察 1 000,结论：初步鉴定为鼠隐孢子虫( C. muris) 。,11,结论：乳牛年龄越小,感染率越高 ,感染强度越大。并且明隐孢子虫感染在一定程度上受季节性变化的影响 ,但影响不是很大。,12,B 安氏隐孢子虫 PCR 检测方法的建立,实验材料和方法,安氏隐孢子虫卵囊、微小隐孢子虫、弓形虫、大肠杆菌、球虫、圆孢子虫 、 纤毛虫、肝片吸虫 、 血矛线虫和莫尼茨绦虫、牛粪便。,虫体、对组DNA提取测定,HSP70扩增退火温度筛选,HSP70克隆与鉴定,引物设计与合成,特异、敏感性试验,实验结果,图 1 安氏隐孢子PCR 检测的特异性试验结果。,图 2 安氏隐孢子虫PCR 检测的敏感性试验结果,结果：仅安氏隐孢子虫样品DNA 扩增出约500 bp 的特定片段, 特异性良好，当样本中含有DNA 含量 1.5210 - 1 ( ng/ L) 包含 4. 45 10 2 个隐孢子虫的DNA 时,即可扩增产生清晰可辩的条带，说明该方法灵敏性高。,13,C 安氏隐孢子虫内转录间隔区I （ITS-1） 序列的PCR扩增、克隆及分析,卵囊 纯化,DNA 提取,PCR 扩增,产物克隆,质粒 鉴定,ITS1测序分析,实验结果,实验材料和方法,安氏隐孢子虫卵囊GD株（广东奶牛场）、HN株（郑州奶牛场）以及AH株（安徽农大）。,M,1 2 3 4 5,bp,2000,1000,750,500,100,M 1 2 3 4,bp,2000,1000,750,500,100,M1 1 2 3 M2,bp,2000,1000,750,500,100,5000,2500,1000,250,图1 C.andersoni ITS-1 PCR产物 琼脂糖电泳分析,图2 C.andersoni ITS-1 重组质粒 PCR鉴定,图3 C.andersoni ITS-1 重组质粒 EcoR I酶切鉴定,1. GD株 2. HN株 3. AH株 4. 宿主对照 5.空白对照,14,测序结果,1. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA 65 2. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA 3. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA 1. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT 130 2. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT 3. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT 1. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA 195 2. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA 3. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA 1. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT 260 2. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT 3. AGCTAAATATTCATTTTAGGGAAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATCTTT AGGGGTTTTCTT 1. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA 321 2. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA 3. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT GTAATCTCTA,图4 C.andersoni ITS-1 核酸序列的比较 1.GD株，2.HN株，3.AH株；“A”，“C”及“G”代表DNA变异位点,结果：GD株、HN株和AH株的ITS-1序列基本一致，仅AH株有三个碱基差异；但与GenBank上注册的C.muris和C.parvum存在种间差异，而且差异显著。,15,D Molecular Identification and Characterization of Cryptosporidium spp. from Mainland China,。,MATERIALS AND METHODS,Cryptosporidium oocysts（dairy cows in Guangdong, Anhui and Jiangsu provinces）,DNA extracte,PCR amplification,Purification,cloning,sequencing analysis,SSU rRNA and HSP70,DNA UNIQ-5 spin column purification kitur,RESULTS,M: DG005 marker; 1: Guangdong isolate; 2: Anhui isolate; 3: Jiangsu isolate; 4: No-DNA control,450bp,290bp,(HSP70),(SSU rRNA),16,Table The length and base composition of the HSP70 and the SSU rDNA sequences representing Cryptosporidium spp. from China,Species Host Geographicalorigin Length (bp) A+T contents (%) Accession No,HSP70,C.andersoni,C.andersoni,C. parvum,SSU rDNA,C.andersoni,C.andersoni,C. parvum,Dairy cow,Dairy cow,Dairy cow,Dairy cow,Dairy cow,Dairy cow,Guangdong, China,Anhui, China,Jiangsu, China,Guangdong, China,Anhui, China,Jiangsu, China,446,446,446,290,291,292,61.65,61.65,60.53,65.16,65.62,69.85,AJ567386,AJ567387,AJ567388,AJ567389,AJ567390,AJ567391,17,E 安氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的初步应用,XXXX年,实验材料和方法,PCR检测试剂盒、234份奶牛粪样（广东、河南）。,改良抗酸染色法,饱和蔗糖溶液漂浮法,常规方法,PCR试剂盒检测,检测样品处理,DNA提取,PCR扩增,产物检测,实验结果,18,M：DL2000 DNA Marker；1，12：阳性对照；2-11，13-22：阳性样品； 23：阴性对照,结论：改良抗酸法阳性检出率4%-25%，饱和蔗糖漂浮法阳性检出率4%-18%，PCR阳性检出率6%-31%。本试剂盒的检出率比常规方法高出2%-13%，显示本试剂盒具有特异性、敏感性等优点。,19,F Development and Application of Nested PCR Assay for Detection of Dairy Cattle-Derived Cyclospora sp.,DNA samples of cattle-derived Cyclospora-like organisms, Giardia sp., Eimeria sp., Cryptosporidiumandersoni, ciliate, Trichuris sp., and swine-derived Eimeria sp., chicken-derived Eimeria sp. and Cryptosporidium baileyi,DNA extracte,PCR primers,nested PCR,PCR amplification,Evaluation of specificity,Evaluation of sensitivity,MATERIALS AND METHODS,RESULTS,20,G Combined PCR-oligonucleotide ligation assay for detection of dairy cattle-derived Cyclospora sp,Materials and methods,cattle-derived Cyclospora sp, Giardia sp, Eimeria sp,Cryptosporidium andersoni,ciliate Trichuris sp.,DNA extracte,primers reporter probe selection,PCR procedure,OLA procedure,Evaluation of specificity sensitivity,RESULTS,Fig. 4. Agarose gel electrophoresis of different content of PCR products. Lane M, DL-2000 marker; lane 1, 50 ng; lane 2, 5 ng; lane3, 0.5 ng; lane 4, 0.05 ng.,Fig.1. PCR amplicon of different genomic DNA,21,Fig. 3. Spectrophotometric absorbance (A 405 ) value of different content of PCR products.,Fig. 2. Spectrophotometric absorbance (A 405 ) value for different nested-PCR products.,22,H 贝氏隐孢子虫 PCR 检测试剂盒的研制,实验材料和方法,贝氏隐孢子虫GD 株,卵囊 纯化,DNA 提取,特异引物设计,反应条件优化,试剂盒组装,特异性试验,敏感性试验,实验结果,稳定性试验,重复性试验,保存期试验,图1 试剂盒的特异性试验结果,图2 试剂盒敏感性试验结果,图3 试剂盒稳定性试验结果,23,XXXX年,XXXX年,图 2 饱和蔗糖溶液漂浮法处理的贝氏隐孢子虫卵囊( A 400; B 1000,A,B,图 3 16份 C. baileyi 阳性样品的 PCR 扩增,24,I 贝氏隐孢子虫 PCR