酶工程第五章酶、细胞、原生质体固定化.ppt

酶工程（Enzyme Engineering）,让工厂高效、安静、美丽如画的工程,工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生的电流来测血糖值。,强生稳豪倍易血糖仪,葡萄糖氧化酶电极,酶电极示意图 -D-葡萄糖O2 D-葡萄糖酸-1, 5-内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,第六章 酶、细胞、原生质体固定化,1. 酶（Enzyme）,Organic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 活细胞产生的，能在细胞内外起催化作用的生理活性物质。,知识点回顾,酶,（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,2. 酶的组成,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。,必需基团,3. 酶的活性中心（active center）,优点： 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性受到调节和控制,4. 酶的特性,缺点： 溶液酶很不稳定 增加分离的难度和费用 影响产品质量 回收困难，一次性使用,固定化技术固定化酶（immobilized enzyme）,有效改善方法之一 思路：设计一种方法，将酶束缚于特殊的相中，使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子交换。 效果：固定化的酶可像一般化学反应中的固体催化剂一样，既有酶催化特性，又有一般化学催化剂可回收、反复使用等优点，并可使生产工艺连续化、自动化。,酶工程原理和基本过程 菌种扩大培养发酵发酵酶液酶的提取 酶成品 原料 前处理 杀菌 酶反应器 反应液 产品提取 产品,酶的固定化,固定化酶发展历史,1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象（蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。 20世纪50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，分别制成固定化的胃蛋白酶、淀粉酶等。 1969年，千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中生产L-氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶（immobilized enzyme） 。 我国：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。,固定化酶发展历史,1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸。 20世纪70年代后期：固定化细胞技术 1982年，日本首次用固定化原生质体生产谷氨酸 近年来，随着纳米材料和磁性材料等新材料的出现，使固定化酶又成为研究热点，目前酶的固定化方法已超过200种。,本章主要内容,第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化,第一节 酶的固定化,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）,一、固定化酶的制备,1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定义 限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指借助物理或化学方法将酶固定于水不溶性载体，使得酶与整个流体分隔开，但仍能发挥催化效能的酶制剂形式。 制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。,优点,（1）提高酶稳定性 （2）可反复或连续使用；易于和反应产物分开；酶的使用效率提高，成本降低 （3）酶反应过程可严格控制 （4）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；增加产物收率，提高产物质量 （5）较游离酶更适合多酶反应,缺点,（1）固定化时酶活有损失 （2）增加了生产初始成本 （3）只能用于可溶底物且较小分子 （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应,2.固定化酶的特点,3. 固定化酶制备原则,（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）应有最小的空间位阻 （3）酶与载体必须结合牢固，稳定性好 （4）载体不与底物、产物或反应液发生化学反应 （5）成本要低，有利于生产自动化、连续化,4. 酶的固定化方法,载体结合法,交联法,包埋法,物理吸附,共价结合,离子结合,酶的固定化,脂质体,凝胶型,微囊型,热处理法,原理 ： 通过氢键、疏水作用和-电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶性载体上。 制备方法: a. 静态法 (static procedure) b. 电沉积法 (electrodeposition procedure) c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反应器装载法 (reactor loading process),载体结合法,（1）物理吸附法,常用载体,a. 无机吸附剂： 硅藻土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟基磷灰石、活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。,b. 有机吸附剂： 纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。,优点 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整； 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现； 酶失活后载体仍可再生。 缺点 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系； 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,物理吸附法固定化酶举例,原理：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 载体： 阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE) -纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 阳离子交换剂：如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、IR-200、Dowex-50等。,(2) 离子结合法,制备方法 在一定pH、温度、离子强度等条件下 将酶液与载体混和搅拌数小时 将酶液缓慢流过处理好的离子交换柱,优点： 操作简单，处理条件温和。 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。 吸附容量大。 缺点： 载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响。 离子强度高时，酶易脱落。,通过酶蛋白化学修饰来增加酶分子上电荷，能有效克服解吸附问题。 例：用水溶性乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE-纤维素和DEAE-Sephadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。 酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。 例：pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少。 载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附。,原理： 酶以共价键结合于载体上，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合。 酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键。,(3) 共价结合法,酶分子和载体连接的功能基团, 酶蛋白N-端的氨基或Lys残基的-氨基。 酶蛋白C-端的羧基、Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。 Cys残基的巯基。 Ser、 Thr 、 Tyr残基的羟基。 Phe和Tyr残基的苯环。 His残基的咪唑基。 Trp残基的吲哚基。 Arg残基的胍基。,被偶联的基团应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。,纤维素 琼脂糖胶 葡聚糖凝胶 甲壳质氨基酸共聚物 甲基丙烯醇共聚物,常用载体,芳香氨基 羟基 羟甲基 氨基,载体上的功能基团,酶分子上的非必需侧链基团,氨基 胍基 羧基 巯基 咪唑基 羟基,制备方法 载体上的功能基团与酶分子上的侧链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶联反应前，需先进行载体活化或接上双功能试剂，在载体上引进某种活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价结合。,双功能试剂（bifunctional reagent）,分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与其他分子上的基团发生共价结合而产生交联作用的试剂。 同型双功能试剂 异型双功能试剂,载体活化方法,1. 重氮法 2. 叠氮法 3. 溴化氰法 4. 烷基化法, 重氮法(diazatitation)： 适用于带芳香氨基载体。 载体先用亚硝酸盐处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。, 叠氮法（acylazide reaction）： 适用于带羟基、羧甲基载体，如CM-纤维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等。 以羧甲基纤维素为例，可在酸等作用下转变为叠氮衍生物，再与酶的氨基、羟基、酚羟基或巯基反应。, 溴化氰法（cyanogen bromide reaction）： 适用于带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等。 在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。, 烷基化法（alkylation reaction）： 适用于含羟基的载体。 碱性条件下和三氯均三嗪等反应，引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、羟基或巯基等偶联。,优点： 酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。 缺点： 载体需要活化，操作复杂； 反应条件苛刻，反应较为剧烈； 共价结合可能影响酶的空间构象，进而影响酶的催化活性或产生空间位阻效应。,共价偶联反应一般比较激烈，为了减少酶在偶联过程中失效，应采取怎样的保护措施？,共价偶联反应中的保护措施, 选择适宜的固定化方法与相应的载体。 严格控制反应条件，提高反应的专一性。 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。 如：在进行腺苷三磷酸酶(ATPase)固定化时，可先用对羟基汞苯甲酸(PHMB) 保护巯基，然后通过叠氮反应将酶偶联于羧甲基纤维素上，完成固定化后，再用还原剂使-SH活化，可得到高活性的固定化酶。,交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶 特点：共价键、不使用载体。 双功能试剂：戊二醛、己二胺等。,第一篇报道：戊二醛交联羧肽酶，得到一种分子间交联的固定化酶,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 （a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,共同点：均利用共价键结合 不同之处：交联法不使用载体,酶,优点: 结合牢固，可以长时间使用 缺点 因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大； 颗粒较小，使用不便,向酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程，酶活回收率和机械强度较交联酶法高。 用双功能试剂使惰性蛋白与酶共交联： 酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，或因得到的酶量有限时，以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等与酶一起进行交联。 解决方法2：降低交联剂浓度和缩短反应时间,解决方法1：酶与辅助蛋白交联,先使用明胶（蛋白质）包埋后，再用戊二醛交联； 先用尼龙（聚酰胺类）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交联。,解决方法3：与吸附法或包埋法联合使用,热处理法,将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到固定化菌体（死细胞） 适用：热稳定性好的酶 双重固定化：与交联法或其他固定化方法联用,原理：将聚合物单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 类型：主要有凝胶包埋、半透膜包埋、脂质体包埋。,包埋法,1. 凝胶包埋 (gel entrapment) 常用凝胶,天然胶：琼脂、海藻酸钙胶、角叉菜胶、明胶,合成胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂, 制备方法,以天然胶为载体（强度差）： 先将天然物溶于含水介质，然后再与酶液混和，最后使之胶化，制成胶包埋的固定化酶。 如：胶原可以添加丁醇；角叉菜胶可以添加KCl，然后冷却；海藻酸可添加CaCl2，使之以胶的形式沉淀下来。 以合成胶为载体（易失活）： 先将酶和丙烯酰胺单体分散于水介质中，然后加入N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的聚丙烯酰胺凝胶中。,海藻酸钠包埋胰蛋白酶步骤,凝胶孔径应小于酶分子直径，因而不适用于大分子底物或大分子产物的酶类的固定化,将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。 它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。同时，小分子底物能通过膜与酶作用，小分子产物经扩散而输出。,2. 半透膜包埋法 (microencapsulation),乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。,表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。,1,清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体。,微囊,酶液滴,例：尼龙膜界面聚合包埋,酶+己二胺(水) +庚二酰氯 (氯仿) 混合 乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合 形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶,原理：在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。 表面活性剂(surfactant)：具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。 该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。,表面活性剂乳化液膜法：,缺点：反应条件要求高，制备成本也较高。,微囊直径几微米几百微米，比表面积大，物质交换迅速 低分子底物可以自由通过并进入微囊内，与酶反应后的生成物被排除在微囊外 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内,优点:,将酶包埋于脂质体(Liposome)中 脂质体：具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。,3. 脂质体（Liposome）包埋法,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,用,微胶囊,各种固定化方法的优缺点比较,二、固定化酶的性质 影响酶催化活性的因素： 1. 构象改变和立体屏蔽 2. 分配效应和扩散限制效应,（1）酶的活力,一般下降 解决办法：考虑相应的固定化过程可能对酶的影响，避免损害酶的活性中心，有时在固定化反应体系中会加入抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。 例：乳糖酶的固定化就采用在其抑制剂葡萄糖-内酯存在下进行聚丙烯酰胺凝胶的包埋，如此可获得高活力的固定化乳糖酶。,（2）酶的稳定性,一般提高 原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形。 抑制酶的自身降解。 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。,对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度,A固定化酶,B游离酶,如：氨基酰化酶，70，15分钟，酶失去活性。 而固定化后， 70，15分钟，有80%活性。,对蛋白酶水解作用稳定性增强,对变性剂作用的稳定性提高,保藏稳定性和操作稳定性提高 天然胰凝乳蛋白酶在pH 4.1，4保存4个月，残留活力仅为原活力的2%。偶联于琼脂糖后，在同样条件下，却可保存82%的活力，有利于运输、贮存和重复使用。,（3）酶的最适温度,最适温度与酶稳定性有关：多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。,例：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高510；以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高515。,同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。 如：氨基酰化酶 用DEAE葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度(72)比游离酶的最适温度(60)提高12； 用DEAE纤维素固定化，其最适温度(67)比游离酶提高7； 用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶则有所降低。,（4）酶的最适pH值,酶固定化后，对底物 作用的最适pH和酶 pH曲线常发生偏移 原因：微