《FISH基本原理》PPT课件.ppt

荧光原位杂交技术,原理 仪器耗材 试剂及配制 标本制备 探针的制备 杂交与检测 注意事项,一、原理,将荧光素直接标记的核酸探针（或生物素、地高辛等标记的核酸探针）与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接（或通过免疫荧光信号扩增）在荧光显微镜下观察，从而对靶目标中的待测核酸进行定性、定位或定量的研究。,二、仪器耗材,仪器： 荧光显微镜及分析软件， PCR扩增仪（变性），370C隔水培养箱(杂交)，湿盒，恒温水浴箱，冰箱，普通离心机，小型高速低温离心机，移液枪（1000ul,200ul, 20ul，10ul）,玻片盒，通风橱，震荡混匀器，染色缸、计时器，温度计，温湿度显示器，量筒，酒精灯，烧杯，天平，试剂瓶等。,二、仪器耗材,耗材： 离心管(50ml,15ml,1.5ml)，PCR管，各种规格的tip头，载玻片（带磨砂的），大盖玻片（ 方形，用于镜检），小盖玻片（一般用圆形，用于杂交时候封片），封片胶等。,三、试剂,液体LB，氯霉素，STE，BAC试剂盒，异丙醇，NICK试剂盒，无水乙醇，甲酰胺, 20SSC，2SSC ，70%酒精，90%酒精，100%酒精，BSA，HumanCotI DNA，50%硫酸葡聚糖，0.3%NP40/0.4SSC， PBS缓冲液，0.1%NP40/2SSC，DAPI 染色液等。,四、标本制备,按第四章人淋巴细胞培养及收获及染色体制备收获外周血中期染色体，调整悬液浓度（20倍物镜视野下20-30个细胞，分裂指数在4%以上为宜），悬液-200C保存。,五、探针的准备,BAC-DNA的抽提 标记 纯化,1、BAC-DNA的抽提,无菌操作台上，接种BAC菌种7ul于含氯霉素（氯霉素终浓度为30ug/ml）的15ml液体LB培养液中，空气摇床上37，280rpm，震荡培养18-20h。 4000 rpm，4，离心10min 去上清，加入5mlSTE(冰预冷)重悬 4000 rpm，4，离心10min 去上清，加入250ul P1 (冰预冷)重悬 转入1.5mlEP管中(冰预冷5min) 加入250ul P2(预温)轻轻转6次，室温静置5min 加入250ul P3(冰预冷)轻轻转6次，冰上5min 13200 rpm，4，离心10min,1、BAC-DNA的抽提,移上清至新的EP管（冰预冷），加入700ul异丙醇，混匀 13200 rpm，4，离心10min 去上清，加入1ml 70%无水乙醇混匀 13200 rpm，4，离心10min 去上清，加入15ul Nuclease-free water溶解DNA 室温放置,2、标记探针,采用缺口平移标记法（NICK试剂盒） 在0.5mlEppendorf管中加入： Nuclease-free water 13.5ul dNTP mix （0.1mM） 10ul dTTP（0.1mM） 5ul 10buffer 5ul 模板DNA（1-1.5ug） 6ul SpectrumGreen 或 SpectrumOrange 或 SpectrumRed dUTP（0.2mM） 2.5ul Nick translation enzyme 8ul 总体积 50ul,2、标记探针,上PCR仪： 15 8小时 75 10分钟灭活 4保存 取标记后的探针5ul跑1%琼脂糖凝胶电泳检测，标记后探针长度范围在100-400bp较好（稳定，达到5000bp）,3、纯化探针,在1.5mlEppendorf管中加入： Ecoli tRNA（1ug/ul） 1ul 鲑鱼精DNA（10mg/ml） 5ul 8M醋酸胺 6ul 糖元 （10mg/ml） 1ul 4保存。,3、纯化探针,将标记好的探针加入上述Eppendorf管，再加入-20无水乙醇200ul，-70放置30分钟 4，15000rpm，离心10分钟 去上清，加入200ul70%乙醇 4，15000rpm，离心5分钟 吸去乙醇，立即加入甲酰胺25ul 室温，避光，溶解10分钟，-20保存,六、杂交与检测,外周血玻片准备 杂交体系准备 杂交 洗脱 结果观察,1、外周血玻片准备,75烤箱烘烤2小时 置于2SSC 中30min 依次放入70%，90%，100%酒精中各2min 室温干燥,2、杂交体系准备,在1.5mlEppendorf管中加入 20SSC 1.5ul BSA（1ug/ul） 1ul HumanCotI DNA （1mg/ml） 2ul 探针 3.75ul 甲酰胺 3.75ul 50%硫酸葡聚糖 3ul 总体积 15ul,3、杂交,PCR扩增仪开启，使温度达到80 滴加配好的杂交液15ul于杂交区 盖上盖玻片，封胶，PCR扩增仪80变性2min 将玻片置于湿盒，放入37杂交16小时以上,4、洗脱,杂交次日 70 0.4SSC/0.3%NP40 漂洗2min 室温 2SSC/0.1%NP40 漂洗 1min 室温2SSC 2min 室温70%，90%，100%酒精中脱水各2min 室温干燥 加20ul DAPI加到杂交区，盖上盖玻片，复染10min 荧光显微镜下观察结果,5、结果观察,观察镜下荧光杂交信号， 计数30个细胞和采集4张图像。,七、注意事项,玻片准备时要注意玻片的干净和透明度； 杂交过程中要保持湿润； 杂交必须对玻片变性温度进行摸索； 染色体制备分裂相