原核生物的转录与调控.ppt

第八章 原核生物的转录和调控,转录 ( transcription ) 生物体以DNA为模板按53方向合成RNA的过程,转录,参 与 转 录 的 物 质：,原料 : 4种NTP ( ATP, UTP, GTP, CTP ) 模板 : DNA 酶 : RNA聚合酶 其他蛋白质因子,A. 原核生物的转录,一、转录概述 二、转录的基本过程 三、大肠杆菌RNA聚合酶 四、转录的机制,一、转录概述,起始点 (start point)：合成第一个RNA碱基的位置，用“+1”表示。 启动子(promoter)：位于转录起始点前，和RNA聚合酶结合的一段DNA序列。 终止子 (terminator)：使RNA聚合酶终止转录的一段DNA序列。 转录单位 (transcription unit)：从启动子到终止子间的一段DNA序列。,基本术语：,上游序列：基因中起始点前面的序列，用 “-” 表示 下游序列：在起始点后面的序列，用 “+” 表示 初级转录本：刚转录完成的RNA产物 转录泡：RNA聚合酶与启动子结合后形成的DNA解旋区。转录泡可和RNA聚合酶一起沿DNA链移动，RNA合成在转录泡内进行。,基本术语：,转录泡的结构 当RNA聚合酶沿DNA模板移动时，它打开泡前的DNA双螺旋（在解链点打开），并在复链点使DNA复原。 转录泡的长度随增长反应阶段而异，在12-20bp之间 (17 bp)，但其中的RNA-DNA杂合双螺旋区域比这个长度要短 (12 bp)。,二、转录的基本过程 1. 识别启动子 RNA聚合酶识别启动子，并在启动子处结合形成一个“转录泡”，转录泡内的DNA双链解开，为RNA合成提供模板。,2. 转录起始 a. 转录起始无需引物。 b. 流产起始：转录起始后直到形成9个核苷酸短链的过程是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区域，新生RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始，这一过程称为流产起始。 c. 启动子清除：一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区域，转录就进入正常的延伸阶段，这一过程称为启动子清除。 d. 通过启动子的时间代表一个启动子的强弱，时间越短表明该基因转录起始的频率越高。,3. 链的延伸 RNA聚合酶沿DNA模板链移动并使新生RNA链不断伸长的过程。大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。酶移动时局部解旋DNA；酶经过之后， DNA又重新形成双螺旋。,4. 链的终止和释放,当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都从模板上释放出来，这就是转录的终止。,三、大肠杆菌RNA聚合酶 1. RNA聚合酶的功能 a. RNA合成 b. 合成起始和终止位点的识别 c. 确定与DNA结合位点的结合与脱离的时间等,核心酶 core enzyme,全酶 holoenzyme,全酶至少含5个亚基：2、，是转录起始所必需的。 2、和亚基组成核心酶，种间基本没有变化； 因子存在广泛的种间变异，用于识别不同的启动子。,2. RNA聚合酶的结构,2) 因子的功能： 使RNA聚合酶特异性地与启动子结合。 大肠杆菌中最常见的因子是70 核心酶不能区分DNA的启动子和其它序列，它与DNA非选择性结合形成松散型复合体。因子是通过将核心酶对非特异序列的亲和力降低104倍，同时增加其对启动子的亲和力来帮助启动子识别的。 RNA链延伸至8-9nt时，因子会从RNA聚合酶中释放出来，它可以再与其他核心酶结合重新起始转录。,3. RNA聚合酶在细胞内的分布形式 1) 很少有游离的核心酶和全酶 2) 细胞内因子数量只有核心酶的30%，因此在任何时刻只有1/3的聚合酶能以全酶的形式存在。,四、转录的机制 1. 启动子识别和转录起始 1) 在RNA聚合酶开始链延长前，它与DNA的相互作用经历了4个阶段： a. RNA聚合酶与处于碱基配对状态的启动子序列结合形成闭合复合物。 b. DNA的初始解旋导致DNA与聚合酶形成开放复合物，这一过程称为紧密结合。 c. 进行多次流产起始 d. 起始成功后，聚合酶释放因子，形成聚合酶-DNA-新生RNA的三聚复合物，RNA链开始延伸。,RNA pol 是如何发现正确的起点而启动基因转录的呢？,1) 启动子的识别取决于共有序列 保守性序列：每个启动子都包括一个能被RNA聚合酶识别的特征DNA序列。 共有序列：是根据保守性序列总结出的一种理想序列，它的每一个位置代表了很多实际序列中最经常发现的碱基。典型的启动子有3个共有序列： -35序列、-10序列和起始点序列,Pribnow框,Sextama框,细菌启动子有个保守性特征： 转录起始点：开始碱基90%是嘌呤，G比A更常见。 -10序列：起始点上游一个6bp区，这个六聚体的中心靠近起始点上游的第10碱基对，它的共有序列是TATAAT。-10序列是RNA聚合酶的牢固结合位点，是聚合酶启动DNA解旋的序列。因此，-10序列可通过影响开放复合物的形成速度而控制转录。 -35序列：也是一个六聚体，其中心位于-35碱基对处，它的共有序列是TTGACA，是RNA聚合酶的识别位点。 -35和-10序列之间的距离十分重要，在90%的启动子中变动在16和18个碱基之间，两序列间为17bp时转录效率最高。,启动子的突变影响它所控制的基因的转录水平而不改变转录产物： 下降突变：TATAAT AATAAT 上升突变：TATGTT TATATT -35序列的作用是为RNA聚合酶的识别提供信号，而-10序列使复合物由闭合转化为开放。所以我们可以认为-35序列包括一个识别结构域，而-10序列包括一个解链结构域。 起始点周围的碱基序列对起始作用也有影响，起始转录区间（+1+30）影响RNA聚合酶沿启动子滑动的速度从而影响启动子的强度。,4) 转录起始的效率 不同启动子的起始效率有差异。不同启动子与全酶的结合紧密程度不同，结合的紧密程度与启动子起始转录的效率有关。 转录起始受调节蛋白控制。 启动子上游序列可能增强启动子的活性。 负超螺旋状态有利于转录起始，是因为负超螺旋结构需较少的自由能，就可使起始复合物中的双链解开。,5) 特定类型基因的转录由不同的因子控制 在细胞中不止一种因子 RNA聚合酶起始一些基因的转录需要特殊的因子 不同大肠杆菌因子识别不同的启动子 在噬菌体中通过因子的改变控制不同时期基因的表达。,2. RNA链的延伸 a. 全酶结合在启动子后，开始不断的流产起始，直至移出启动子区域，才进行链的延伸。 b. 当RNA聚合酶全酶刚结合上DNA时，它覆盖75-80bp，从-55延伸至+20，在起始阶段它保持着这个位置。 c. 进入链延伸阶段后，因子被释放，RNA聚合酶不再覆盖-55到-35的DNA，只剩下约60bp被RNA聚合酶所覆盖。,3. 链的终止 RNA链停止增长，并与DNA模板链分离。 终止子：促进转录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的终止子序列形成茎环结构而起作用。可分为两类： 不依赖于因子的终止子（内在终止子） 依赖于因子的终止子,（1）不依赖于因子的终止子,核心酶可以在没有任何其它辅助因子的情况下，在某些终点终止，这些位点称为不依赖于因子的终止子 。 特征：转录产物中包含发卡状的二级结构（7-20 bp）和3末端连续4个或更多的U残基，发卡茎部结构中富含G-C。,2) 依赖于因子（rho）的终止子 需要Rho的存在才能终止反应。 特征：在终止点前有一段富含C但缺乏G的区段。这段碱基越长，终止效率越高。,因子：46 KD的蛋白，功能形式是六聚体，是RNA聚合酶的一个辅助因子，只在链终止时起作用。 因子具有ATPase的活性，结合在终止点上游的RNA新生链的某个位置，然后可能沿RNA链向RNA聚合酶移动，如果赶上暂停在终止点的RNA聚合酶，合成就终止。 如果没有因子因子存在，聚合酶暂停在终止子后，又继续RNA合成。,B. 原核生物的转录调控,一、基因表达的调控水平 二、转录水平的调控操纵子 三、操纵子的一般类型 四、乳糖操纵子 五、色氨酸操纵子,一、基因表达的调控水平,1. DNA水平：基因丢失、扩增、重排、甲基化等 2. 转录水平：转录起始和转录终止的调控。转录起始调节是最为经济的一种方式。 3. 转录后加工水平：RNA初级转录本本身可以是调节的目标。例如，它的稳定性与它能否被翻译有关。 4. 翻译水平：和转录水平一样，翻译水平的调控也包括起始和终止的调控。,机体可以在基因表达过程的任何阶段进行调控，一般以转录水平上的调控为主。,二、转录水平的调控操纵子,操纵子是原核生物基因结构、表达和调控的基本形式。 一个操纵子包括一个上游的调控区和一个以上的结构基因组成。 调控区包含启动子和操纵基因两部分。该区控制连锁在一起的多个基因的转录。,1. 操纵子,2. 结构基因：编码蛋白质或RNA产物的任何基因。 细菌的结构基因常以基因簇的形式存在。 基因簇中基因的编码产物功能上是相关的。例如，编码同一代谢途径中酶的基因常存在于同一基因簇。 基因簇中基因能受单一启动子的共同控制，结果是整簇基因或者都表达或者都不表达。,二、转录水平的调控操纵子,例如：lac基因簇（乳糖操纵子中的三个结构基因）, -半乳糖苷分解酶, -半乳糖苷透性酶,硫代半乳糖苷乙酰转移酶,Plac,原核生物操纵子中的全部结构基因从同一个启动子开始转录成一个多顺反子的mRNA分子。,二、转录水平的调控操纵子,3. 操纵基因：是原核生物的操纵子中调节蛋白的结合位点，为控制结构基因转录的DNA序列。 4. 调节基因：仅指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。 调节基因编码的调节蛋白通过与DNA上的操纵基因结合而控制结构基因的转录，是基因表达调控的关键。,5. 反式作用因子与顺式作用元件 基因表达的产物（蛋白质或RNA）从合成的场所扩散到目标场所而发挥作用的过程称为反式作用（trans-acting），此基因表达产物被称为反式作用因子（trans-acting factor） 。 反式作用因子通常为蛋白质或RNA，其特征为可以从合成地扩散到目标场所发挥作用。,二、转录水平的调控操纵子,顺式作用元件（cis-acting factor）是指对结构基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。 顺式作用（cis-acting）的概念用于任一不转变为任何其他形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，仅影响与其物理上相连的DNA序列的活性。 基因活性的调控主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）和顺式作用元件（通常在DNA上）相互作用而实现。,位于转录开始和结束位置上的DNA序列如启动子、终止子都是典型的顺式作用元件，能受同一类反式作用因子RNA聚合酶的识别。 操纵基因（O）是位于操纵子前端部分的顺式作用元件，它能和调节蛋白结合，控制结构基因的转录。 调节蛋白是调节基因的表达产物，是参与操纵子调节的反式作用因子。,6. 负调控与正调控 负调控：基因的表达处于启动状态，但是调节蛋白与操纵基因的结合关闭了基因的表达。,正调控：基因的表达处于关闭状态，调节蛋白与操纵基因结合，结构基因才能表达。,7. 诱导作用和阻抑作用 细菌应答某种特定物质出现而合成特定酶的过程，称为诱导作用（induction）。大肠杆菌乳糖操纵子是这种机制最好的范例。 如果某种小分子物质能够开启操纵子的转录，这种小分子物质就叫做诱导物（inducer）。 诱导物在诱导物抑制子复合体中使抑制子失去抑制作用。,二、转录水平的调控操纵子,三、操纵子的一般类型,1. 诱导型操纵子 调节基因（R）组成型表达抑制子 与抑制子作用的的小分子物质是诱导物，通常是即将被分解的糖或代谢物。 只有当诱导物存在时，抑制子被失活，操纵子才表达，表达的产物(酶)分解该诱导物。,利用类似自然诱导物的物质可以诱导基因表达，但不能被酶分解，这类诱导物称为义务诱导物（安慰诱导物），如IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）。,2. 阻遏型操纵子 调节基因组成型表达能被辅阻遏物激活的抑制子。 和抑制子相互作用的小分子物质是辅阻遏物，通常是合成代谢的末端产物，例如氨基酸。 只有当缺乏辅阻遏物时，操纵子才表达；表达产物是合成该辅阻遏物所必需的。,三、操纵子的一般类型,例如：,mRNA,R,P O,A,B,C,DNA,R,产物,R,P O,A,B,C,DNA,Co-R,mRNA,A,B,C,不表达,表达,+Co,缺乏辅阻遏物时：,辅阻遏物存在时：,Co-R: 有活性的抑制子,R: 无活性的抑制子,四、乳糖操纵子,1. 结构基因： a. 乳糖操纵子包括 -6000 bp of DNA。 b. 乳糖操纵子（lactose operon，lac ）的三个结构基因成簇排列，编码参与-半乳糖苷（如乳糖）分解代谢所需的三种蛋白质：lacZ编码-半乳糖苷酶，lacY编码-半乳糖苷透性酶，lacA编码-半乳糖苷转乙酰基酶。,lacI基因（调节基因）正好与结构基因相邻，但它不与结构基因属于同一转录单位，它有自己独立的转录单位，含有自己的启动子和终止子。 lacI编码可扩散的产物，理论上它不必位于结构基因附近。将lacI基因转移到其他任何地方都能很好地发挥作用，因此lacI的表达产物属于反式作用因子。 Lac阻抑蛋白的单体结构：包含几个独立的结构域,lacI基因的表达产物称为乳糖操纵子阻抑蛋白（lac repressor）。LacI阻抑蛋白通过与操纵基因结合使Lac操纵子处于不活跃状态。因此，乳糖操纵子的调控属于负调控。,3. 诱导物的添加影响了阻抑蛋白与操纵基因的结合能力，使阻抑蛋白从操纵基因上释放出来，从而启动转录。,乳糖,五、色氨酸操纵子,色氨酸操纵子的基本特征： 5个结构基因，trpE, D, C, B, A。 控制区包括：启动子，操纵基因，前导序列和弱化子 。 调节基因trpR与操纵基因trpO不连在一起。 色氨酸是一个辅阻遏物，与trpR产物构成有活性的抑制复合体。 表达通过阻遏和弱化两种方式控制。,2. 阻遏方式,Trp操纵基因序列长21bp，是trp阻抑蛋白的作用位点。,五、色氨酸操纵子,(1) trpE基因前有162个碱基，在第140位碱基前面有一个RNA的终止子序列，具有一串U碱基和一个发夹环。RNA合成停止在这里，产生一个140个碱基的前导链。 (2) 操纵子前的内部终止子序列，称为弱化子（衰减子）。通过弱化子内发夹状结构的变化，调